一种构建心房颤动小动物模型的方法及其应用

1.本发明属于医学动物实验领域，具体涉及一种构建心房颤动小动物模型的方法及其应用。


背景技术：

2.心房颤动也称之为房颤，是临床治疗中较为难治的心律失常之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升趋势。有研究报道显示55岁以上的人群房颤发病率显著升高。由于心房颤动发生的确切生理机制和病理机制尚未阐明，因此，通过心房颤动动物模型研究心房颤动机制对于房颤的治疗具有积极的意义。
3.目前，心房颤动动物模型主要在大动物（如羊、犬、兔等）进行，但此种动物模型多需要开胸置入起搏器、周期长、操作复杂费用高、造模的稳定性不好等不足。虽然基因工程房颤模型用小鼠作为造模动物，但是由于缺乏明确的致房颤基因，加上小鼠的心房过小不容易容纳多折返环等诸多原因，此方面的研究仍处于起始阶段。
4.药物诱导是构建心房颤动动物模型的主要方法之一，陈春林等以大鼠为建模动物，经尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液，建立了sd大鼠房颤模型（陈春林,巩甜甜,汤依群等.sd大鼠房颤模型的建立[j].实验动物科学,2009,26(3):1-4.）。钱程采用大鼠心房表面均匀播撒无菌性滑石粉的方法，建立了大鼠无菌性心包炎房颤模型（钱程.阻断trpv4抑制大鼠无菌性心包炎模型心房纤维化及心房颤动的发作[d].武汉:华中科技大学，2017.）。胡英英采用涂抹葡萄糖氯已定的方式建立了小鼠心房颤动模型（胡英英.bmsc通过il-10抑制葡萄糖酸氯己定诱导的小鼠心房颤动[d].武汉:华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科,2019.）。任佳梦采用小鼠皮下泵入血管紧张素ⅱ的方式构建了小鼠心房纤维化模型（任佳梦.小鼠心房纤维化模型mirna表达谱分析及mir-483-5p在纤维化中的作用及生物瓣置换术后合并房颤患者的预后分析[d].北京:北京协和医学院,2021.）。
[0005]
但是，上述药物诱导方法存在以下缺陷：一、乙酰胆碱-氯化钙模型代表的是自主神经介导的自发性心房颤动模型，此种模型与临床中最常见的心房纤维化颤动模型不同，在临床中占比很小，因此并不具有很好的代表性。
[0006]
二、采用无菌性滑石粉、葡萄糖氯已定或血管紧张素ⅱ建立动物模型时，均需要对动物进行创伤手术，容易引起模型动物的死亡，建模操作难度大，成本高。


技术实现要素：

[0007]
为了解决上述的技术问题，减少创伤手术对建模动物的伤害，降低建模操作的技术难度和建模成本，使得动物模型更适用于临床研究和应用。发明人在长期动物模型构建研究的基础上，首次发现地塞米松诱导的肌萎缩动物模型可出现心房颤动现象，从而将其引用到构建心房颤动动物模型方面的研究中。本发明提供了以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种构建心房颤动小动物模型的方法，其包括：
在动物模型构建周期内，每天对所述小动物腹腔注射地塞米松，建模周期结束，得到所述的动物模型。
[0008]
优选地，所述地塞米松的注射剂量为0.5-3.0 mg/kg/天，进一步优选为0.5-2.0 mg/kg/天，例如0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1.0 mg/kg、1.25 mg/kg、1.5 mg/kg、1.75 mg/kg、2.0 mg/kg。
[0009]
优选地，所述的动物模型构建周期为10-20天，进一步优选为10-17天，更优选为10-14天，例如：10天、11天、12天、13天、14天。
[0010]
在本发明的一个具体实施方式中，在建模开始前，需要对小动物进行体重、心电图、四肢肌力和/或房颤易感性测试，从而从大量动物中选择足够数量的动物以满足构建模型的造模组、对照组的需要。
[0011]
在本发明的另一个具体实施例中，构建动物模型的过程还包括在建模结束后对造模组小动物及对照组小动物进行体重、心电图、四肢肌力和/或房颤易感性的检测。当造模组小动物与对照组小动物之间的检测结果呈现显著性差异时，所述动物模型构建成功。
[0012]
在上述的各个技术方案中，所述小动物选自鼠类。
[0013]
优选地，所述小动物选自大鼠或小鼠。
[0014]
进一步优选地，所述大鼠选自wistar大鼠或sd大鼠，更优选为sd大鼠。
[0015]
进一步优选地，所述小鼠选自km小鼠、icr小鼠、nih小鼠、crem-ibδc-x 转基因小鼠、c57/b6小鼠或c57bl/6n小鼠。
[0016]
第二方面，本发明提供一种心房颤动小动物模型，其采用第一方面的小动物模型构建方法建立而成。
[0017]
第三方面，本发明提供第一方面的心房颤动小动物模型构建方法的应用。
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优选地，所述的应用可以是与心房颤动相关的动物模型的建立。
[0019]
进一步优选地，所述动物模型采用的动物可以是大型动物（如羊、犬、兔、猪等），也可以是小型动物（如大鼠、小鼠）。
[0020]
本发明的有益效果：一、本发明采用地塞米松诱导构建了一种心房颤动小动物模型，该模型代表了临床中最常见的心房颤动类型，相较于自发性心房颤动模型，研究和应用的范围更广。
[0021]
二、本发明采用腹腔注射的方式，对于小动物的伤害更小，相较于尾静脉注射，操作技术难度低，造模成功率更高。
[0022]
三、本发明采用的地塞米松约为0.8元/毫克，相较于乙酰胆碱-氯化钙约25.3元/毫克，造模成本更低，经济效益更高。
附图说明
[0023]
图1所示为小鼠动物模型构建流程；图2所示为建模前小鼠的体重、前肢握力、房颤诱发率及平均房颤持续时长的统计学分析结果；图2中的a代表小鼠的体重、b代表小鼠的前肢握力、c代表小鼠的房颤诱发率、d代表小鼠的平均房颤持续时长；图3所示为建模后小鼠的体重、前肢握力、房颤诱发率及平均房颤持续时长的统计
学分析结果；图3中的a代表小鼠的体重、b代表小鼠的前肢握力、c代表小鼠的房颤诱发率、d代表小鼠的平均房颤持续时长；图4所示建模后小鼠的masson染色、α-sma蛋白印迹、纤维化区域占比及α-sma相对表达量分析结果；图4中的a代表小鼠的masson染色、b代表小鼠的α-sma蛋白印迹、c代表小鼠的纤维化区域占比、d代表小鼠的α-sma相对表达量。
具体实施方式
[0024]
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0025]
需要说明的是，本发明中采用的试剂及实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试剂和实验方法。
[0026]
本发明中采用的实验材料、试剂、厂家如下：c57/b6小鼠：购自北京灵赋生物科技有限公司，遗传背景与jax c57bl/6j（https://www.jax.org/strain/000664）完全一致，并会定期进行遗传稳定性检测。
[0027]
地塞米松磷酸钠注射液：购自山西省芮城科龙兽药有限公司，货号2019103014，获得gmp兽药认证（批准文号：153931563）。
[0028]
实施例1 小鼠心房颤动模型的构建。
[0029]
按照图1所示的构建流程构建小鼠动物模型，具体动物模型构建过程如下：1.1、c57/b6小鼠的适应性饲养将雄性8周龄c57/b6小鼠14只（体重20.39g
±
1.06g），随机分成造模组和对照组，每组7只。然后将小鼠编号，其中造模组小鼠编号为1-7，对照组小鼠编号为8-14。再对所有小鼠进行基线（如体重、前肢握力、房颤易感性、平均房颤持续时长）测试，测试结果见（表1、表2和图2）。
[0030][0031]
对表1数据分析后，可以看出造模组小鼠的平均体重为20.81 g，造模组小鼠的平均前肢握力为0.9 n；而对照组小鼠的平均体重为19.96 g，对照组小鼠的平均前肢握力为0.86 n。将造模组和对照组的基线测试结果进行比较，可以看出两组小鼠的基线数据（体重、前肢握力）差异不明显，两组小鼠符合建模实验的要求。
[0032][0033]
对表2数据分析后，可以看出造模组小鼠中仅有5号小鼠表现出房颤性状，且房颤最长持续时间为21.02 s；而对照组小鼠中仅有8号和14号小鼠表现出房颤性状，且房颤最长持续时间分别为9.24 s和1.29 s。将造模组和对照组的基线测试结果进行比较，可以看出两组小鼠的基线数据（房颤易感性、平均房颤持续时长）差异不明显，两组小鼠符合建模实验的要求。
[0034]
另外，由图2可以看出，在构建模型前，造模组小鼠体重为20.81
±ꢀ
0.58 g，对照组小鼠的体重为19.96
±ꢀ
1.30 g；造模组小鼠和对照组小鼠的体重差异不显著（p=0.14，且p＞0.05）；造模组小鼠的前肢握力为0.90
ꢀ±ꢀ
0.10 n，对照组小鼠的前肢握力为0.86
ꢀ±ꢀ
0.09 n，造模组小鼠和对照组小鼠的前肢握力差异不显著（p=0.42，且p＞0.05）；造模组小鼠的房颤诱发率为1/7，对照组小鼠的房颤诱发率为2/7，造模组小鼠和对照组小鼠的房颤诱发率差异不显著（p＞0.99，且p＞0.05）；造模组小鼠的平均房颤持续时长为21.02 s，对照组小鼠的平均房颤持续时长为9.24 s，造模组小鼠和对照组小鼠的平均房颤持续时长差异不显著（p＞0.99，且p＞0.05）。图2的结果说明两组小鼠符合建模实验的要求。
[0035]
1.2、c57/b6小鼠心房颤动模型的构建造模组小鼠每天腹腔注射地塞米松0.5-2.0 mg/kg，持续10-14天；对照组小鼠予以相同体积的生理盐水。药物注射结束后获得c57/b6小鼠心房颤动模型。
[0036]
1.3、c57/b6小鼠模型的鉴定1.3.1、药物注射结束后测量对照组小鼠与造模组小鼠的体重、前肢握力、房颤易
感性及平均房颤持续时长。统计测量数据，结果见表3、表4和图3。
[0037][0038]
对表3数据分析后，可以看出造模组小鼠的平均体重为19.32 g，造模组小鼠的平均前肢握力为0.93 n；而对照组小鼠的平均体重为24.30 g，对照组小鼠的平均前肢握力为1.33 n。将造模组和对照组的测试结果进行比较，可以看出造模组小鼠的体重低于对照组小鼠的体重，造模组小鼠的体重比对照组小鼠的体重轻20.49%；造模组小鼠的前肢握力低于对照组小鼠的前肢握力，造模组小鼠的前肢握力比对照组小鼠的前肢握力低30.08%。表3的结果说明，经过地塞米松处理后，造模组小鼠和对照组小鼠之间的体重和前肢握力差异明显。采用地塞米松能够有效地构建小鼠心房颤动模型。
[0039][0040]
对表4数据分析后，可以看出造模组小鼠中仅有2号、4号小鼠未表现出房颤性状，其余小鼠均表现出房颤性状，且1号、3号、5号、6号、7号小鼠的房颤最长持续时间分别为2.17 s、56.54 s、20.13 s、4.25 s、18.22 s，3号小鼠的房颤最长持续时间甚至达到56.54 s；而对照组小鼠中均未表现出房颤性状。将造模组和对照组的测试结果进行比较，可以看出造模组小鼠的房颤性状明显，特别是5号小鼠经过地塞米松处理后表现出房颤性状。而且造模组小鼠的房颤持续时间长。对照组小鼠的房颤性状不明显，特别是8号小鼠和14号小鼠，建模前的房颤性状消失。表4的结果说明，经过地塞米松处理后，造模组小鼠和对照组小鼠之间的房颤性状和房颤持续时间差异明显。采用地塞米松能够有效地构建小鼠心房颤动模型。
[0041]
另外，由图3可以看出，在构建模型完成后，造模组小鼠体重为19.32
±ꢀ
0.76 g，对照组小鼠的体重为24.31
±ꢀ
0.64 g；造模组小鼠和对照组小鼠的体重差异显著（p＜0.05）；造模组小鼠前肢握力为0.94
ꢀ±ꢀ
0.05 n，对照组小鼠的前肢握力为1.33
ꢀ±ꢀ
0.12 n，造模组小鼠和对照组小鼠的前肢握力差异显著（p＜0.05）；造模组小鼠的房颤诱发率为5/7，对照组小鼠的房颤诱发率为0，造模组小鼠和对照组小鼠的房颤诱发率差异显著（p＜0.05）；造模组小鼠的平均房颤持续时长为14.47 s，对照组小鼠的平均房颤持续时长为0.00 s，造模组小鼠和对照组小鼠的平均房颤持续时长差异显著（p＜0.05）。图3的结果说明，在腹腔注射地塞米松造模后，造模组小鼠的体重和前肢握力显著小于对照组；造模组小鼠的房颤
诱发率和平均房颤持续时长显著高于对照组，采用地塞米松能够有效地构建小鼠心房颤动模型。
[0042]
1.3.2、测量完成后取造模组和对照组小鼠的心房组织进行纤维化染色（masson染色）、分析纤维化区域占比及纤维化相关蛋白（α-sma）蛋白印迹实验。结果见图4。
[0043]
由图4可以看出，在构建模型完成后，造模组小鼠心肌细胞（图a中红色区域）的纤维化（图a中蓝色区域）明显，且纤维化组织占比大，而对照组小鼠心肌细胞纤维化不明显，且纤维化组织占比小；造模组小鼠的心房纤维化区域占比为13.3%，而对照组小鼠的心房纤维化区域占比为10.7%（见图c），造模组小鼠的心房纤维化区域显著高于对照组小鼠的心房纤维化区域（p＜0.05）；造模组小鼠和对照组小鼠的心房组织纤维化相关蛋白的蛋白印迹结果显示，造模组小鼠心房组织中α-sma表达量显著高于对照组小鼠心房组织中α-sma的表达量（见图b和图d，p＜0.05）。图4的结果说明，相较于对照组小鼠，在腹腔注射地塞米松造模后，造模组小鼠的心房组织纤维化明显，采用地塞米松能够有效地构建小鼠心房颤动模型。
[0044]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种构建心房颤动小动物模型的方法，其特征在于：所述方法包括：在动物模型构建周期内，每天对所述小动物腹腔注射地塞米松，建模周期结束，得到所述的动物模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述地塞米松的注射剂量为0.5-2.0 mg/kg/天。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的构建周期为10-20天。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模开始前对所述小动物进行体重、心电图、四肢肌力和/或房颤易感性测试。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模结束后对造模组小动物及对照组小动物进行体重、心电图、四肢肌力和/或房颤易感性的检测；当造模组小动物与对照组小动物之间的检测结果呈现显著性差异时，所述动物模型构建成功。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述小动物选自小鼠或大鼠。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述小鼠选自c57/b6小鼠、km小鼠、icr小鼠、nih小鼠。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述小鼠为c57/b6小鼠。9.权利要求1至8中任一项所述的方法在构建心房颤动动物模型中的应用。10.一种心房颤动动物模型，其特征在于：所述动物模型采用权利要求1至8中任一项所述的方法构建而成。

技术总结
本发明公开了一种构建心房颤动小动物模型的方法，该方法包括在动物模型构建周期内，每天对所述小动物腹腔注射地塞米松，建模周期结束，得到所述的动物模型。本发明的心房颤动小动物模型代表了临床中最常见的心房颤动类型，相较于自发性心房颤动模型，研究和应用的范围更广；相较于尾静脉注射，本发明的腹腔注射对于小动物的伤害更小，操作技术难度低，造模成功率更高；本发明构建动物模型的成本更低，经济效益更高。经济效益更高。经济效益更高。


技术研发人员：高远 李晓瑶 孙奇 裴建秋 王娟 王婧金 于易通 杨琳梅 张澍
受保护的技术使用者：中国医学科学院阜外医院
技术研发日：2023.09.14
技术公布日：2023/10/20