腺相关病毒(AAV)的生产的制作方法

腺相关病毒(aav)的生产
1.序列表
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技术领域
3.本公开涉及用于在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法。


背景技术：

4.腺相关病毒(aav)是一种无包膜dna病毒。作为体内基因治疗的主要病毒载体，aav是非致病性的并可以有效地感染大范围人体组织。aav基因组包含一个4.7kb的单链dna，该单链dna编码两个主要基因：rep基因编码四种亚型(rep78、rep68、rep52和rep40)，其支持aav dna复制、包装、整合和转录；cap基因合成三种用于病毒蛋白壳或衣壳的构建的vp蛋白(vp1、vp2和vp3)。
5.野生型aav在没有辅助病毒(如腺病毒(ad)和单纯疱疹病毒(hsv))的情况下无法复制。腺病毒辅助基因已确定为aav复制所必需和充分条件，其包含e1a、e1b、e2a、e4和va。腺病毒5型(ad5)5'4.3kb基因组dna已经整合到人胚胎肾293(hek293)细胞的19号染色体中。此ad5基因组片段表达所有e1a(例如289r、243r、171r)以及e1b(例如19k和55k)亚型。已经开发了具有e1a和e1b整合的其他细胞系，包含例如per.c6细胞和细胞。参见例如fallaux等人，《人类基因疗法(human gene ther)》9(13):1909-1917(1998)和schiedner等人，《人类基因疗法》11(15):2105-2116(2000)。因此，这些细胞已经表达e1a和e1b，从而可以通过“三重质粒转染”方法支持重组aav(raav)的生产，即转染仅编码e2a、e4orf6和va的辅助质粒(phelper)，以及编码rep和cap基因(prepcap)和目标基因(paav-goi)的质粒。这种具有基因组整合的e1a和e1b基因并且天然表达e1a和e1b蛋白的细胞称为“e1互补产生细胞”。
6.目前，世界上超过70％的基于aav的基因治疗管道依赖于通过标准三重质粒转染方法在hek293细胞中瞬时转染的制造平台。hek293和其他e1互补产生细胞制造平台的生产率可能无法满足对aav不断增长的需求，例如用于临床开发和商业化。然而，目前用于增加e1互补产生细胞，如hek293细胞中aav生产率的方法(例如高生产细胞克隆筛选和分离、转染方案优化和制造工艺开发)是昂贵且耗时的。


技术实现要素：

7.在一些实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用一种或多种载体转染e1互补产生细胞，所述载体包括：(i)e1a腺病毒辅助基因；(ii)选自e2a、e4或两者的腺病毒辅助基因；(iii)病毒相关的非编码rna(va rna)；和(iv)选自rep、cap或两者的aav基因；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1
互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。
8.在另外的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和varna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap两者均可操作地连接到第三启动子，其中(i)与(ii)和(iii)中的每一种的转染比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。
9.在进一步的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子和增强子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap各自可操作地连接到第三启动子；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞，其中e1a以与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一种的约1:1至约3:1的比率表达；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。
10.在又进一步的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生：(i)包括e1a、e2a、e4和va rna的第一载体，所述e1a、e2a、e4和varna全部可操作地连接到第一启动子；以及(ii)包括rep和cap的第二载体，所述rep和cap可操作地连接到第二启动子，其中e1a与e2a、e4、varna、rep和cap中的每一个的拷贝数比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；和(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一和第二载体中的一种或两种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。
附图说明
11.以下附图构成本说明书的一部分并且被包含以进一步阐述本发明的某些方面的示例性实施例。
12.图1显示了如本文实施例中所述的用于在e1互补产生细胞中生产aav的标准三重转染质粒：含有e2a、e4和varna的phelper质粒；含有rep和cap的prep-cap质粒；和含有反向末端重复(itr)序列和目标基因(goi)的paav-goi质粒。
13.图2显示了本文实施例中描述的转染实验的病毒滴度结果。用标准三重转染质粒(“3x tnfx”)和一个或多个额外的辅助基因(空载体(对照)、单独的e1a、单独的e1b-19k、单
独的e1b-55k、np1-ns2、e1a+e1b-19k、e1a+19b-55k、e1b-19k+e1b-55k和e1a+e1b-19k+e1b-55k)转染hek293细胞。通过液滴数字pcr(ddpcr)分析粗病毒滴度。
14.图3a显示了本文实施例中描述的转染实验的病毒滴度结果。用标准三重转染质粒(“3x tnfx”)和一个或多个额外的辅助基因(空载体(对照)、单独的e1a、单独的e1b-19k、单独的e1b-55k、np1-ns2和e1a+np1-ns2)转染hek293细胞。通过液滴数字pcr(ddpcr)分析粗病毒滴度。
15.图3b显示了本文实施例中描述的转染实验的蛋白表达结果。进行蛋白质印迹分析(western blot analysis)以评估图3a和表中所示hek293细胞中e1a(289r、243r和171r亚型)、rep(rep78和rep52亚型)和cap(vp1、vp2和vp3)的蛋白表达水平。测定β-肌动蛋白水平作为对照。
16.图4a显示了本文实施例中描述的转染实验的蛋白表达结果。将含有e1a的质粒以相对于标准三重转染质粒(“3x tnfx”)中的每一者1:1、2:1或3:1摩尔比转染，分别表示为1xe1a、2xe1a或3xe1a。进行蛋白质印迹分析以评估经表中所示质粒转染的hek293细胞中e1a(289r、243r和171r亚型)、rep(rep78和rep52亚型)和cap(vp1、vp2和vp3)的蛋白表达水平。
17.图4b显示了本文实施例中描述的转染实验的病毒滴度结果。将hek293细胞用含有e1a的质粒以相对于标准三重转染质粒(“3x tnfx”)中的每一者1:1、2:1或3:1摩尔比转染，分别表示为1xe1a、2xe1a或3xe1a。通过液滴数字pcr(ddpcr)分析粗病毒滴度。
18.图5a显示了用于在e1互补产生细胞中生产aav的新型增强型三重转染质粒，如本文实施例中所述：含有e1a、e2a、e4和va rna的plhi_helper质粒；含有rep和cap的prep-cap质粒；以及含有反向末端重复(itr)序列和目标基因(goi)的paav-goi质粒。
19.图5b显示了如本文实施例中所述的转染实验的病毒滴度结果。用含有phelper的标准三重转染质粒(如图1所示)或含有plhi_helper的新型增强型三重转染质粒(如图5所示)转染hek293细胞以生产aav2和aav9。通过液滴数字pcr(ddpcr)分析粗病毒滴度。
具体实施方式
20.除非本文另外定义，否则本公开中所使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。
21.权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。
22.如本文所使用的，术语“包括(comprising)”(以及包括的任何变体或形式，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何变体或形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包含(including)”(以及包含的任何变体或形式，如“包含(includes)”和“包含(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何变体或形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。
23.术语“例如(for example)”及其对应的缩写“例如(e.g.)”(无论是否斜体)的使用
意指所引用的特定术语是本公开的代表性实例和实施例，除非另有明确说明，否则所述代表性实例和实施例不旨在限于所参考或引用的特定实例。
24.如本文所使用的，“之间”是包括范围末端的范围。例如，x与y之间的数字明确地包含数字x和y以及落入x和y内的任何数字。
25.贯穿本技术，术语“约”用于指示值包含用于确定值的方法/装置的固有的误差变化。通常，根据情况，所述术语意在涵盖大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％可变性。
26.腺相关病毒(aav)已在全球120多项临床试验中成为基因治疗的首选载体。改进e1互补产生细胞(如hek293、per.c6或细胞)中aav生产的当前标准，是满足重组aav快速增长的需求所必需的。如本文所描述的，标准aav生产方法包括将三种质粒转染到e1互补产生细胞(含有e2a、e4和va的phelper；含有rep和cap的prepcap；和含有目标基因(goi)的paav)中，称为“标准三重转染”，如图1所示。e1互补产生细胞天然表达剩余的辅助基因e1a和e1b，因此，e1a和e1b不包含在phelper中。
27.因此，令人惊讶地发现，将e1a转染到e1互补产生细胞(例如hek293细胞中)从而提供了高于天然发现的额外e1a，显著提高了aav滴度。滴度的增加通常是剂量依赖性的，依赖于引入到e1互补产生细胞的e1a的量。因此，本文提供了与当前标准三重转染方法相比具有更高产量的在e1互补产生细胞中生产aav的方法。
28.在实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用一种或多种载体转染e1互补产生细胞，所述载体包括：(i)e1a腺病毒辅助基因；(ii)选自e2a、e4或两者的腺病毒辅助基因；(iii)病毒相关的非编码rna(va rna)；和(iv)选自rep、cap或两者的aav基因；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。
29.如本文所使用的，“载体”或“表达载体”是指核酸复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，另一个核酸片段可以附着到其上，以在宿主细胞中实现所附着的核酸片段的复制和/或表达。术语“载体”包含附加体(例如质粒)和非附加体载体。术语“载体”也可以包含合成载体。载体的非限制性实例包含杆状病毒载体、噬菌体载体、质粒、噬粒、粘粒、f黏粒(forsmid)、细菌人工染色体、病毒载体(例如基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、sv40、单纯疱疹病毒等的病毒载体)、基于p1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和对目标的特定宿主特异的任何其他载体(例如，哺乳动物细胞，如本文所描述的e1互补产生细胞，包含但不限于hek293细胞、per.c6细胞、细胞及其衍生物)。可以通过众所周知的方法，包含但不限于转染、转导、细胞融合和脂转染，将载体引入所需的宿主细胞，例如hek293细胞、per.c6细胞、细胞或其衍生物。载体可以包括各种调节元件，所述调节元件包括例如组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。
30.如本文所使用的，“转染”意指将外源核酸分子(例如载体)引入细胞。“经转染”细胞包括细胞内部的外源核酸分子，并且“经转化”细胞是其中细胞内的外源核酸分子诱导细胞中表型改变的细胞。经转染的核酸分子可以整合到宿主细胞的基因组dna中和/或可以由细胞在染色体外暂时或延长一段时间维持。表达外源核酸分子或片段的宿主细胞或生物体被称为“重组”、“经转化”或“转基因”生物体。许多转染技术在本领域中通常是已知的，并且包含各种化学和物理方法，例如电穿孔、细胞注射、磷酸钙暴露、脂质体或基于聚合物的载
体系统等。参见例如graham等人，《病毒学(virology)》52:456(1973)；sambrook等人，《分子克隆，实验室手册(molecular cloning,a laboratory manual)》，冷泉港实验室，纽约(1989)；davis等人，《分子生物学基础方法(basic methods in molecular biology)》，爱思唯尔(1986)；和chu等人，《基因(gene)》13:197(1981)。这种技术可用于将一种或多种外源核酸分子(如本文所描述的一种或多种用于生产aav的载体)引入合适的宿主细胞(如hek293细胞)。
[0031]“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”意指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物。术语“核酸”包含rna和dna，两者都可能是单链或双链的。dna包含但不限于互补dna(cdna)、基因组dna、质粒或载体dna和合成dna。rna包含但不限于mrna、trna、rrna、snrna、microrna或mirna。
[0032]
在实施例中，本文中的核酸与参考核酸(或参考核酸的片段)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％的序列同一性。在实施例中，本文中的多肽与参考多肽(或参考多肽的片段)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％的序列同一性。例如，当是指e1a基因时，本领域普通技术人员将理解，e1a基因涵盖与野生型腺病毒e1a基因具有至少70％、至少75％、％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列同一性的核酸，前提是e1a基因关于aav生产的功能不受影响。如本文所使用的，核酸上下文中的术语“序列同一性”和“同一性百分比”是指当核酸序列在指定的比较窗口上比对时相同的核苷酸的百分比。用于确定序列同一性的比对方法是众所周知的，可以使用公开可用的数据库如blast进行。
[0033]“基因”是指编码多肽并包含cdna和基因组dna核酸分子的核酸。在一些实施例中，“基因”也指非编码核酸片段，其可以充当编码序列之前(即5')和之后(即3')的调控序列。
[0034]
如本文所使用的，术语“腺相关病毒(aav)”是指含有细小病毒科(parvoviridae)和依赖细小病毒属(dependoparvovirus)的单链dna的小型、复制缺陷型、无包膜病毒。到目前为止，已经确定十多种腺相关病毒血清型，其中血清型aav2是最具特征的。aav血清型的其他非限制性实例为anc80、aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11。除了这些血清型之外，还开发了aav假型。aav假型含有第一血清型的衣壳和第二血清型的基因组(例如，假型aav2/5将对应于具有血清型aav2的基因组和aav5的衣壳的aav)。
[0035]
如本文所使用的，术语“腺病毒”是指腺病毒科的具有含有双链dna的二十面体核衣壳的一种非包膜病毒。已从人中分离出超过50种腺病毒亚型，并且已从其他哺乳动物和鸟类中分离出许多另外的亚型。这些亚型属于腺病毒科，腺病毒科当前分为两个属，即哺乳动物腺病毒属(mastadenovirus)和禽腺病毒属(aviadenovirus)。所有腺病毒在形态上和结构上都类似。然而，在人中，腺病毒示出不同的免疫性质，并且因此分为血清型。腺病毒的两种人类血清型(即ad2和ad5)已经进行深入研究并提供了关于腺病毒的大部分一般信息。
[0036]
如本文所使用的，术语“e1互补产生细胞”指将腺病毒e1a和e1b基因整合或插入其基因组的细胞系，通常是人类细胞系。e1互补产生细胞能够天然表达e1a和e1b，因此适于aav生产，而不需要外源e1a和/或e1b基因。e1a和e1b基因可以作为更长序列的一部分合适地整合在e1互补产生细胞中，例如，含有额外的腺病毒序列，或者e1a和e1b基因可以合适地整合在e1互补产生细胞中，而不需要任何额外的腺病毒序列，即，仅整合用于表达e1a和e1b
所需的最小编码序列。腺病毒基因整合到哺乳动物细胞(例如人类细胞中)是本领域已知的。e1互补产生细胞可以来源于任何合适的细胞系。示例性e1互补产生细胞包含但不限于hek293细胞、911细胞、ptg6559细胞、per.c6细胞、gh329细胞、n52.e6细胞(也称为细胞)、hela-e1细胞、ur细胞、vli-293细胞、ac51细胞、ac139细胞及其变体和衍生物。e1互补产生细胞进一步描述于例如kovesdi等人，《病毒(viruses)》2(8):1681-1703(2010)和farson等人，《分子治疗(mol ther)》14(2):305-311(2006)。在一些实施例中，本公开的e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0037]
如本文所使用的，术语“人胚胎肾293(hek293)细胞”是指最初来源于人胚胎肾细胞并含有大约4.5kb的ad5基因组(包括e1a和e1b基因)的细胞系。hek293细胞是本文所描述的示例性e1互补产生细胞。已经开发了hek293细胞的变体，并且包含例如hek293s、hek293t、hek293f、hek293ft、hek293ftm、hek293sg、hek293sggd、hek293h、hek293e、hek293msr和hek293a，它们中的每一个都具有不同的特征并且它们全部都含有e1a和e1b基因。如本文所使用的术语“hek293细胞”涵盖所有hek293细胞变体和衍生物，包含但不限于本文所描述的变体。例如，hek293t细胞系表达sv40 t抗原的温度敏感等位基因，这使得能够扩增含有sv40来源的载体。参见例如yuan等人，《hek293分散的十二支(the scattered twelve tribes of hek293)》《生物医学药理学杂志(biomed pharmacol j)》2018；11(2)。
[0038]
如本文所使用的，术语“per.c6细胞”是指来源于用ad5的e1区转化的人胚胎视网膜细胞的细胞系。per.c6细胞天然表达e1a和e1b，并且是本文所描述的示例性e1互补产生细胞。如本文所使用的术语“per.c6细胞”涵盖所有per.c6细胞变体和衍生物。per.c6细胞进一步描述于例如fallaux等人，《人类基因疗法(human gene ther)》9(13):1909-1917(1998)。
[0039]
如本文所使用的，术语“细胞”(在本文中也称为“cevec羊膜细胞生产细胞”或“n52.e6细胞”)是指来源于用ad5的e1区转化的原代人羊膜细胞的细胞系(在rrid:cvcl_iq88下可获得)。细胞天然表达e1a和e1b，并且是本文所描述的示例性e1互补产生细胞。细胞变体包含但不限于cap-t(登陆号：cvcl_wi61)，其表达sv40的大t抗原。参见例如等人，《bmc会议录(bmc proceedings)》5(补编8):p133(2011)。如本文所使用的术语“细胞”涵盖所有细胞变体和衍生物。
[0040]
如本文所使用的，术语“e1a”是指腺病毒早期区域1a(e1a)基因，其在病毒寿命早期阶段的腺病毒复制期间表达。e1a基因生产多种蛋白质亚型，包含但不限于289r、243r、217r、171r和55r，其中289r、243r和171r是ad5 e1a基因的主要亚型。如本文所使用的，术语“e1b”是指腺病毒早期区域1b(e1b)基因，其表达两种蛋白质：55kda蛋白质和19kda蛋白质，分别称为“e1b-19k”和“e1b-55k”。如本文所描述的，e1a、e1b-19k和e1b-55k是由e1互补产生细胞表达的腺病毒辅助基因。由于e1a、e1b-19k和e1b-55k由e1互补产生细胞以足够的量生产aav，传统上e1a和e1b基因在生产aav时不会外源性引入e1互补产生细胞。
[0041]
如本文所使用的，术语“e2a”是指腺病毒e2a辅助基因，其编码调节病毒复制的72kda dna结合蛋白。如本文所使用的，术语“e4”是指腺病毒e4辅助基因，其编码调节病毒复制和蛋白表达的蛋白质，其包含e4 orf3和e4 orf6。在实施例中，e4包括e4orf3和e4orf6中的一种或两种。如本文所使用的，术语“病毒相关的非编码rna(va rna)”是指在调节翻译中起作用的腺病毒非编码rna，并且包含vai(或vai或va rnai)和vaii(或va
ii
或va rnaii)。
在实施例中，va rna包括vai和vaii中的一种或两种。在aav生产的背景下，腺病毒基因e2a、e4和va rna介导aav复制。如本文所描述的，在e1互补产生细胞中生产aav的当前方法包含用包含e2a、e4和va rna基因的phelper质粒转染e1互补产生细胞。
[0042]
如本文所使用的，术语“rep”是指编码病毒复制蛋白的aav编码区或其功能同源物，这些蛋白是复制病毒基因组所共同需要的。aav rep的功能同源物包含例如来自人类疱疹病毒6(hhv-6)的rep编码区，所述编码区也已知介导aav dna复制。rep编码区编码至少编码aav rep78、rep68、rep52和rep40的基因或其功能同源物。rep编码区可以来源于任何aav血清型，例如如本文所描述。rep编码区不需要包含所有野生型基因，但可以改变(例如，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或突变)，只要存在的rep基因在e1互补产生细胞中表达时提供足够的复制功能。
[0043]
如本文所使用的，术语“cap”是指编码病毒衣壳蛋白的aav编码区或其功能同源物。衣壳蛋白的非限制性实例是aav衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。本文描述的cap基因可以来源于任何aav血清型或aav血清型的组合。
[0044]
在一些实施例中，用一种或多种载体转染e1互补产生细胞，所述载体包括以下一种或多种：(i)e1a，(ii)e2a和e4中的一种或两种，(iii)va rna，以及(iv)rep和cap中的一种或两种。在某些实施例中，(i)、(ii)、(iii)和(iv)在单个载体上。在进一步的实施例中，(i)、(ii)、(iii)和(iv)在多于一个的载体上。合适地，(i)、(ii)和(iii)可以在第一载体上，并且(iv)可以在第二载体上。在实施例中，(ii)包括e2a和e4两者。在进一步的实施例中，(iv)包括rep和cap两者。例如，第一载体可以包括e1a、e2a、e4和varna，并且第二载体可以包括rep和cap。合适地，(i)可以在第一载体上，(ii)和(iii)可以在第二载体上，并且(iv)在第三载体上。例如，第一载体可以包括e1a，第二载体可以包括e2a、e4和varna，并且第三载体可以包括rep和cap。合适地，(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的任何一个可以在单独的载体上，例如(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个可以在单独的载体上。例如，第一载体可以包括e1a，第二载体可以包括e2a和e4，第三载体可以包括va rna，并且第四载体可以包括rep和cap。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0045]
在一些实施例中，e1a以高于e2a、e4、va rna、rep和cap中任何一种的量转染到e1互补产生细胞中。如本文所讨论的，意外地发现aav滴度剂量依赖于e1互补产生细胞中表达的e1a的量。因此，在实施例中，e1a以e2a、e4、va rna、rep和cap中的任何一种的1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍的量引入e1互补产生细胞。增加特定基因表达的方法可以包含，例如增加引入到细胞的基因的量和增加细胞中基因的转录水平。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0046]
合适地，包括e1a的载体可以与包括e2a、e4、varna、rep和/或cap的载体中的每一种以约1:1至约10:1的比率转染到e1互补产生细胞中，或与包含e2a、e4、varna、rep和/或cap的载体中的每一种以约1:1至约9:1或约1:1至约8:1或约1:1至约7:1或约1:1至约6:1或约1:1至约5:1或约1:1至约4:1或约1:1至约3:1或约1:1至约2:1或约1:1至约1.5:1的比率转染。在一些实施例中，转染到e1互补产生细胞中的包括e1a的载体与包括e2a、e4、varna、rep和/或cap的载体中的每一种的比率是1:1。在进一步的实施例中，转染到e1互补产生细胞中的包括e1a的载体与包括e2a、e4、va rna、rep和/或cap的载体中的每一种的比率是2:
1。在还进一步的实施例中，转染到e1互补产生细胞中的包括e1a的载体与包括e2a、e4、va rna、rep和/或cap的载体中的每一个的比率是3:1。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0047]
在一些实施例中，e1a在e1互补产生细胞(例如hek293细胞、per.c6细胞或细胞)中的表达水平相比于e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一种更高。合适地，e1a、e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一种都可以可操作地连接到一个或多个启动子。在一些实施例中，e1a、e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一个都可操作地连接到单独的启动子。如本文所使用的，术语“可操作地连接”、“以可操作的组合”和“以可操作的顺序”意指目标多核苷酸(例如e1a)以允许目标多核苷酸表达的方式连接到调节元件(例如启动子)。如本文所使用的，术语“启动子”、“启动子序列”和“启动子区”是指能够结合rna聚合酶并启动下游编码或非编码基因序列转录的多核苷酸。启动子包含：组成型启动子，其允许其相关基因的连续转录；和诱导型启动子，其可以在加入诱导分子后从关闭状态切换到打开状态。启动子可以基于它们对rna聚合酶和/或σ因子的亲和力分为“强”或“弱”。与弱启动子相比，强启动子具有高的转录起始速率。启动子的非限制性实例包含脾病灶形成病毒(sffv)启动子、人多肽链延伸因子(ef1α)启动子、磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子、泛素c(ubc)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、四环素控制的反式激活子系统(也称为“tet-on”系统或tta依赖性系统，或反向四环素控制的反式激活子系统(也称为“tet-off”系统或rtta依赖性系统)、劳斯肉瘤病毒长末端重复(rsv)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、肌动蛋白启动子、细胞角蛋白14启动子或细胞角蛋白18启动子。在一些实施例中，与可操作地连接到e2a、e4、va rna、rep和cap中任何一种的启动子相比，可操作地连接到e1a的启动子是更强的启动子。
[0048]
合适地，与可操作地连接到e2a、e4、va rna、rep和cap中的任何一种的启动子相比，可操作地连接到e1a的启动子可以提供1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超过10倍的表达。在进一步的实施例中，与可操作地连接到e2a、e4、va rna、rep和cap中的任何一种的启动子相比，可操作地连接到e1a的启动子提供基本上相同的表达水平。如本文所使用的，“基本上相似”或“基本上相同”的表达水平意指表达水平在参考表达水平的20％、15％、10％、5％或1％内。
[0049]
在一些实施例中，e1a可操作地连接到启动子，并进一步可操作地连接到增强子，并且e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一种都合适地不连接到增强子。如本文所使用的，术语“增强子”是指将转录激活到比它们不存在时更高水平的调节元件，例如通过募集转录因子。增强子可以激活远距离(例如，距离转录起始位点高达1mbp)并且与方向无关的启动子转录。增强子的非限制性实例包含cmv增强子、α-甲胎蛋白merii增强子、mck增强子或sv40 polya增强子。合适地，与不与增强子连接的e2a、e4、va rna、rep和/或cap相比，可操作地连接到启动子和增强子的e1a可以提供更高的表达水平。
[0050]
合适地，一个或多个载体可以包含复制起点，以增加宿主细胞生产的质粒数量，这导致一个或多个载体上的基因编码的蛋白质水平增加。示例性复制起点包含但不限于sv40复制起点、epstein-barr(ebv)复制起点以及本领域普通技术人员已知的其他起点。
[0051]
在一些实施例中，存在于一个或多个载体上的e1a的拷贝数(在此称为“拷贝数”(copy number))高于一个或多个载体上的e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一种的拷贝
数。在一实例中，单个载体可以含有2个或更多个拷贝的e1a和e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一种的单个拷贝。在另一个实例中，对于存在于一个或多个载体上的e2a、e4、va rna、rep和cap的每种拷贝，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个拷贝的e1a存在于一个或多个载体上。合适地，一个或多个载体上的e1a与e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一种的拷贝数比可以是约1:1至约10:1，或约1:1至约9:1，或约1:1至约8:1，或约1:1至约7:1，或约1:1至约6:1，或约1:1至约5:1，或约1:1至约4:1，或约1:1至约3:1，或约1:1至约2:1，或约1:1至约1.5:1。在一些实施例中，一个或多个载体上e1a与e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一种的拷贝数比为约1:1。在进一步的实施例中，一个或多个载体上e1a与e2a、e4、va rna、rep和/或cap中的每一种的拷贝数比为约2:1。在还进一步的实施例中，一个或多个载体上e1a与e2a、e4、varna、rep和/或cap中的每一种的拷贝数比为约3:1。
[0052]
在一些实施例中，所述方法包括将额外的辅助基因转染到e1互补产生细胞中。因此，在实施例中，所述一种或多种载体进一步包括(i)e1a，(ii)e2a和e4中的一种或两种，(iii)va rna，(iv)rep和cap中的一种或两种；和(v)选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0053]
如本文所讨论的，e1b是腺病毒辅助基因，并编码用于aav生产的e1b-19k和e1b-55k辅助蛋白。如本文所使用的，术语“np1”和“ns2”分别指编码np1和ns2非结构蛋白的人博卡病毒(hbov1)基因。已经发现np1和ns2是用于aav复制的辅助基因，并且当与e1互补产生细胞(即本文所描述的e2a、e4和varna)的常规腺病毒辅助基因共表达时，显示出增强aav滴度。参见例如wang等人，《分子治疗方法和临床开发(mol ther methods clin dev)》11:40-51(2018)。在一些实施例中，转染e1b、np1和ns2中的一种或多种，与本文所描述的(i)、(ii)、(iii)和(iv)组合，进一步增加e1互补产生细胞中的aav滴度。在某些实施例中，(v)包括eb1。在进一步的实施例中，(v)包括np1和ns2。在还进一步实施例中，(v)包括e1b、np1和ns2。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0054]
在一些实施例中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)在单个载体上。在进一步的实施例中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)在多于一个的载体上。例如，(i)、(ii)和(iii)可以在第一载体上，(iv)可以在第二载体上，并且(v)可以在第三载体上。在另一实例中，(i)、(ii)、(iii)和(v)可以在第一载体上，并且(iv)可以在第二载体上。在进一步的实例中，(i)、(ii)和(iii)可以在第一载体上，并且(iv)和(v)可以在一个或多个附加载体上。在又进一步实例中，(i)和(v)可以在第一载体上，并且(ii)、(iii)和(iv)可以在一个或多个附加载体上。合适地，(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的任何一种可以在单独的载体上，例如(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的每一种可以在单独的载体上。在实施例中，第一载体包括e1a、e2a、e4和va rna，第二载体包括rep和cap。在另外的实施例中，第一载体包括e1a、e2a、e4和va rna，第二载体包括rep和cap，并且第三载体包括e1b、np1、ns2或其组合。
[0055]
e1互补产生细胞(例如hek293细胞，per.c6细胞或细胞)可以在转染(i)e1a、(ii)e2a和e4中的一种或两种、(iii)va rna、(iv)rep和cap中的一种或两种；(v)选自e1b、np1、ns2或其组合辅助基因；和/或goi之后使用本文所描述的任何合适的装置、设施和方法培养。合适地，可以在培养期间诱导(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的表达。在某些实施例中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)中任何启动子是组成型启动子。在进一步的实施例中，
(i)、(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)中任何一个的启动子是诱导型启动子，需要诱导分子来激活本文所描述的转录。在一个方面，在诱导型启动子控制下的基因的表达水平可以通过调节诱导分子的量来调节。在另一个方面，相同的诱导型启动子可以使用多于一个的诱导分子来调节以影响不同的表达水平。在另一方面，与(i)可操作地连接的启动子是比与(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)可操作地连接的启动子更强的启动子。例如，(i)可以受相对较强的启动子如cmv或sv40启动子的控制，并且(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)可以受相对较弱的启动子如ubc或pgk启动子的控制。在另一方面，可操作地连接到(i)的启动子由不同于可操作地连接到(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)的启动子的诱导分子诱导。例如，(i)可以受由四环素(tet)或类似物如多西环素(dox)诱导的tet-on系统的控制；(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)可以受组成型启动子如cmv、sv40、ubc或pgk的控制；并且e1a表达的水平可以通过添加到细胞培养物中的诱导分子(例如tet或dox)的量来调节。因此，添加到细胞培养物中的诱导分子的量可以确定在细胞培养物中表达的(i)、(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)的相对量。
[0056]
在其中一种或多种载体包括(i)、(ii)、(iii)和(iv)的实施例中，培养包括调节(i)、(ii)、(iii)和(iv)的表达，使得e1a以与(ii)、(iii)和(iv)中每一种的1:1至约10:1的比率表达，或以与(ii)、(iii)和(iv)中每一种的约1:1至约9:1、或约1:1至约8:1、或约1:1至约7:1、或约1:1至约6:1、或约1:1至约5:1、或约1:1至约4:1、或约1:1至约3:1、或约1:1至约2:1、或约1:1至约1.5:1的比率表达。合适地，e1a的表达与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的表达的比率为约1:1。在进一步的实施例中，e1a的表达与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的表达的比率为约2:1。在还进一步的实施例中，e1a的表达与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的表达的比率为约3:1。
[0057]
在其中一种或多种载体包括(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的实施例中，培养包括调节(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的表达，使得e1a以与(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的每一种的1:1至约10:1、或约1:1至约9:1、或约1:1至约8:1、或约1:1至约7:1、或约1:1至约6:1、或约1:1至约5:1、或约1:1至约4:1、或约1:1至约3:1、或约1:1至约2:1、或约1:1至约1.5:1的比率表达。合适地，e1a的表达与(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的每一种的表达的比率为约1:1，或约2:1，或约3:1。
[0058]
在一些实施例中，一个或多个载体进一步包括目标基因(goi)。合适地，goi位于与(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的每一种分开的载体上。因此，在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞，其中goi位于与(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的每一种分开的载体上。合适地，包括(i)的载体以与包括goi的载体的约1:1至约10:1的比率，或与包含goi的载体的约1:1至约9:1、或约1:1至约8:1、或约1:1至约7:1、或约1:1至约6:1、或约1:1至约5:1、或约1:1至约4:1、或约1:1至约3:1、或约1:1至约2:1、或约1:1至约1.5:1的比率转染到e1互补产生细胞中。合适地，经转染到e1互补产生细胞中的包括(i)的载体的比率与包括goi的载体的比率为约1:1、约2:1、或约3:1。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0059]
包括goi的载体可以包含goi侧方的两个反向末端重复(itr)序列。如本领域已知的，这些itr序列是单链核苷酸序列，其后跟随为其反向互补序列。itr序列代表aav基因组复制、拯救、包装和整合所需的最小序列。
[0060]
通常，如本文所使用的，术语“goi”是指异源基因，即通常不连接在一起和/或通常
不与特定宿主细胞相关的基因。在一些实施例中，异源基因是在自然界中没有发现编码序列本身的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。合适地，goi可以是报告基因、选择基因或治疗目标基因。
[0061]
如本文所提到，“报告基因”是一种基因，其在表达时赋予细胞易于鉴定和测量的表型。在一些实施例中，报告基因编码荧光蛋白。在进一步的实施例中，报告基因包括选择基因。
[0062]
如本文所提到，“选择基因”是编码具有酶活性的蛋白质的基因，其赋予宿主细胞在缺乏其他必需营养素的培养基中生长的能力。可替代地或另外地，选择基因可赋予其中表达选择基因的宿主细胞对抗生素或药物的抗性。选择基因可用于赋予宿主细胞特定的表型。当宿主细胞表达选择基因以在选择培养基中生长时，该基因被称为正选择基因。选择基因也可用于针对含有特定基因的宿主细胞进行选择；以这种方式使用的选择基因被称为负选择基因。
[0063]
如本文所使用的，术语“治疗目标基因”是指任何功能相关的核苷酸序列。因此，本公开的治疗目标基因可以包括编码靶细胞基因组有缺陷或缺失的蛋白质或编码具有期望的生物学或治疗效果(例如，抗病毒功能)的非天然蛋白质或者序列可以对应于具有反义或核酶功能的分子的任何期望的基因。合适的治疗目标基因的代表性(非限制性)实例包含用于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病、慢性疾病和感染性疾病的那些，包含如aids、癌症、神经疾病、心血管疾病、高胆固醇血症的病症；各种血液病症，包含各种贫血、地中海贫血和血友病；遗传缺陷如囊性纤维化、戈谢病、腺苷脱氨酶(ada)缺乏、肺气肿等。本领域已经描述了可用于癌症和病毒性疾病的反义疗法的若干种反义寡核苷酸(例如，与mrna的翻译起始位点(aug密码子)周围的序列互补的短寡核苷酸)并且其也是合适的在治疗目标基因的实例。
[0064]
在另外的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap两者均可操作地连接到第三启动子，其中(i)与(ii)和(iii)中的每一种的转染比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0065]
在进一步的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子和增强子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap各自可操作地连接到第三启动子；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞，其中e1a以与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一种的约1:1至约
3:1的比率表达；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0066]
在又进一步的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括e1a、e2a、e4和va rna的第一载体，所述e1a、e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第一启动子；以及(ii)包括rep和cap的第二载体，所述rep和cap可操作地连接到第二启动子，其中e1a与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一种的拷贝数比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；和(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一和第二载体中的一种或两种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0067]
在实施例中，本文提供了一种用aav治疗有需要的受试者的方法，其包括：用一种或多种载体转染e1互补产生细胞(例如hek293细胞、per.c6细胞或细胞)，所述载体包括：(i)e1a腺病毒辅助基因；(ii)选自e2a、e4或两者的腺病毒辅助基因；(iii)病毒相关的非编码rna(va rna)；和(iv)选自rep、cap或两者的aav基因；生产aav；收获aav；并对受试者施用aav。本文进一步描述了生产aav的方法。合适地，所述方法用于用goi(例如治疗目的基因)治疗受试者。对人受试者的施用可以包含例如吸入、注射或静脉内施用以及本领域已知的其他施用方法。
[0068]
如本文所讨论的，与不包括用e1a转染e1互补产生细胞的方法相比，本公开的方法有利地提供了由e1互补产生细胞生产的更高滴度的aav。在实施例中，与不包括用e1a转染e1互补产生细胞的方法相比，本公开的方法提供至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍或更高的aav滴度。合适地，e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。
[0069]
生产aav的方法可用于连续制造系统中。用于e1互补产生细胞(例如hek293细胞，per.c6细胞或细胞)的培养条件在该领域是已知的。一般来说，hek293细胞、per.c6细胞和细胞是悬浮培养物，它们生长在培养瓶或大悬浮桶中，从而允许气体和营养物交换的大表面积。悬浮细胞培养物通常利用搅拌或搅动机构来提供适当的混合。用于维持细胞悬浮的培养基和条件是本领域普通技术人员已知的。在示例性实施例中，悬浮细胞培养物的使用允许生产大量aav，具有高生产率和延长的培养条件，以允许每批起始细胞多次收获aav。
[0070]
生产方法可以利用任何合适的反应器，包含但不限于搅拌槽、气升、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文所使用的，“反应器”可以包含发酵罐或发酵单元或任何其他反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可互换地使用。例如，在一些方面，示例生物反应器单元可以执行以下中的一项或多项或全部：营养
物和/或碳源的进给、合适的气体(例如，氧气)的注射、发酵或细胞培养基的入口和出口流动、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和co2水平的维持、ph水平的维持、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/灭菌。示例反应器单元，如发酵单元可以在单元内含有多个反应器，例如所述单元可以在每个单元中具有1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个生物反应器和/或设施可以在所述设施内含有多个单元，所述多个单元具有单个或多个反应器。在各个实施例中，生物反应器可以适用于分批、半补料分批、补料分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施例中，生物反应器的体积可以介于约100ml与约50,000l之间。非限制性实例的体积为100ml、250ml、500ml、750ml、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升。另外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料(包含金属合金如不锈钢(例如，316l或任何其他合适的不锈钢)以及inconel、塑料和/或玻璃)形成。
[0071]
在实施例中并且除非本文另有说明，否则本文中所描述的装置、设施和方法还可以包含未另外提及的任何合适的单元操作和/或装备，如用于分离、纯化和离析此类产物的操作和/或装备。可以使用任何合适的设施和环境，如传统的构件式建造设施、模块化、移动和临时设施，或任何其他合适的建筑、设施和/或布局。例如，在一些实施例中，可以使用模块化洁净室。另外并且除非另有说明，否则本文中所描述的装置、系统和方法可以容纳在单个位置或设施中和/或在单个位置或设施中执行，或可替代地容纳在单独或多个位置和/或设施中和/或在单独或多个位置和/或设施中执行。
[0072]
本文所引用的所有参考文献，包含专利、专利申请、论文、教科书等，以及本文所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此通过引用以其整体并入本文。
[0073]
另外的示例性实施例
[0074]
实施例1是一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用一种或多种载体转染e1互补产生细胞，所述载体包括：(i)e1a腺病毒辅助基因；(ii)选自e2a、e4或两者的腺病毒辅助基因；(iii)病毒相关的非编码rna(va rna)；和(iv)选自rep、cap或两者的aav基因；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。
[0075]
实施例2包含实施例1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在单个载体上。
[0076]
实施例3包含实施例1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在多于一个的载体上。
[0077]
实施例4包含实施例3所述的方法，其中(i)、(ii)和(iii)在第一载体上，并且(iv)是第二载体。
[0078]
实施例5包含实施例3所述的方法，其中(i)在第一载体上，(ii)和(iii)在第二载体上，并且(iv)在第三载体上。
[0079]
实施例6包含实施例3所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个都在单
独的载体上。
[0080]
实施例7包含实施例5或6所述的方法，其中将包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个以约1:1至约5:1的比率转染到e1互补产生细胞中。
[0081]
实施例8包含实施例7所述的方法，其中转染到e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是1:1。
[0082]
实施例9包含实施例7所述的方法，其中转染到e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是2:1。
[0083]
实施例10包含实施例7所述的方法，其中转染到e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是3:1。
[0084]
实施例11包含实施例1至10中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)可操作地连接到一个或多个启动子。
[0085]
实施例12包含实施例11所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个都可操作地连接到单独的启动子。
[0086]
实施例13包含实施例12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供基本上相同的表达水平。
[0087]
实施例14包含实施例12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供至少2倍的表达。
[0088]
实施例15包含实施例12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供至少3倍的表达。
[0089]
实施例16包含实施例11至15中任一项所述的方法，其中(i)可操作地连接到启动子并进一步可操作地连接到增强子，并且其中(ii)、(iii)和(iv)未可操作地连接到增强子。
[0090]
实施例17包含实施例1至16中任一项所述的方法，其中在一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比为约1:1至约5:1。
[0091]
实施例18包含实施例17所述的方法，其中在一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是1:1。
[0092]
实施例19包含实施例17所述的方法，其中在一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是2:1。
[0093]
实施例20包含实施例17所述的方法，其中在一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是3:1。
[0094]
实施例21包含实施例1至20中任一项所述的方法，其中(ii)包括e2a和e4。
[0095]
实施例22包含实施例1至21中任一项所述的方法，其中(iv)包括rep和cap。
[0096]
实施例23包含实施例1至22中任一项所述的方法，其中培养包括以与(ii)、(iii)和(iv)中每一个的约1:1至约5:1的比率表达e1a。
[0097]
实施例24包含实施例23所述的方法，其中e1a的表达与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的表达的比率是1:1、2:1或3:1。
[0098]
实施例25包含实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述一个或多个载体进一步包含(v)选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。
[0099]
实施例26包含实施例25所述的方法，其中e1b是e1b-19k或e1b-55k。
[0100]
实施例27包含实施例25所述的方法，其中(v)包括np1和ns2。
[0101]
实施例28包含实施例25至27中任一项所述的方法，其中(i)和(v)在单个载体上。
[0102]
实施例29包含实施例25至27中任一项所述的方法，其中(v)在与(i)、(ii)、(iii)和(iv)分开的载体上。
[0103]
实施例30包含实施例1至29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个载体进一步包含目标基因。
[0104]
实施例31包含实施例1至29中任一项所述的方法，其进一步包括用包括目标基因的载体转染e1互补产生细胞，其中基因或目标位于与(i)、(ii)、(iii)和(iv)分开的载体上。
[0105]
实施例32包含实施例1至31中任一项所述的方法，其中与不包括用e1a腺病毒辅助基因转染e1互补产生细胞的方法相比，该方法生产至少1.5倍或更高滴度的aav。
[0106]
实施例33是一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap两者均可操作地连接到第三启动子，其中(i)与(ii)和(iii)中的每一个的转染比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。
[0107]
实施例34是一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子和增强子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(varna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap各自可操作地连接到第三启动子；在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞，其中e1a以与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一种的约1:1至约3:1的比率表达；以及从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。
[0108]
实施例35是一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括e1a、e2a、e4和va rna的第一载体，所述e1a、e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第一启动子；以及(ii)包括rep和cap的第二载体，所述rep和cap可操作地连接到第二启动子，其中e1a与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一个的拷贝数比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；和(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。
[0109]
实施例36包含实施例33或34所述的方法，其中第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。
[0110]
实施例37包含实施例35所述的方法，其中第一或第二载体中的一种或两种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。
[0111]
实施例38包含实施例33至35中任一项所述的方法，其进一步包括用包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因的载体转染e1互补产生细胞。
[0112]
实施例39包含实施例36至38中任一项所述的方法，其中e1b是e1b-19k或e1b-55k。
[0113]
实施例40包含实施例36至38中任一项所述的方法，其中辅助基因包括np1和ns2的
组合。
[0114]
实施例41包含实施例33至40中任一项所述的方法，其进一步包括用包括目标基因的载体转染e1互补产生细胞。
[0115]
实施例42包含实施例1至41中任一项所述的方法，其中e1互补产生细胞是hek293细胞、911细胞、ptg6559细胞、per.c6细胞、gh329细胞、n52.e6细胞、hela-e1细胞、ur细胞、vli-293细胞、ac51细胞、ac139细胞或其变体或衍生物。
[0116]
实施例43包含实施例42所述的方法，其中e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或n52.e6细胞。
[0117]
实施例44包含实施例43所述的方法，其中e1互补产生细胞是hek293细胞。
[0118]
实施例45包含实施例44所述的方法，其中hek293细胞是hek293s细胞、hek293t细胞、hek293f细胞、hek293ft细胞、hek293ftm细胞、hek293sg细胞、hek293sggd细胞、hek293h细胞、hek293e细胞、hek293msr细胞、hek293a细胞或其组合。
[0119]
实施例46包含实施例45所述的方法，其中hek293细胞是hek293t细胞。
[0120]
实施例47包含实施例43所述的方法，其中e1互补产生细胞是per.c6细胞。
[0121]
实施例48包含实施例43所述的方法，其中e1互补产生细胞是n52.e6细胞。
[0122]
实例
[0123]
实例1.用于aav生产的候选辅助基因的筛选
[0124]
为了通过三重转染鉴定提高aav产量的新辅助基因，合成了e1a、e1b-19k、e1b-55k和人博卡病毒np1和ns2的全长cdna。在pcdna3.1载体中的cmv启动子和牛生长激素聚腺苷酸化(bgh poly(a))信号之间亚克隆额用于另外辅助基因的cdna以允许过表达。np1和ns2与内部核糖体进入位点(ires)相连以在单个mrna转录物中双重表达。候选质粒含有：单独的e1a(seq id no:1)、单独的e1b-19k(seq id no:2)、单独的e1b-55k(seq id no:3)、np1-ns2(seq id no:4)、e1a+e1b-19k、e1a+19b-55k、e1b-19k+e1b-55k或e1a+e1b-19k+e1b-55k。
[0125]
为了测试这些候选质粒，hek293细胞在125ml摇瓶中的30ml培养物中生长，并经图1所示的标准三重转染质粒和候选辅助质粒转染。对于rep/cap质粒，使用prep2-cap9，并且对于paav质粒，使用paav-cmv-gfp用于生产aav9.gfp病毒。将相同量的空载体pcdna3.1共转染作为对照。每个候选辅助质粒一式两份进行测试。
[0126]
转染后三天收获粗病毒并进行液滴数字pcr(ddpcr)滴度分析，以定量每毫升含颗粒的病毒基因组(vg/ml)。图2中的结果显示，与对照相比，e1a或e1a加e1b亚型的额外表达显著增加了近100％的滴度，而e1b亚型或博卡病毒np1和ns2的表达对aav滴度的改善最小。
[0127]
实例2.确认e1a过表达生产aav
[0128]
在以下条件下重复实施例1中的实验：空载体(对照)、单独的e1a、单独的e1b-19k、单独的e1b-55k、np1-ns2和e1a+np1-ns2，并且通过ddpcr分析粗病毒滴度结果。如图3a所示，单独的e1a或e1a加上博卡病毒np1和ns2基因增加了约50％的aav滴度，而单独的博卡病毒基因没有效果。
[0129]
为了证实e1a的过表达，进行蛋白质印迹分析以评估e1a蛋白表达(转染条件如图3b的表格所示)。如图3b所示，与仅含有hek293细胞内源性表达的e1a蛋白的样品1和2相比，在具有质粒转染的e1a的样品3、4、11和12中，e1a的额外共转染表达了更高水平的e1a蛋白
的所有三种亚型(289r、243r和171r)。以β-肌动蛋白水平作为对照测量，不同条件间差异无统计学意义。还确定了rep(rep78和rep52亚型)和cap(vp1、vp2和vp3)的蛋白表达水平，在经e1a转染的样品与对照之间没有检测到显著差异。因此，e1a过表达可通过调节rep和cap蛋白表达以外的机制提高aav滴度。
[0130]
实例3.e1a对于aav生产的剂量依赖性改进
[0131]
通过滴定相对于phelper质粒1:1、2:1或3:1摩尔比的e1a质粒，进一步测试用于aav滴度改善的e1a功能，在图4a的表格中分别表示为1xe1a、2xe1a或3xe1a。以与实例1相同的方式进行转染和aav生产。e1a过表达的增加通过蛋白质印迹分析得到证实，如图4a所示。aav9.gfp滴度以e1a剂量依赖性方式增加，如图4b所示。
[0132]
实例4.用于aav生产的新型增强型三重转染
[0133]
为了简化转染实验，将e1a表达盒从实例1的pcdna3.1-e1a质粒亚克隆到图1所示的标准phelper载体中。将新的辅助质粒(称为“plhi_helper”(seq id no:5))转染到hek293细胞中以代替常规的phelper，如图5a所示。与标准三重转染相比，plhi_helper介导的三重转染显著提高了aav2.gfp和aav9.gfp的生产率，分别比使用phelper的对照标准三重转染提高了52.2％和36.1％，如图5b所示。
[0134]
序列
[0135]
seq id no:1-含有e1a的示例性质粒(pcdna3.1-e1a)
[0136]
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttgccaccatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaat
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[0137]
seq id no:2-含有e1b-19k的示例性质粒(pcdna3.1-e1b-19k)
[0138]
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttttgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttgccaccatggaggcttgggagt
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[0139]
seq id no:3-含有e1b-55k的示例性质粒(pcdna3.1-e1b-55k)
[0140]
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[0141]
seq id no:4-含有np1和ns2的示例性质粒(pcdna3.1-np1-ns2)
[0142]
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技术特征：
1.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：a.用一种或多种载体转染所述e1互补产生细胞，所述载体包括：i.e1a腺病毒辅助基因；ii.选自e2a、e4或两者的腺病毒辅助基因；iii.病毒相关的非编码rna(va rna)；以及iv.选自rep、cap或两者的aav基因；b.在适于生产所述aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及c.从培养的e1互补产生细胞中纯化所述aav，从而获得所述aav。2.根据权利要求1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在单个载体上。3.根据权利要求1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在多于一个载体上。4.根据权利要求3所述的方法，其中(i)、(ii)和(iii)在第一载体上并且(iv)是第二载体。5.根据权利要求3所述的方法，其中(i)在第一载体上，(ii)和(iii)在第二载体上，并且(iv)在第三载体上。6.根据权利要求3所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个在单独的载体上。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一种以约1:1至约5:1的比率转染到所述e1互补产生细胞中。8.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是1:1。9.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是2:1。10.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是3:1。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)可操作地连接到一个或多个启动子。12.根据权利要求11所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个可操作地连接到单独的启动子。13.根据权利要求12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供基本上相同的表达水平。14.根据权利要求12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供至少2倍的表达。15.根据权利要求12所述的方法，其中与所述可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，所述可操作地连接到(i)的启动子提供至少3倍的表达。16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中(i)可操作地连接到启动子，并进一步可操作地连接到增强子，并且其中(ii)、(iii)和(iv)未可操作地连接到增强子。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比为约1:1至约5:1。18.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和
(iv)中的每一个的拷贝数比是1:1。19.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是2:1。20.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是3:1。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中(ii)包括e2a和e4。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中(iv)包括rep和cap。23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述培养包括以与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的约1:1至约5:1的比率表达e1a。24.根据权利要求23所述的方法，其中e1a的表达与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的表达的比率是1:1、2:1或3:1。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述一个或多个载体进一步包括(v)选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述e1b是e1b-19k或e1b-55k。27.根据权利要求25所述的方法，其中(v)包括np1和ns2。28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(i)和(v)在单个载体上。29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(v)位于与(i)、(ii)、(iii)和(iv)分开的载体上。30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个载体进一步包括目标基因。31.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其进一步包括用包括目标基因的载体转染所述e1互补产生细胞，其中所述基因或目标基因位于与(i)、(ii)、(iii)和(iv)分开的载体上。32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中与不包括用e1a腺病毒辅助基因转染e1互补产生细胞的方法相比，所述方法生产至少1.5倍或更高滴度的aav。33.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：a.用以下物质转染所述e1互补产生细胞：i.包括与第一启动子可操作地连接的e1a的第一载体；ii.包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；以及iii.包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap两者均可操作地连接到第三启动子，其中(i)与(ii)和(iii)中的每一个的转染比为约1:1至约3:1；b.在适于生产所述aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及c.从培养的e1互补产生细胞中纯化所述aav，从而获得所述aav。34.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：a.用以下物质转染所述e1互补产生细胞：i.包括与第一启动子和增强子可操作地连接的e1a的第一载体；ii.包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；以及
iii.包含rep和cap的第三载体，所述rep和cap每个可操作地连接到第三启动子；b.在适于生产所述aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞，其中e1a与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一种以约1:1至约3:1的比率表达；以及c.从培养的e1互补产生细胞中纯化所述aav，从而获得所述aav。35.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：a.用以下物质转染所述e1互补产生细胞：i.包括e1a、e2a、e4和va rna的第一载体，所述e1a、e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第一启动子；以及ii.包括rep和cap的第二载体，所述rep和cap可操作地连接到第二启动子，其中e1a与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一个的拷贝数比为约1:1至约3:1；b.在适于生产所述aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及c.从培养的e1互补产生细胞中纯化所述aav，从而获得所述aav。36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。37.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一或第二载体中的一种或两种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。38.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其进一步包括用包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因的载体转染所述e1互补产生细胞。39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述e1b是e1b-19k或e1b-55k。40.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述辅助基因包括np1和ns2的组合。41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其进一步包括用包括目标基因的载体转染所述e1互补产生细胞。42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是hek293细胞、911细胞、ptg6559细胞、per.c6细胞、gh329细胞、细胞、hela-e1细胞、ur细胞、vli-293细胞、ac51细胞、ac139细胞或其变体或衍生物。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是hek293细胞。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述hek293细胞是hek293s细胞、hek293t细胞、hek293f细胞、hek293ft细胞、hek293ftm细胞、hek293sg细胞、hek293sggd细胞、hek293h细胞、hek293e细胞、hek293msr细胞、hek293a细胞或其组合。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述hek293细胞是hek293t细胞。47.根据权利要求43所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是per.c6细胞。48.根据权利要求43所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是细胞。

技术总结
本公开涉及在E1互补产生细胞中用于生产腺相关病毒(AAV)的方法。腺相关病毒(AAV)的方法。腺相关病毒(AAV)的方法。


技术研发人员：顾炳南 J
受保护的技术使用者：隆萨休斯敦股份有限公司
技术研发日：2022.02.10
技术公布日：2023/10/20