一种发酵法生产丁二酸的方法与流程

1.本发明涉及一种发酵法生产丁二酸的方法，属于生物发酵技术领域。


背景技术：

2.丁二酸，又称琥珀酸，是一种重要的“c4平台化合物”，广泛应用于食品、医药、农业领域，可作为合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、n-甲基吡咯烷酮及可降解生物高分子材料聚丁二酸丁二醇酯等的原料，具有广泛的应用前景。近年来，随着丁二酸新的应用领域的不断开拓，国际市场对于丁二酸的需求量猛增。传统的丁二酸生产方法主要为石化合成法，这种化学合成法生产丁二酸是以不可再生的战略资源石油作为原料，成本高，环境污染严重，对于石油依赖性强，无法实现可持续发展，严重阻碍了丁二酸的发展潜力。在石油资源日益枯竭的今天，发展环境友好的绿色生物技术已经成为一种趋势，因此，微生物发酵法生产丁二酸越来越引起人们的兴趣。生物法制备丁二酸的过程中，温室气体co2可以作为原料之一，被微生物利用，从而能够减少温室气体的排放。由此可见，开发高效的生物合成丁二酸的方法具有非常重要的社会和环境效益。纤维素是地球上数量最大的可再生资源，农作物秸秆纤维是其最重要的组成部分之一。若利用可再生农作物秸秆进行规模化制备丁二酸，不仅摆脱了对石化原料的依赖，提供了农作物秸秆的新用途，更开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，将托起一个全新的碳四化合物开发利用绿色平台。玉米秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素及木质素，是一种潜在的廉价生物质资源，目前我国玉米秸秆利用率还有较大提升空间。玉米秸秆水解可转化为葡萄糖、木糖等混合糖，目前一些高产丁二酸的菌株，可以利用葡萄糖、木糖等作为碳源，用于厌氧发酵制备丁二酸，所以玉米秸秆水解结合厌氧发酵制备丁二酸是一条低成本制备丁二酸的工业化路径。
3.中国专利cn102796773a公开了一种丁二酸的制备方法。所述制备方法包括：a）提供含有纤维素的生物质；b）对所述生物质进行水解以得到含有纤维二糖的水解液；和c）以所述水解液作为碳源，利用丁二酸生产菌发酵得到丁二酸。根据本发明实施例的丁二酸的制备方法不仅可以降低丁二酸的生产成本，而且可以有效地利用生物质资源。该专利中丁二酸的产率最高才到66.4%，并不算高，另外丁二酸的浓度也比较低，这对后续提纯造成很大不便。
4.中国专利cn101608192 a公开了一种利用玉米芯生产丁二酸的方法，其包括如下步骤：先将玉米芯在体积百分浓度0.1～10％的硫酸溶液中进行水解得酸解液，水解温度为40～250℃，水解时间5～600分钟；然后酸解液固液分离，获得富含木糖的第一糖液和玉米芯酸解渣；再用纤维素酶、木聚糖酶或纤维二糖酶中的一种或多种，对玉米芯酸解渣进行酶水解，得酶解液；酶解液固液分离得到富含葡萄糖的第二糖液和富含木质素的酶解渣；最后对第一糖液、第二糖液或第一糖液的母液中的一种或多种，采用丁二酸生产菌株进行发酵，在ph5.0～7.0，温度30～40℃，发酵40～80h，得到含丁二酸的发酵成熟醪液。该专利中丁二酸的收率非常低，这难以降低丁二酸的生产成本。
5.以上可以看到，目前利用玉米秸秆等生物质原料通过发酵法生产丁二酸的方法仍
存在产率低成本高的问题，因此利用玉米秸秆开发一种高产率低成本的发酵法来生产丁二酸对推动丁二酸的产业化发展具有非常重要的现实意义。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术存在的不足，本发明提供一种发酵法生产丁二酸的方法，实现以下发明目的：利用玉米秸秆，高产率低成本的发酵制备出丁二酸。
7.为实现上述发明目的，本发明采取以下技术方案：一种发酵法生产丁二酸的方法，所述发酵法生产丁二酸的方法包括蒸汽爆破、酶解、脱毒、菌种培养、发酵、后处理6个步骤；以下是对上述技术方案的进一步改进：步骤1、蒸汽爆破将玉米秸秆破碎成10~50目的颗粒物，然后把玉米秸秆颗粒物送入蒸汽爆破设备，在2.5~4mpa、120~150℃下保压爆破160~230秒后得到爆破后的玉米秸秆，再将爆破后的玉米秸秆置于70~90℃下烘干至恒重后得到玉米秸秆爆破物。
8.步骤2、酶解将玉米秸秆爆破物和蒸馏水按质量比1:6~9加入到反应釜中，在300~500转/分搅拌速率下，加入氢氧化钠水溶液将ph调节至4.5~5.5，然后加入纤维素酶和木聚糖酶，控制温度40~50℃、搅拌速率130~180转/分下酶解反应130~165小时，酶解反应期间每隔13~16小时补加1次玉米秸秆爆破物并补加1次纤维素酶和木聚糖酶，共补加4~6次，酶解反应完成后，过滤并收集滤液，得到酶解液；所述氢氧化钠水溶液的浓度为9~12mmol/l；所述加入纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加18~25fpu纤维素酶，木聚糖酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加170~240u木聚糖酶；所述补加1次玉米秸秆爆破物，玉米秸秆爆破物的补加量为蒸馏水质量的1/9~1/6；所述补加1次纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加18~25fpu纤维素酶，木聚糖酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加170~240u木聚糖酶。
9.步骤3、脱毒将酶解液、海泡石、氢氧化镁按质量比50~90:12~25:3~10投入反应釜中，在搅拌速率300~650转/分下持续搅拌2~5小时后，停止搅拌，静置48~76小时后，过滤，收集滤液得到脱毒酶解液；所述海泡石的粒径为0.5~7μm，比表面积为260~430m2/g。
10.步骤4、菌种培养将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱中提前充入氮气、二氧化碳和氢气的混合气，控制温度30~40℃，活化培养25~50小时，得到活化菌种，然后将活化菌种接入含有种子培养基的器皿中，往器皿中充入氮气和二氧化碳的混合气，把器皿置于摇床设备上，控制摇床转速100~220转/分，培养19~24小时，得到种子菌株；所述菌株为琥珀酸放线杆菌；
所述斜面培养基和种子培养基的组成均为：8~12份葡萄糖、4~7份酵母膏、9~13份nahco3、8~11份nah2po4·
2h2o、12~16份k2hpo4·
3h2o、20~24份琼脂；所述斜面培养基和种子培养基的ph均为6.5~7.0，使用前均需要在120~140℃下灭菌13~20min；所述氮气、二氧化碳和氢气的混合气中，氮气、二氧化碳和氢气三者的体积比为6~14:70~90:1~4；所述氮气和二氧化碳的混合气中，氮气和二氧化碳的体积比为3~8:75~100。
11.步骤5、发酵往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度36~42℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为5~9:80~110，在搅拌速率150~370转/分下，发酵40~54小时，发酵过程中，持续添加碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，控制发酵液的ph值为6.0~7.2，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：30~52份脱毒酶解液、9~17份酵母膏、5~9份nahco3、6~12份nah2po4·
2h2o、10~19份k2hpo4·
3h2o、9~15份琼脂；所述碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，其组成为：碱式碳酸铋和偏铝酸钠二者的质量比1:1~4；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的4~9%。
12.步骤6、后处理将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液经过h-型强酸性阳离子交换树脂，收集离子交换后的液体，减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至1~5℃，在1~5℃温度下静置30~48小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
13.与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：1、本发明用比表面积巨大的海泡石以及弱碱氢氧化镁，对酶解液进行脱毒，海泡石和氢氧化镁两者的组合能够有效去除蒸汽爆破和酶解环节中生成的醛类物质，防止后续发酵过程中琥珀酸放线杆菌的中毒问题，进而能够高产率的得到丁二酸；2、本发明用碱式碳酸铋和偏铝酸钠两种物质来调节发酵过程的ph，二者具有非常好的协调作用，最终的测试数据显示，二者混合添加能够有效控制发酵液的ph值，保证最终丁二酸的高产率；3、本发明利用发酵法生产丁二酸的方法，所得发酵成熟醪液中残糖0.44~0.53g/l，丁二酸含量为70.92~73.56 g/l，丁二酸产率为69.1~71.5%。
具体实施方式
14.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
15.实施例1： 一种发酵法生产丁二酸的方法步骤1、蒸汽爆破将玉米秸秆破碎成40目的颗粒物，然后把玉米秸秆颗粒物送入蒸汽爆破设备，在3mpa、140℃下保压爆破210秒后得到爆破后的玉米秸秆，再将爆破后的玉米秸秆置于85℃
下烘干至恒重后得到玉米秸秆爆破物。
16.步骤2、酶解将玉米秸秆爆破物和蒸馏水按质量比1:8加入到反应釜中，在450转/分搅拌速率下，加入氢氧化钠水溶液将ph调节至5.3，然后加入纤维素酶和木聚糖酶，控制温度46℃、搅拌速率160转/分下酶解反应150小时，酶解反应期间每隔15小时补加1次玉米秸秆爆破物并补加1次纤维素酶和木聚糖酶，共补加5次，酶解反应完成后，过滤并收集滤液，得到酶解液；所述氢氧化钠水溶液的浓度为11mmol/l；所述加入纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加22fpu纤维素酶，木聚糖酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加210u木聚糖酶；所述补加1次玉米秸秆爆破物，玉米秸秆爆破物的补加量为蒸馏水质量的1/7；所述补加1次纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加22fpu纤维素酶，木聚糖酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加210u木聚糖酶。
17.步骤3、脱毒将酶解液、海泡石、氢氧化镁按质量比70:19:8投入反应釜中，在搅拌速率500转/分下持续搅拌4小时后，停止搅拌，静置60小时后，过滤，收集滤液得到脱毒酶解液；所述海泡石的粒径为5μm，比表面积为340m2/g。
18.步骤4、菌种培养将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱中提前充入氮气、二氧化碳和氢气的混合气，控制温度37℃，活化培养35小时，得到活化菌种，然后将活化菌种接入含有种子培养基的器皿中，往器皿中充入氮气和二氧化碳的混合气，把器皿置于摇床设备上，控制摇床转速180转/分，培养21小时，得到种子菌株；所述菌株为琥珀酸放线杆菌；所述斜面培养基和种子培养基的组成均为：11份葡萄糖、6份酵母膏、12份nahco3、9份nah2po4·
2h2o、15份k2hpo4·
3h2o、23份琼脂；所述斜面培养基和种子培养基的ph均为6.8，使用前均需要在135℃下灭菌16min；所述氮气、二氧化碳和氢气的混合气中，氮气、二氧化碳和氢气三者的体积比为11:82:3；所述氮气和二氧化碳的混合气中，氮气和二氧化碳的体积比为6:90。
19.步骤5、发酵往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度40℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为8:105，在搅拌速率340转/分下，发酵49小时，发酵过程中，持续添加碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，控制发酵液的ph值为6.7，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：45份脱毒酶解液、14份酵母膏、8份nahco3、10份nah2po4·
2h2o、16份k2hpo4·
3h2o、12份琼脂；所述碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，其组成为：碱式碳酸铋和偏铝酸钠二者的质量比1:3；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的8%。
20.步骤6、后处理将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液经过h-型强酸性阳离子交换树脂，收集离子交换后的液体，减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至4℃，在4℃温度下静置42小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
21.实施例2： 一种发酵法生产丁二酸的方法步骤1、蒸汽爆破将玉米秸秆破碎成10目的颗粒物，然后把玉米秸秆颗粒物送入蒸汽爆破设备，在2.5mpa、120℃下保压爆破160秒后得到爆破后的玉米秸秆，再将爆破后的玉米秸秆置于70℃下烘干至恒重后得到玉米秸秆爆破物。
22.步骤2、酶解将玉米秸秆爆破物和蒸馏水按质量比1:6加入到反应釜中，在300转/分搅拌速率下，加入氢氧化钠水溶液将ph调节至4.5，然后加入纤维素酶和木聚糖酶，控制温度40℃、搅拌速率130转/分下酶解反应130小时，酶解反应期间每隔13小时补加1次玉米秸秆爆破物并补加1次纤维素酶和木聚糖酶，共补加4次，酶解反应完成后，过滤并收集滤液，得到酶解液；所述氢氧化钠水溶液的浓度为9mmol/l；所述加入纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加18fpu纤维素酶，木聚糖酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加170u木聚糖酶；所述补加1次玉米秸秆爆破物，玉米秸秆爆破物的补加量为蒸馏水质量的1/9；所述补加1次纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加18fpu纤维素酶，木聚糖酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加170u木聚糖酶。
23.步骤3、脱毒将酶解液、海泡石、氢氧化镁按质量比50:12:3投入反应釜中，在搅拌速率300转/分下持续搅拌2小时后，停止搅拌，静置48小时后，过滤，收集滤液得到脱毒酶解液；所述海泡石的粒径为0.5μm，比表面积为260m2/g。
24.步骤4、菌种培养将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱中提前充入氮气、二氧化碳和氢气的混合气，控制温度30℃，活化培养25小时，得到活化菌种，然后将活化菌种接入含有种子培养基的器皿中，往器皿中充入氮气和二氧化碳的混合气，把器皿置于摇床设备上，控制摇床转速100转/分，培养19小时，得到种子菌株；所述斜面培养基和种子培养基的组成均为为：8份葡萄糖、4份酵母膏、9份nahco3、8份nah2po4·
2h2o、12份k2hpo4·
3h2o、20份琼脂；所述斜面培养基和种子培养基的ph均为6.5，使用前均需要在120℃下灭菌13min；所述菌株为琥珀酸放线杆菌；所述氮气、二氧化碳和氢气的混合气中，氮气、二氧化碳和氢气三者的体积比为6:70:1；所述氮气和二氧化碳的混合气中，氮气和二氧化碳的体积比为3:75。
25.步骤5、发酵
往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度36℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为5:80，在搅拌速率150转/分下，发酵40小时，发酵过程中，持续添加碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，控制发酵液的ph值为6.0，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：30份脱毒酶解液、9份酵母膏、5份nahco3、6份nah2po4·
2h2o、10份k2hpo4·
3h2o、9份琼脂；所述碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，其组成为：碱式碳酸铋和偏铝酸钠二者的质量比1:1；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的4%。
26.步骤6、后处理将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液经过h-型强酸性阳离子交换树脂，收集离子交换后的液体，减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至1℃，在1℃温度下静置30小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
27.实施例3： 一种发酵法生产丁二酸的方法步骤1、蒸汽爆破将玉米秸秆破碎成50目的颗粒物，然后把玉米秸秆颗粒物送入蒸汽爆破设备，在4mpa、150℃下保压爆破230秒后得到爆破后的玉米秸秆，再将爆破后的玉米秸秆置于90℃下烘干至恒重后得到玉米秸秆爆破物。
28.步骤2、酶解将玉米秸秆爆破物和蒸馏水按质量比1:9加入到反应釜中，在500转/分搅拌速率下，加入氢氧化钠水溶液将ph调节至5.5，然后加入纤维素酶和木聚糖酶，控制温度50℃、搅拌速率180转/分下酶解反应165小时，酶解反应期间每隔16小时补加1次玉米秸秆爆破物并补加1次纤维素酶和木聚糖酶，共补加6次，酶解反应完成后，过滤并收集滤液，得到酶解液；所述氢氧化钠水溶液的浓度为12mmol/l；所述加入纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加25fpu纤维素酶，木聚糖酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加240u木聚糖酶；所述补加1次玉米秸秆爆破物，玉米秸秆爆破物的补加量为蒸馏水质量的1/6；所述补加1次纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加25fpu纤维素酶，木聚糖酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加240u木聚糖酶。
29.步骤3、脱毒将酶解液、海泡石、氢氧化镁按质量比90:25: 10投入反应釜中，在搅拌速率650转/分下持续搅拌5小时后，停止搅拌，静置76小时后，过滤，收集滤液得到脱毒酶解液；所述海泡石的粒径为7μm，比表面积为430m2/g。
30.步骤4、菌种培养将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱中提前充入氮气、二氧化碳和氢气的混合气，控制温度40℃，活化培养50小时，得到活化菌种，然后将活化菌种接入含有种子培养基的器皿中，往器皿中充入氮气和二氧化碳的混合气，把器皿
置于摇床设备上，控制摇床转速220转/分，培养24小时，得到种子菌株；所述斜面培养基和种子培养基的组成均为：12份葡萄糖、7份酵母膏、13份nahco3、11份nah2po4·
2h2o、16份k2hpo4·
3h2o、24份琼脂；所述斜面培养基和种子培养基的ph均为7.0，使用前均需要在140℃下灭菌20min；所述菌株为琥珀酸放线杆菌；所述氮气、二氧化碳和氢气的混合气中，氮气、二氧化碳和氢气三者的体积比为14:90:4；所述氮气和二氧化碳的混合气中，氮气和二氧化碳的体积比为8:100。
31.步骤5、发酵往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度42℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为9:110，在搅拌速率370转/分下，发酵54小时，发酵过程中，持续添加碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，控制发酵液的ph值为7.2，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：52份脱毒酶解液、17份酵母膏、9份nahco3、12份nah2po4·
2h2o、19份k2hpo4·
3h2o、15份琼脂；所述碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，其组成为：碱式碳酸铋和偏铝酸钠二者的质量比1:4；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的9%。
32.步骤6、后处理将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液经过h-型强酸性阳离子交换树脂，收集离子交换后的液体，减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至5℃，在5℃温度下静置48小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
33.对比例1：实施例1基础上，不进行步骤3、脱毒，具体操作如下：步骤1、2操作同于实施例1；不进行步骤3；步骤4操作同于实施例1；步骤5、发酵往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度40℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为8:105，在搅拌速率340转/分下，发酵49小时，发酵过程中，持续添加碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，控制发酵液的ph值为6.7，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：45份酶解液、14份酵母膏、8份nahco3、10份nah2po4·
2h2o、16份k2hpo4·
3h2o、12份琼脂；所述碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，其组成为：碱式碳酸铋和偏铝酸钠二者的质量比1:3；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的8%；步骤6操作同于实施例1。
34.对比例2：实施例1基础上，步骤5、发酵中，不加入碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合
物，具体操作如下：步骤1、2、3、4操作同于实施例1；步骤5、发酵往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度40℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为8:105，在搅拌速率340转/分下，发酵49小时，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：45份脱毒酶解液、14份酵母膏、8份nahco3、10份nah2po4·
2h2o、16份k2hpo4·
3h2o、12份琼脂；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的8%；步骤6操作同于实施例1。
35.对比例3：实施例1基础上，步骤5、发酵中，不加入碱式碳酸铋，仅加入偏铝酸钠调节ph，具体操作如下：步骤1、2、3、4操作同于实施例1；步骤5、发酵往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度40℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为8:105，在搅拌速率340转/分下，发酵49小时，发酵过程中，持续添加偏铝酸钠，控制发酵液的ph值为6.7，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：45份脱毒酶解液、14份酵母膏、8份nahco3、10份nah2po4·
2h2o、16份k2hpo4·
3h2o、12份琼脂；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的8%；步骤6操作同于实施例1。
36.对比例4：实施例1基础上，步骤5、发酵中，不加入偏铝酸钠，仅加入碱式碳酸铋调节ph，具体操作如下：步骤1、2、3、4操作同于实施例1；步骤5、发酵往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度40℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为8:105，在搅拌速率340转/分下，发酵49小时，发酵过程中，持续添加碱式碳酸铋，控制发酵液的ph值为6.7，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述发酵培养基的组成为：45份脱毒酶解液、14份酵母膏、8份nahco3、10份nah2po4·
2h2o、16份k2hpo4·
3h2o、12份琼脂；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的8%；步骤6操作同于实施例1。
37.发酵结果对比：对实施例1、2、3和对比例1、2、3、4得到发酵成熟醪液，测试其中的残糖量和丁二酸含量，并依据最终得到的丁二酸成品量来计算丁二酸的产率，具体结果见下面表1；表1残糖（g/l）丁二酸含量（g/l）丁二酸产率（%）实施例10.4473.5670.6实施例20.5171.4371.5
实施例30.5370.9269.1对比例143.5931.4633.7对比例246.8227.7829.6对比例335.9340.6937.3对比例438.7137.4835.2从表1中的数据可以看到，不进行脱毒步骤的对比例1残糖含量大幅增加，丁二酸含量和产率大幅降低，这表明脱毒步骤对后续发酵过程有着至关重要的影响；对比例2，不加入碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，发酵过程的ph无法调控，导致丁二酸含量和产率降至最低；不加碱式碳酸铋的对比例3和不加偏铝酸钠的对比例4，二者残糖量相近，丁二酸的含量和产率也比较相近，可见二者对ph的调控有着紧密的协调作用，缺一不可。
38.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种发酵法生产丁二酸的方法，其特征在于：所述发酵法生产丁二酸的方法包括蒸汽爆破、酶解、脱毒、菌种培养、发酵、后处理6个步骤；所述蒸汽爆破，其方法为：将玉米秸秆破碎成10~50目的颗粒物，然后把玉米秸秆颗粒物送入蒸汽爆破设备，在2.5~4mpa、120~150℃下保压爆破160~230秒后得到爆破后的玉米秸秆，再将爆破后的玉米秸秆置于70~90℃下烘干至恒重后得到玉米秸秆爆破物；所述酶解，其方法为：将玉米秸秆爆破物和蒸馏水按质量比1:6~9加入到反应釜中，在300~500转/分搅拌速率下，加入氢氧化钠水溶液将ph调节至4.5~5.5，然后加入纤维素酶和木聚糖酶，控制温度40~50℃、搅拌速率130~180转/分下酶解反应130~165小时，酶解反应期间每隔13~16小时补加1次玉米秸秆爆破物并补加1次纤维素酶和木聚糖酶，共补加4~6次，酶解反应完成后，过滤并收集滤液，得到酶解液；所述脱毒，其方法为：将酶解液、海泡石、氢氧化镁按质量比50~90:12~25:3~10投入反应釜中，在搅拌速率300~650转/分下持续搅拌2~5小时后，停止搅拌，静置48~76小时后，过滤，收集滤液得到脱毒酶解液；所述菌种培养，其方法为：将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱中提前充入氮气、二氧化碳和氢气的混合气，控制温度30~40℃，活化培养25~50小时，得到活化菌种，然后将活化菌种接入含有种子培养基的器皿中，往器皿中充入氮气和二氧化碳的混合气，把器皿置于摇床设备上，控制摇床转速100~220转/分，培养19~24小时，得到种子菌株；所述发酵，其方法为：往发酵罐中的发酵培养基上接种种子菌株，控制温度36~42℃，持续通入氮气和二氧化碳，氮气和二氧化碳的体积比为5~9:80~110，在搅拌速率150~370转/分下，发酵40~54小时，发酵过程中，持续添加碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，控制发酵液的ph值为6.0~7.2，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；所述后处理，其方法为：将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液经过h-型强酸性阳离子交换树脂，收集离子交换后的液体，减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至1~5℃，在1~5℃温度下静置30~48小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。2.根据权利要求1所述的发酵法生产丁二酸的方法，其特征在于：所述氢氧化钠水溶液的浓度为9~12mmol/l；所述加入纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加18~25fpu纤维素酶，木聚糖酶的加入量为每克玉米秸秆爆破物添加170~240u木聚糖酶；所述补加1次玉米秸秆爆破物，玉米秸秆爆破物的补加量为蒸馏水质量的1/9~1/6；所述补加1次纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加18~25fpu纤维素酶，木聚糖酶的补加量为每补加1克玉米秸秆爆破物需补加170~240u木聚糖酶。3.根据权利要求1所述的发酵法生产丁二酸的方法，其特征在于：所述海泡石的粒径为0.5~7μm，比表面积为260~430m2/g。4.根据权利要求1所述的发酵法生产丁二酸的方法，其特征在于：所述菌株为琥珀酸放线杆菌；
所述斜面培养基和种子培养基的组成均为：8~12份葡萄糖、4~7份酵母膏、9~13份nahco3、8~11份nah2po4·
2h2o、12~16份k2hpo4·
3h2o、20~24份琼脂；所述斜面培养基和种子培养基的ph均为6.5~7.0，使用前均需要在120~140℃下灭菌13~20min；所述氮气、二氧化碳和氢气的混合气中，氮气、二氧化碳和氢气三者的体积比为6~14:70~90:1~4；所述氮气和二氧化碳的混合气中，氮气和二氧化碳的体积比为3~8:75~100。5.根据权利要求1所述的发酵法生产丁二酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：30~52份脱毒酶解液、9~17份酵母膏、5~9份nahco3、6~12份nah2po4·
2h2o、10~19份k2hpo4·
3h2o、9~15份琼脂；所述碱式碳酸铋和偏铝酸钠的混合物，其组成为：碱式碳酸铋和偏铝酸钠二者的质量比1:1~4；所述种子菌株的接种量为发酵培养基体积的4~9%。

技术总结
一种发酵法生产丁二酸的方法，属于生物发酵技术领域，所述发酵法生产丁二酸的方法包括蒸汽爆破、酶解、脱毒、菌种培养、发酵、后处理6个步骤；本发明所述发酵法生产丁二酸的方法，利用玉米秸秆，高产率低成本的发酵制备出了丁二酸，所得发酵成熟醪液中残糖0.44~0.53g/L，丁二酸含量为70.92~73.56 g/L，丁二酸产率为69.1~71.5%。71.5%。


技术研发人员：高金龙 张家亮 葛明云
受保护的技术使用者：山东小为生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.13
技术公布日：2023/10/20