唤妍草种子的发酵提取物的制作方法

1.本发明涉及化妆品领域，特别地涉及一种唤妍草(longoza)种子的发酵提取物，以及能够获得它的发酵方法、含有所述唤妍草种子的发酵提取物的化妆品组合物，及其在用于护理和/或化妆角蛋白材料的美容方法中的用途。


背景技术：

2.已知老化是由内源性因素(例如应激、激素等)和外源性因素(例如温度、气候、uv辐射、大气污染、香烟烟雾等)引起的，导致各种细胞功能的减慢和/或改变。对于皮肤而言，老化表现为各种临床体征，尤其是表皮更新减少、皮肤屏障改变、皮肤的紧致度和弹性降低、皮肤厚度减少、皱纹或细纹出现、肤色不均匀出现和/或更干燥的皮肤。
3.因此，不断需要寻找能够预防和/或减少皮肤老化迹象，尤其是能够对抗应激和/或能够刺激和/或促进皮肤更新以及皮肤细胞活力的试剂。
4.出乎意料的是，申请人在体外皮肤模型上发现了唤妍草种子的发酵提取物的“抗老化”作用。事实上，唤妍草种子的发酵提取物可以有利地改善皮肤的结构，使皮肤明显变得更厚，具有非常清晰的基底组织和结构化的真皮表皮连接。此外，唤妍草种子的发酵提取物可以有利地增加参与皮肤机械坚固性及其更新和其弹性的各种蛋白质(例如弹性蛋白、桥粒芯糖蛋白1、兜甲蛋白、转谷氨酰胺酶和zo-1)的表达，最终促进皮肤细胞的细胞完整性和稳态。因此，这些作用使得可以设想使用这种唤妍草种子的发酵提取物来预防和/或减少皮肤老化的迹象。特别地，根据本发明，唤妍草种子的发酵提取物用作化妆品活性成分，旨在促进和/或刺激表皮更新、皮肤的脱屑、皮肤细胞的活力和/或皮肤细胞的凝聚力，和/或预防和/或减少皮肤老化的迹象，特别是紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皱纹和/或细纹的出现、皮肤干燥、皮肤屏障功能的改变、皮肤柔软度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。


技术实现要素：

5.因此，本发明的第一目的涉及一种唤妍草种子的发酵提取物，其包含相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计0.05至2％含量的奎宁酸和5至15％含量的乙酸。
6.本发明的另一个目的涉及一种用于发酵唤妍草种子的方法，其包括以下步骤：
7.a)将微生物聚生体在包含碳水化合物的溶液中在17至38℃的温度孵育1至10天，以获得微生物培养物，
8.所述聚生体包含至少一种属于乳杆菌属(lactobacillus)或片球菌属(pediococcus)的乳酸菌，至少一种属于酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schyzosaccharomyces)或有孢圆酵母属(torulaspora)的酵母，和至少一种属于醋菌属(acetobacter)、葡糖杆菌属(gluconobacter)或驹形杆菌属(komagataeibacter)的乙酸菌；
9.b)将唤妍草种子研磨，以获得由平均尺寸为100μm至1mm的颗粒组成的粉末；
10.c)将所述粉末加入至包含微生物培养物的发酵介质中，以获得发酵混合物，
11.所述发酵介质包含选自蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜或其一种或多种的混合物的碳水化合物，
12.d)将发酵混合物在25至35℃的温度孵育7至13天；
13.e)过滤发酵混合物，以获得唤妍草种子的发酵提取物。
14.此外，本发明的另一个目的涉及一种通过根据本发明所述的方法获得的唤妍草种子的发酵提取物。
15.本发明还涉及一种化妆品组合物，其包含在生理学上可接受的介质中的唤妍草种子的发酵提取物。
16.本发明的另一个目的涉及一种用于护理和/或化妆角蛋白材料，特别是皮肤和/或嘴唇的美容方法，其包括在所述角蛋白材料上施用至少一层根据本发明所述的化妆品组合物。
17.最后，本发明涉及根据本发明的唤妍草种子的发酵提取物作为活性成分的美容用途，用于促进和/或刺激表皮更新、皮肤的脱屑、皮肤细胞的活力和/或皮肤细胞的凝聚力，和/或预防和/或减少皮肤老化的迹象，特别是紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皱纹和/或细纹的出现、皮肤干燥、皮肤屏障功能的改变、皮肤柔软度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。
附图说明
18.[图1]唤妍草种子的发酵提取物对兜甲蛋白表达的作用
[0019]
[图2]唤妍草种子的发酵提取物对丝聚合蛋白表达的作用
[0020]
[图3]唤妍草种子的发酵提取物对弹力素表达的作用
[0021]
[图4]唤妍草种子的发酵提取物对激肽释放酶5表达的作用
[0022]
[图5]唤妍草种子的发酵提取物对桥粒芯蛋白1表达的作用
[0023]
[图6]唤妍草种子的发酵提取物对转谷氨酰胺酶表达的作用
[0024]
[图7]唤妍草种子的发酵提取物对zo-1表达的作用
[0025]
[图8]唤妍草种子的发酵提取物对皮肤模型作用的组织学分析
[0026]
[图9]唤妍草种子的发酵提取物对皮肤弹性模量的作用
具体实施方式
[0027]
狭叶豆蔻(aframomum angustifolium)或唤妍草
[0028]
唤妍草原产于马达加斯加，是姜科植物狭叶豆蔻的果实。这种植物的特征在于根部具有非凡的再生能力，因为即使在切割和燃烧后它仍然可以生长。它是在马达加斯加森林火灾中被烧毁的土地上重新生长的先锋植物之一。
[0029]
在本发明的情况下，狭叶豆蔻或唤妍草的发酵提取物是从狭叶豆蔻或唤妍草植物的种子获得的。尽管此处使用表述“唤妍草种子”是为了简化，但这显然可以互换地指代狭叶豆蔻或唤妍草的种子。
[0030]
唤妍草种子的发酵提取物
[0031]
在发酵方法中使用唤妍草种子以产生唤妍草种子的发酵提取物，这是本发明的目
的。
[0032]
需要说明的是，在本说明书中，表述“发酵提取物”是指来自发酵方法的产物，以及任何经过附加步骤例如配制步骤(例如，通过加入防腐剂)的产物，所述发酵方法涉及有或没有过滤的发酵，因此涉及有或没有发酵介质的微生物生物质的发酵。
[0033]
根据一个特别的实施方案，根据本发明的唤妍草种子的发酵提取物为发酵提取物的水溶液的形式，其包含发酵干燥提取物、水和防腐剂。水溶液形式的发酵提取物在说明书中也称为“原料”，与“干物质”或发酵干燥提取物相对。
[0034]
根据一个特别的实施方案，发酵提取物的水溶液包含发酵提取物、水和防腐剂(优选甘油)，所述发酵提取物的活性含量(干物质)为相对于原料(发酵提取物的水溶液)的总重量以活性物质的重量计0.5至3％，尤其是1至2％，特别是1.2至1.7％。水含量通常为相对于原料(发酵提取物的水溶液)的总重量以重量计20至40％，尤其是25至30％，特别是27至29％，防腐剂含量(例如甘油)通常为相对于原料(发酵提取物的水溶液)的总重量以重量计60至80％，尤其是65至75％，特别是70％。
[0035]
因此，本发明还涉及一种溶液形式的唤妍草种子的发酵提取物，其包含以重量计1至2％的唤妍草种子的发酵提取物的活性物质、以重量计65至75％的甘油和以重量计25至30％的水。
[0036]
优选地，发酵提取物的水溶液，在下面阐明的表征中也称为“原料”，包含相对于原料(发酵提取物的水溶液)的总重量1.2至1.65％的发酵提取物的活性物质(干物质)、70％的甘油和28.35至28.8％的水。根据一个特别的实施方案，发酵提取物的水溶液，在下面阐明的表征中也称为“原料”，包含相对于原料(发酵提取物的水溶液)的总重量1.2至1.35％的发酵提取物的活性物质(干物质)、70％的甘油和28.65至28.8％的水。根据另一个特别的实施方案，发酵提取物的水溶液，在下面阐明的表征中也称为“原料”，包含相对于原料(发酵提取物的水溶液)的总重量1.35至1.65％的发酵提取物的活性物质(干物质)、70％的甘油和28.35至28.65％的水。
[0037]
根据一个特别的实施方案，唤妍草种子的发酵提取物具有相对于发酵提取物的干燥提取物(干物质)的重量以重量计大于0.005％，优选0.005至10％含量的奎宁酸，和大于0.5％，优选0.5至25％含量的乙酸。优选地，唤妍草种子的发酵提取物具有相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计0.01至5％，更优选0.05至2％含量的奎宁酸。优选地，唤妍草种子的发酵提取物具有相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计1至20％，更优选5至15％含量的乙酸。
[0038]
唤妍草种子的发酵提取物可以包含其他有机酸，例如柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸和琥珀酸。此外，唤妍草种子的发酵提取物尤其可以具有：
[0039]-相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计0.01至5％，优选0.05至2％，更优选0.1至1％，还更优选0.2至0.4％含量的柠檬酸，
[0040]-相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计大于0.5％，优选0.5至25％，更优选1至20％，还更优选1至15％含量的葡萄糖酸，
[0041]-相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计0.001至10％，优选0.005至5％，更优选0.01至2％，更优选0.01至1.5％含量的乳酸，
[0042]-相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计0.001至5％，优选0.005至1％，
更优选0.008至0.5％含量的苹果酸，和/或
[0043]-相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计0.001至5％，优选0.005至1％，更优选0.01至0.05％含量的琥珀酸。
[0044]
优选地，唤妍草种子的发酵提取物不包含葡萄糖醛酸或丙酸。
[0045]
唤妍草种子的发酵提取物还可以包含一种或多种防腐剂。术语“防腐剂”应指具有保护提取物的组合物或含有其的化妆品免受任何物理、化学和/或微生物改变的目的的化合物。优选地，至少一种防腐剂选自丁二醇、甘油、丙二醇、苯甲酸钠和山梨酸钾，更优选甘油。发酵提取物尤其可以包含一种或多种防腐剂，优选至少一种上述防腐剂，选自丁二醇、甘油和丙二醇，所述防腐剂的最终浓度为相对于总重量以重量计60至80％，优选65至75％，更优选70％。
[0046]
发酵方法
[0047]
通过发酵方法获得这种唤妍草种子的发酵提取物，所述发酵方法包括以下步骤：
[0048]
a)将微生物聚生体在包含碳水化合物和任选地茶叶的水提取物的溶液中在17至38℃的温度孵育，以获得微生物培养物；
[0049]
b)研磨狭叶豆蔻或唤妍草的种子以获得细粉；
[0050]
c)将所述粉末加入至包含微生物培养物和碳水化合物的发酵介质中，以获得发酵混合物；
[0051]
c)将发酵混合物在12至42℃的温度孵育2至20天；
[0052]
d)过滤发酵混合物，以获得唤妍草种子的发酵提取物；和，任选地，
[0053]
e)加入至少一种防腐剂。
[0054]
术语“发酵方法”应指能够通过在介质中培养如本文所定义的微生物聚生体来获得唤妍草种子的发酵提取物的方法，所述介质含有碳水化合物且能够使微生物聚生体生长。可以在不连续培养条件(“分批”)、连续培养条件或连续/不连续条件(“补料分批”)下进行发酵。可以在需氧、微需氧和/或厌氧的情况下进行发酵。
[0055]
术语“微生物聚生体”应指能够以稳定且可再现的方式共存的至少三物种微生物的集合体。
[0056]
有利地，微生物可以结合互补的活性。作为非限制性示例，第一物种对碳源的使用或同化可以产生代谢物，然后该代谢物可以被第二物种代谢。
[0057]
根据本发明的微生物聚生体包含：
[0058]
i)至少一种属于乳酸菌群的微生物，
[0059]
ii)至少一种属于酵母群的微生物，和
[0060]
iii)至少一种属于乙酸菌群的微生物。
[0061]
优选地，至少一种属于乳酸菌群的微生物为乳杆菌科(lactobacillaceae)乳杆菌目(lactobacillales)的微生物，尤其是属于乳杆菌属和片球菌属的那些，例如植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和/或嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)，更优选植物乳杆菌(l.plantarum)。
[0062]
优选地，至少一种属于酵母群的微生物为酵母科(saccharomycetaceae)酵母目(saccharomycetales)或裂殖酵母科(schyzosaccharomycetaceae)裂殖酵母目(schyzosaccharomycetales)的微生物，尤其是属于酵母属、裂殖酵母属或有孢圆酵母属的
那些。
[0063]
优选地，至少一种属于酵母群的微生物为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、戴尔凯氏有孢圆酵母(torulaspora delbrueckii)、鲍氏酵母(saccharomyces boulardii)和/或粟酒裂殖酵母(schyzosaccharomyces pombe)。
[0064]
优选地，至少一种属于乙酸菌群的微生物为醋杆菌科(acetobacteraceae)红螺菌目(rhodospirillales)的微生物，尤其是属于醋菌属、葡糖杆菌属或驹形杆菌属(也称为葡糖醋杆菌属(gluconacetobacter))的那些。乙酸菌可以来自于苹果醋或酸度水平为4％至5％的未经高温消毒的葡萄酒，优选根据欧盟定义标记为“有机农业”的市售苹果醋。优选地，将乙酸菌加入到聚生体中是通过将等份醋直接加入到包含其他微生物物种的组合物中来进行的。在醋中，除了占主导地位的乙酸菌之外，还存在复杂的天然固有菌群，其中一部分可以与加入的微生物共存。另一部分将在聚生体建立过程中下降，就像形成聚生体的微生物组合的共生生长阻止不期望的物种(包括致病物种)的生长一样。
[0065]
根据一个优选的实施方案，聚生体包含：
[0066]-至少一种属于乳杆菌属或片球菌属的乳酸菌，更优选选自植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌，
[0067]-至少一种属于酵母属、裂殖酵母属或有孢圆酵母属的酵母，更优选选自酿酒酵母、鲍氏酵母、粟酒裂殖酵母和戴尔凯氏有孢圆酵母，和
[0068]-至少一种来自苹果醋或葡萄酒醋的乙酸菌，优选属于醋菌属、葡糖杆菌属或驹形杆菌属。
[0069]
步骤a)：微生物培养物的制备
[0070]
在方法的第一步a)中，制备微生物培养物(也称为包含如上所述的微生物的聚生体)。该步骤有利地使得微生物被激活和繁殖，同时建立稳定且平衡的聚生体。在此步骤期间，将存在于聚生体中的各种微生物引入到包含碳水化合物(也称为“营养介质”)和任选地茶叶的水提取物的溶液中，以产生微生物混悬液。然后将混悬液孵育1至21天，以制备微生物培养物(也称为聚生体)。
[0071]
溶液包含至少一种碳水化合物，通常一种或多种单糖或二糖。其可以为纯糖，例如蔗糖、葡萄糖或果糖，或者可以为转化的或共同生产的产品，例如糖蜜。此外，根据优选的实施方案，溶液包含选自蔗糖、葡萄糖或果糖、糖蜜或其一种或多种的混合物的碳水化合物。碳水化合物优选是蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物。优选地，至少一种碳水化合物以溶液中20g/l至100g/l，优选50至95g/l的浓度存在。优选地，营养介质包含浓度为50g/l的蔗糖，或葡萄糖和果糖的混合物。
[0072]
根据一个特别的实施方案，溶液可以进一步包含茶叶(茶(camellia sinensis))的水提取物。优选地，通过浸泡茶叶，优选红茶叶获得水提取物。优选地，茶叶的水提取物可以是用2g/l至50g/l的茶叶，更优选地用5g/l至10g/l的茶叶制备的红茶浸液。
[0073]
将干叶放入70℃至90℃温度的水中浸泡10至60分钟制备茶。优选地，使用5g/l至10g/l的茶叶，在80℃浸泡15分钟。浸液可以与叶子一起使用，或者更方便地，过滤水相。
[0074]
可以将微生物以干和/或湿的形式引入营养介质中；特别地，接种水平可以为103cfu/g至105cfu/g溶液。然后，可以在12℃至45℃，优选25℃至35℃，更优选25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，还更优选26℃孵育微生物混悬液。根据
一个特别有利的实施方案，孵育在开放反应器中进行，无需确保无菌条件。
[0075]
可以将混悬液孵育1至21天，优选1至10天，更优选3至4天，还更优选3天或4天。在孵育期结束时，混悬液中的总菌群可以为104至107cfu/g。
[0076]
由此获得的聚生体能够在水性介质中与天然底物例如唤妍草种子反应。有利地，它能够引导唤妍草种子的提取发酵，以便使其含有的多种化合物可被利用，并可以转化。
[0077]
步骤b)：制备唤妍草种子
[0078]
在步骤b)中，将唤妍草种子研磨直至获得细粉。该粉末的颗粒有利地具有0.01至1mm，优选100μm至1mm，更优选250至500μm，还更优选500μm的平均尺寸。种子优选是生的。优选在研磨之前将种子干燥。
[0079]
步骤b)同样可以在步骤a)之前、同时或之后进行。
[0080]
步骤c)：制备发酵混合物
[0081]
在方法的步骤c)中，将步骤b)中获得的唤妍草种子的粉末加入到包含步骤a)中获得的微生物培养物以及碳水化合物的发酵介质中，以获得发酵混合物。
[0082]
优选以102cfu/g至104cfu/g发酵介质的比例将微生物培养物加入至发酵介质。优选地，以相对于发酵介质的重量以重量计0.5％至15％，优选0.75至10％，更优选5％的浓度将微生物培养物加入到发酵介质中。
[0083]
优选以1至75g种子每升发酵介质(g/l)，优选10至60g/l，更优选12至50g/l，还更优选12g/l或50g/l的浓度将粉末形式的唤妍草种子加入到发酵介质中。换言之，以相对于发酵介质的总体积以重量计0.1至7.5％，优选1至6％，更优选1.2至5％，还更优选1.2或5％的浓度将粉末形式的唤妍草种子加入到发酵介质中。
[0084]
发酵介质还包含碳水化合物，优选选自蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜或其一种或多种的混合物。
[0085]
根据一个特别的实施方案，溶液可以包含茶叶的水提取物，如上所述。优选地，通过浸泡茶叶，优选红茶叶获得水提取物。
[0086]
为了促进碳水化合物在发酵介质中的溶解，可以在加入碳水化合物之前或之后加热发酵介质，例如在25℃至90℃，优选35℃的温度。优选地，在加热发酵介质的情况下，这在加入微生物培养物之前或甚至在小于或等于45℃，优选小于或等于35℃的温度下进行，如果在加入培养物之后的话。
[0087]
步骤d)：孵育
[0088]
在方法的下一步骤d)中，然后孵育步骤c)中获得的发酵混合物以确保唤妍草种子的发酵。
[0089]
在12℃至45℃，优选25℃至35℃，更优选25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，还更优选26℃的温度进行孵育。孵育进行2至20天，优选7至13天，更优选7、8、9、10、11、12或13天，还更优选10天。
[0090]
根据一个特别的方面，孵育在开放反应器中进行，无需确保无菌条件。根据一个特别的方面，在20％至60％，优选30％至50％，更优选40％的湿度水平下进行孵育。
[0091]
步骤e)：过滤
[0092]
然后，在步骤e)期间过滤发酵混合物。这里，术语“过滤”应指能够分离固体级分和液体级分的步骤。固体级分可以特别地包含残余的唤妍草种子和/或微生物。有利地，过滤
可以去除混合物中存在的所有微生物，以获得唤妍草种子的无菌发酵提取物。可以使用一个或多个筛子和/或过滤器进行过滤。此外，根据一个实施方案，步骤e)对应于一个或多个过滤步骤，优选包括至少一个筛分步骤和/或至少一个除菌过滤步骤。优选地，步骤e)包括筛分步骤和除菌过滤步骤。优选地，在平均孔径为0.1μm至0.2μm，优选0.2μm的过滤器上进行除菌过滤。有利地，筛分可以去除粉末状碎片。有利地，除菌过滤可以快速且廉价地去除任何细胞碎片。优选地，至少一个过滤器为纤维素过滤器。
[0093]
步骤f)：浓缩和/或配制(任选的)
[0094]
上述方法可以获得澄清的唤妍草种子的发酵提取物。然而，在某些情况下，进行一个或多个附加步骤可能是有利的，例如浓缩或配制。因此，根据本发明的方法可以进一步包括在步骤e)之后的至少一个浓缩或配制的附加步骤。
[0095]
在一个特别的实施方案中，根据本发明的方法在过滤步骤f)之后进一步包括一个或多个以下步骤，其特别地旨在将组合物调整为特定的制剂：
[0096]-浓缩步骤；和/或
[0097]-配制步骤。
[0098]
上面标识的每个任选步骤可以作为方法的独立的附加步骤存在，或者与一个或多个其他任选步骤组合。发酵方法优选包括向唤妍草种子的发酵提取物加入至少一种防腐剂的步骤f)。所述防腐剂优选选自丁二醇、甘油、丙二醇、苯甲酸钠和山梨酸钾，更优选甘油。在某些情况下，可以将至少两种防腐剂加入到唤妍草种子的发酵提取物中。优选将防腐剂以相对于溶液的形式的提取物的总重量以重量计50至80％，优选65至75％，更优选70％的最终浓度加入至步骤f)的唤妍草种子的发酵提取物中。当将防腐剂以50至80％的最终浓度加入到步骤e)的唤妍草种子的发酵提取物中时，所述防腐剂选自丁二醇、甘油和丙二醇。
[0099]
优选地，在过滤步骤e)结束时或在步骤e)之后存在附加步骤时在任何其他步骤结束时，将唤妍草种子的发酵提取物保存在约4℃(4
±
2℃)和/或黑暗中。当方法包括加入至少一种防腐剂时，优选将唤妍草种子的发酵提取物保存在环境温度。
[0100]
唤妍草种子的发酵提取物在国际命名法inci下给出标记：“水、甘油、狭叶豆蔻种子提取物、乳杆菌属发酵裂解物、酵母发酵提取物”。尤其地，该产品包含在水/甘油混合物中的以重量计1.2至1.65％的唤妍草种子的发酵提取物的干燥提取物。
[0101]
化妆品组合物
[0102]
令人惊讶地，发明人已经证明，唤妍草种子的发酵提取物在体外对皮肤有有益作用，特别是增加成纤维细胞的数量和/或密度，以及参与皮肤机械坚固性、更新和弹性的各种蛋白质(例如弹力素、桥粒芯蛋白1和兜甲蛋白)的表达。因此，唤妍草种子的发酵提取物可以对抗与年龄和/或应激相关的皮肤老化体征，特别是紧致度和/或弹性的降低以及皮肤屏障功能的改变。
[0103]
根据本发明，唤妍草种子的发酵提取物以有效获得期望效果的量使用。它可以按原样使用，或者有利地掺入适合局部施用在角蛋白材料上的化妆品组合物中。
[0104]
特别地，唤妍草种子的发酵提取物按原样使用或存在于化妆品组合物中。
[0105]
此外，本发明的另一个目的涉及一种化妆品组合物，其包含在生理学上可接受的介质中的根据本发明的唤妍草种子的发酵提取物。
[0106]
术语“化妆品组合物”应指用于美容目的(即审美目的)的任何组合物，其可以与人
体的表面部分，更特别地与角蛋白材料(特别是人皮肤和/或嘴唇)接触。
[0107]
术语“生理学上可接受的介质”应指适合于局部使用，与角蛋白材料接触且没有毒性、不相容性、不稳定性和/或过敏反应风险的任何赋形剂。
[0108]
根据本发明的术语“角蛋白材料”应指皮肤和/或其附属器，更特别地指人皮肤和/或嘴唇。特别地，它涉及面部和/或颈部和/或身体的皮肤，以及嘴唇。
[0109]
根据本发明的角蛋白材料特别地为健康的角蛋白材料(“健康”受试者)，即不表现出可能是病理状况的一部分的疾病或病症(受病状影响的“不健康”受试者)。在说明书的其余部分中，健康的皮肤和/或嘴唇或者皮肤和/或嘴唇将可互换地被提及。
[0110]
唤妍草种子的发酵提取物以相对于组合物的总重量以原料(根据上面描述的方法获得的发酵提取物溶液)的重量计0.0001％至5％，优选0.0005％至2％，更优选0.001％至1％的水平存在于本发明的组合物中。因此，唤妍草种子的发酵提取物以相对于组合物的总重量以活性物质(唤妍草种子的发酵提取物)的重量计0.0000012％至0.0825％，优选0.000006％至0.033％，更优选0.000012％至0.0165％的水平存在于本发明的组合物中。
[0111]
有利地用于本发明的组合物中的附加成分可以以相对于组合物的总重量以(原料的)重量计0.0001％至10％，优选0.001％至5％的水平存在。
[0112]
生理学上可接受的介质通常占相对于所述组合物的总重量以重量计1至99％。根据本发明的组合物的生理学上可接受的介质包含水和任选的防腐剂，例如先前定义的防腐剂。
[0113]
在一个特别的实施方案中，根据本发明的包含唤妍草种子的发酵提取物的所述化妆品组合物是用于护理和/或化妆角蛋白材料，特别是皮肤和/或嘴唇，尤其是面部和/或颈部皮肤的组合物。
[0114]
本发明的化妆品组合物通常进一步包含唤妍草种子的发酵提取物和生理学上可接受的介质、一种或多种本领域技术人员已知的化妆品上可接受的赋形剂，以获得用于局部施用的组合物，例如乳液、霜剂、发蜡、油包水或水包油乳剂、油膏、棒、凝胶、洗剂、精华素或粉末的形式。
[0115]
本发明的化妆品组合物还可以以贴剂或面膜，尤其是厚霜剂形式的面膜的形式存在，或者以用唤妍草种子的发酵提取物或包含其的组合物浸渍的纤维素面膜的形式存在。
[0116]
在一个优选的实施方案中，所述组合物为霜剂、乳剂、溶液、混悬液、凝胶、乳液、洗剂或精华素的形式。当组合物为乳剂的形式时，乳剂可以是水包油乳剂、油包水乳剂或多重乳剂。
[0117]
本发明的化妆品组合物可以为适合于局部施用在角蛋白材料，特别是皮肤和/或嘴唇的角蛋白材料，特别是面部和/或颈部的皮肤上的盖伦形式，其包含唤妍草种子的发酵提取物和至少一种化妆品成分，所述化妆品成分选自抗氧化剂、香料、维生素、增稠剂、润肤剂、保湿剂、抗老化剂、提升剂、紧致剂、丰盈剂、舒缓剂、抗污染剂、提亮剂或脱色剂、填充剂、珍珠母及其混合物。
[0118]
此外，根据本发明的优选目的，化妆品组合物可以进一步包含至少一种化妆品助剂，所述化妆品助剂选自抗氧化剂、润肤剂、保湿剂、抗老化剂及其混合物。
[0119]
根据组合物的性质，一种或多种化妆品上可接受的赋形剂选自乳化剂、聚合物、表面活性剂、流变剂、电解质、ph调节剂、抗氧化剂、防腐剂、染料及其混合物。
[0120]
作为特别的示例，化妆品组合物可以包含亲水性胶凝剂、抗氧化剂、防腐剂及其混合物。
[0121]
美容方法
[0122]
本发明的另一个目的为一种用于护理和/或化妆角蛋白材料，特别是皮肤和/或嘴唇，尤其是面部和/或颈部皮肤的美容方法，其包括在所述角蛋白材料上局部施用至少一层如根据本发明所述的唤妍草种子的发酵提取物或包含所述发酵提取物的化妆品组合物。
[0123]
本发明的美容方法特别地旨在促进和/或刺激表皮更新、皮肤的脱屑、皮肤细胞的活力和/或皮肤细胞的凝聚力，和/或预防和/或减少皮肤老化的迹象，特别是紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皱纹和/或细纹的出现、皮肤干燥、皮肤屏障功能的改变、皮肤柔软度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。
[0124]
术语“促进和/或刺激表皮更新”应指唤妍草种子的发酵提取物旨在促进角化细胞分化。
[0125]
术语“促进和/或刺激皮肤的脱屑”应特别地指唤妍草种子的发酵提取物旨在促进皮肤细胞和组织，特别是皮肤和/或嘴唇的更新和发育。
[0126]
术语“促进和/或刺激皮肤细胞的活力”应特别地指唤妍草种子的发酵提取物旨在促进皮肤的总体状况及其光泽。
[0127]
术语“预防和/或减少皮肤老化的迹象”应特别地指唤妍草种子的发酵提取物旨在减少和/或减缓紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皮肤干燥、柔软度的降低和/或皱纹和/或细纹的出现。
[0128]
术语“防止和/或减少肤色的均匀性或光泽的改变”应特别地指唤妍草种子的发酵提取物旨在减少和/或减缓皮肤瑕疵或微细纹、环形印迹、浑浊、暗沉和/或不均匀肤色的出现。
[0129]
术语“防止和/或减少皮肤屏障功能的改变”应特别地指唤妍草种子的发酵提取物旨在减少和/或减缓皮肤完整性的变化，这可能与例如细胞之间和/或细胞与细胞外基质之间的相互作用的变化有关，这些变化能够改变皮肤屏障的各种功能(例如机械、水分、抗氧化功能等)。
[0130]
根据一个特别的实施方案，将根据本发明的所述唤妍草种子的发酵提取物或含有其的所述化妆品组合物施用于老化或显示出老化迹象的皮肤和/或暴露于应激的皮肤，优选老化或显示出老化迹象的皮肤。
[0131]
术语“暴露于应激的皮肤”应指皮肤受到内源性或外源性应激，特别是能够诱发非病理性、难看的皮肤反应的机械或化学应激；例如，皮肤明显疲劳和/或对刺激更加敏感。
[0132]
施用本发明的组合物的皮肤和嘴唇是健康的，即没有表现出可能是病理状况的一部分的疾病或病症(受病理学影响的“不健康”受试者)。
[0133]
有利地，在本发明的美容方法中使用的包含唤妍草种子的发酵提取物的组合物是如上所述的那些。
[0134]
唤妍草种子的发酵提取物的用途
[0135]
本发明的另一个目的涉及根据本发明的唤妍草种子的发酵提取物用于局部施用在角蛋白材料，特别是皮肤和/或嘴唇，特别是面部和/或颈部的皮肤上作为化妆品活性成分的美容用途，旨在用于促进和/或刺激表皮更新、皮肤的脱屑、皮肤细胞的活力和/或皮肤
细胞的凝聚力，和/或预防和/或减少皮肤老化的迹象，特别是紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皱纹和/或细纹的出现、皮肤干燥、皮肤屏障功能的改变、皮肤柔软度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。
[0136]
实施例
[0137]
本发明通过以下非限制性实施例进行阐明。除非另有说明，百分比以相对于组合物的总重量以原料的重量计来表示。
[0138]
实施例1：用于发酵唤妍草种子的方法
[0139]
材料和方法
[0140]
微生物聚生体
[0141]
组成聚生体的微生物包括：
[0142]-至少一种属于乳杆菌属或片球菌属的乳酸菌，
[0143]-至少一种属于酵母属、裂殖酵母属或有孢圆酵母属的酵母，和
[0144]-至少一种属于醋菌属、葡糖杆菌属或驹形杆菌属的乙酸菌。
[0145]
制备唤妍草种子
[0146]
将唤妍草的生种子研磨，以获得由平均尺寸为约250至500μm的颗粒组成的粉末。
[0147]
制备营养介质
[0148]
由5g/l至10g/l的茶叶在70℃至90℃浸泡10至60分钟来制备茶。然后，将蔗糖以20g/l至100g/l，通常50g/l的浓度溶解在水相中。蔗糖尤其可以被葡萄糖和果糖的混合物替代。
[0149]
发酵方法
[0150]
根据包括以下步骤的方法进行唤妍草种子的发酵：
[0151]
a)将微生物聚生体在包含碳水化合物和红茶叶的水提取物的溶液(也称为“营养介质”)中在26℃孵育3至4天以获得培养物；
[0152]
b)如上所述，研磨唤妍草种子以获得细粉；
[0153]
c)向包含脱氯水和碳水化合物的发酵介质中加入：
[0154]-唤妍草种子的粉末，浓度为相对于发酵介质的升以重量计1.2％或5％，和
[0155]-步骤a)中获得的培养物，浓度为相对于发酵介质的重量以重量计5％，以获得发酵混合物；
[0156]
d)将步骤c)获得的发酵混合物在发酵罐中在26℃孵育10天；
[0157]
e)通过粗筛过滤发酵混合物，然后在平均孔径为0.2μm的纤维素过滤器上过滤，以获得唤妍草种子的发酵提取物，和
[0158]
f)将甘油加入到唤妍草种子的发酵提取物中，最终浓度为相对于总重量以重量计70％。
[0159]
结果
[0160]
以溶液形式获得唤妍草种子的发酵提取物，浓度以重量计为1.2至1.35％的发酵唤妍草种子的活性材料，70％的甘油和28.65至28.8％的水。可替代地，以溶液形式获得唤妍草种子的发酵提取物，浓度以重量计为1.35至1.65％的发酵唤妍草种子的活性材料，70％的甘油和28.35至28.65％的水。
[0161]
由步骤c)中相对于发酵介质的升以重量计1.2％(即12g/l)的浓度的唤妍草种子
获得的唤妍草种子的发酵提取物在下文中称为提取物“l3”。
[0162]
由步骤c)中相对于发酵介质的升以重量计5％(即50g/l)的浓度的唤妍草种子获得的唤妍草种子的发酵提取物在下文中称为提取物“l2”。
[0163]
这些提取物的效果将在以下实施例中阐明。
[0164]
实施例2：唤妍草种子发酵提取物的表征
[0165]
材料和方法
[0166]
通过hplc分析定量有机酸
[0167]
在agilent 1260dad ms hplc上进行测定。
[0168]
提取物以0.02％进样，用0.1％ hcooh稀释至1/50(称量20μl量足以配成1ml)
[0169]
上述获取方法中的参数如下：
[0170]
进样体积：5μl
[0171]
温度：30℃
[0172]
柱：phenomenex hydro-rp 150x4.6 mm 4μm(no.8)
[0173]
溶剂：
[0174]
等度100％ a:h2o+0.1％甲酸
[0175]
流速：0.400ml/min
[0176]
分析的持续时间25分钟
[0177]
rmn
[0178]
离心分配色谱法(cpc)
[0179]
将唤妍草种子的发酵提取物冻干以减少水量。进样质量约为4g。
[0180]
柱平衡后，将唤妍草种子的发酵提取物溶解在11ml下相+6ml上相中，经由20ml样品环注入cpc柱(303ml柱，仪器(rousselet robatel kromaton))。以上升模式泵送流动相65分钟。通过切换模式选择阀来挤出柱持续10分钟。流速为20ml/min，柱的旋转速度为1300rpm。两相溶剂系统对应于乙酸乙酯/乙腈/水(3/3/4，v/v)。固定相对应于两相溶剂系统的下相(上升模式)，流动相对应于两相溶剂系统的上相。
[0181]
在整个实验过程中(洗脱和挤出)收集20ml级分，并根据其薄层色谱图进行合并。由此，获得10个级分。
[0182]
主要代谢物的鉴定。
[0183]
将f1至f10各级分的等份试样溶解在700μl的dmso-d6中，在配备冷冻探针的bruker avance aviii-600波谱仪(卡尔斯鲁厄，德国)上于298k通过
13
c rmn进行分析。处理波谱后，使用natexplore开发的计算机脚本自动采集所有
13
c rmn信号的绝对强度，将其分组到一系列级分的波谱中。对所得的表格进行层次组分析(permutmatrix，1.9.3，lirmm，蒙彼利埃，法国)。所得的
13
c rmn化学位移簇在二维图上以树状图的形式查看。为了鉴定代谢物，将hca获得的每个
13
c rmn化学位移簇手动提交至acd/nmr workbook suite 2012(acd/labs，安大略省，加拿大)数据库管理软件的结构搜索引擎，所述软件包含低分子量天然产物的结构和预测的化学位移。对含有假定已鉴定化合物的级分进行2d rmn实验(hsqc、hmbc和cosy)，以在去重复过程结束时确认数据库提出的分子结构。
[0184]
结果
[0185]
发酵方法产生唤妍草种子的发酵提取物，所述发酵提取物具有与唤妍草的非发酵
提取物(例如用100％水提取的非发酵的唤妍草的水提取物)非常不同的组成。
[0186]
特别地，唤妍草种子的发酵提取物包含各种有机酸，如下表1所示。
[0187]
表1：狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物中存在的有机酸与唤妍草的水提取物(未发酵)的比较(以相对于干燥提取物的g以mg计)
[0188]
[表1]
[0189][0190]
nd：未检测到
[0191]
实施例3：唤妍草种子的发酵提取物对皮肤蛋白表达的作用
[0192]
评价唤妍草种子的发酵提取物对皮肤屏障功能、表皮凝聚力、皮肤弹性和光泽的各种蛋白质标志物表达的作用。
[0193]
材料和方法
[0194]
khn的培养和处理
[0195]
将正常人角化细胞(khn)接种到tpp150烧瓶中，加入epilife介质。将khn在融合前进行胰蛋白酶处理(0.05％胰蛋白酶-edta，gibco-invitrogen)，用含有血清的介质中和。然后，将它们接种到96孔成像板(μ-板96孔，ibitreat，ibidi)中，每孔接种10000个细胞。
[0196]
融合时，khn在含有500μm的cacl2(0.2ml/孔)的完全epilife介质中用唤妍草种子的发酵提取物l2或l3进行处理。l2和/或l3提取物以0.02％和/或0.1％v/v的浓度进行测试。处理进行3或5天，48小时后更换培养介质。对于对照(未经处理)条件，将介质替换为含有500μm的cacl2的新介质。
[0197]
标记细胞
[0198]
在处理结束时，用福尔马林(10％相互缓冲福尔马林溶液，sigma)固定细胞10分钟，然后用0.1％ pbs-triton溶液(triton x-100，sigma)使其可渗透。然后，将它们用1％ pbs/bsa(pbs：磷酸盐缓冲盐水溶液；bsa：牛血清白蛋白)在环境温度下饱和30分钟。然后，将1％ pbs/bsa溶液替换为与稀释在1％ pbs/bsa中的每种标记蛋白(见表2)相对应的一抗溶液。将板在4℃孵育过夜。
[0199]
在用pbs冲洗后，根据要靶向的一抗，用在1％ pbs/bsa中稀释的1/300的二抗溶液(抗兔或抗小鼠山羊抗体，来自invitrogen的alexa fluor 568)和在1％pbs/bsa中稀释的1/500的dapi(4’,6
’‑
二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐，invitrogen molecular probes)覆盖细胞。将板在黑暗中在环境温度下孵育一小时。
[0200]
在先后用pbs、蒸馏水冲洗后，将pbs以1ml的量沉积到每个孔中。将板在黑暗中保存在4℃，直到获取图像。
[0201]
表2：所使用的一抗的总结[表2]
[0202][0203]
hcs图像采集和分析
[0204]
使用thermo cellomics的“arrayscan xti”扫描板。
[0205]
采集条件：
[0206]
检测：
[0207]
dapi：过滤器xf53_386_23
[0208]
alexa fluor 568：过滤器xf53_572_15
[0209]
分辨率：1104x 1104
[0210]
镜头：10x干式
[0211]
图像数量：25张每孔
[0212]
使用“spot detector”图像分析软件对图像进行分析，所述软件检测与目标蛋白表达相对应的红色标记。测量区域的表面被定义为图像的整个表面。通过检测蓝色标记对核心进行计数来确定细胞的数量。
[0213]
根据标记物及其细胞表达，结果可以表示为：
[0214]-检测到的标记强度(阈值)/细胞数量
[0215]-总视野中的标记强度/细胞数量
[0216]
通过student检验测量对照和处理样品之间观察到的各种比例的显著性(*p《0.05，**p《0.01)。
[0217]
结果
[0218]
3.1.兜甲蛋白的表达
[0219]
兜甲蛋白是一种在角质层表达的结构蛋白，有助于皮肤的屏障功能。
[0220]
唤妍草种子的发酵提取物显著增加了兜甲蛋白的表达，其中当提取物的浓度增加
时观察到剂量效应(对于浓度为0.02％的提取物l2为+41％，对于浓度为0.1％的提取物l2为+57％，p《0.01，参见图1)。
[0221]
3.2.丝聚合蛋白的表达
[0222]
与兜甲蛋白一样，丝聚合蛋白是一种参与皮肤屏障功能的蛋白质。
[0223]
唤妍草种子的发酵提取物显著增加了丝聚合蛋白的表达，其中当提取物的浓度增加时观察到剂量效应(对于浓度为0.1％的提取物l3为+7.5％，对于浓度为0.1％的提取物l2为+17.8％，p《0.01，参见图2)。
[0224]
3.3.弹力素的表达
[0225]
弹力素是一种参与皮肤屏障功能的蛋白质。它还对弹性蛋白酶有抑制作用，从而防止弹性纤维的降解。
[0226]
唤妍草种子的发酵提取物显著增加了弹力素的表达，其中当提取物的浓度增加时观察到剂量效应。事实上，对于浓度为0.02％的提取物l3，表达增加+38.9％，对于浓度为0.1％的提取物l3，表达增加+52.6％(p《0.05，参见图3)。类似地，对于浓度为0.02％的提取物l2，表达增加+37％，对于浓度为0.1％的提取物l2，表达增加+45.8％(p《0.05，参见图3)。
[0227]
3.4.激肽释放酶5的表达
[0228]
激肽释放酶5是一种参与皮肤稳态和脱屑的蛋白质。它还有助于皮肤的光泽。
[0229]
唤妍草种子的发酵提取物显著增加了激肽释放酶5的表达(对于浓度为0.02％的提取物l3为+15.2％，对于浓度为0.1％的提取物l3为+11％，p《0.05，参见图4)。
[0230]
3.5.桥粒芯蛋白1的表达
[0231]
桥粒芯蛋白1是表皮完整性所必需的蛋白质，通过其在细胞内连接(桥粒)内的粘附功能提供表皮结构。它还促进角化细胞的分化。
[0232]
唤妍草种子的发酵提取物显著增加了桥粒芯蛋白1的表达(对于浓度为0.02％的提取物l3为+30.4％，对于浓度为0.02％的提取物l2为+17％，p《0.01，参见图5)。
[0233]
3.6.转谷氨酰胺酶的表达
[0234]
转谷氨酰胺酶是一种参与结构蛋白交联以在表皮中形成角质层的酶。因此，它有助于皮肤的屏障功能。
[0235]
唤妍草种子的发酵提取物显著增加了转谷氨酰胺酶的表达(对于浓度为0.1％的提取物l2为+73.8％，对于浓度为0.1％的提取物l3为+97.6％，p《0.01，参见图6)。
[0236]
3.7.zo-1的表达
[0237]
zo-1是一种细胞内蛋白质，参与皮肤细胞之间紧密连接的形成。因此，它有助于皮肤的屏障功能和完整性。
[0238]
唤妍草种子的发酵提取物显著增加了zo-1的表达(对于浓度为0.1％的提取物l2为+25.8％，对于浓度为0.1％的提取物l3为+49.7％，p《0.01，参见图7)。
[0239]
结论
[0240]
两种唤妍草种子的发酵提取物l2和l3已在培养的正常人角化细胞模型上测试了表皮分化标志物的表达，特别是为了确定它们对皮肤屏障的活性。
[0241]
提取物对皮肤屏障标志物的表达具有积极作用，例如弹力素(参与角质层的构成)或桥粒芯蛋白1(桥粒连接的组分)。此外，提取物l3增加参与皮肤的稳态和脱屑的激肽释放酶5的表达。
[0242]
实施例4：唤妍草种子的发酵提取物对皮肤模型的作用
[0243]
已经在去除干细胞的皮肤模型中评价了根据本发明的唤妍草种子的发酵提取物对皮肤的弹性、紧致度和细胞密度的作用。
[0244]
材料和方法
[0245]
建立重建、生物打印、去除表皮干细胞(cse)的皮肤模型
[0246]
通过挤出进行乳头状和网状真皮的生物打印
[0247]
将进入生物墨水组合物中的粉末溶解在无钙dmem中，在37℃搅拌过夜。
[0248]
第二天，年轻或年老的乳头状/网状成纤维细胞在汇合时进行胰蛋白酶处理并计数。对所需数量的细胞进行取样，每毫升制备的墨水含有250000个成纤维细胞，然后离心。将细胞沉淀直接混悬在适当体积的生物墨水中。然后，将生物墨水/细胞混合物转移到安装在20号插管上的无菌注射器中。
[0249]
使用slic3r(gnu affero general public license)和repetier(hot-world gmbh&co.kg)软件对打印对象进行建模。乳头状真皮层和网状真皮层分两个阶段打印，一个在另一个之上。打印“年老”真皮和“年轻”真皮。
[0250]
在第一阶段，使用含有乳头状成纤维细胞的墨水打印尺寸为1.5cm x 1.5cm x0.2cm的立方体。这些物体的高度对应于两个叠加层。在第一次打印之后，尺寸为1.5cm x 1.5cm x 0.1cm(相当于1层)的立方体被打印在第一个2层立方体上方。然后，将这些结构放置在钙和凝血酶溶液中1小时，使生物墨水聚合和固结。在用生理盐水缓冲液冲洗3次后，将同等真皮在mcf(labskin creations的内部制剂，适合成纤维细胞培养的介质)中培养，置于培养箱(37℃，5％ co2)中，然后培养7天，然后将分选的角化细胞接种在其表面。每2天更新培养介质。
[0251]
根据培养物中原代角化细胞的cd71标记物进行磁力分选
[0252]
首先，将第1代解冻的成体原代角化细胞放入培养瓶中的mck培养介质(labskin creations的内部制剂，适合角化细胞培养的介质)中。在扩增一周后，在汇合时，对细胞进行胰蛋白酶处理然后计数。所有这些细胞均根据制造商的说明使用磁珠试剂盒cd71 130-046-201(miltenyi)进行分选。
[0253]
简而言之，将角化细胞与磁珠以规定的细胞/磁珠体积比例在+4℃孵育15分钟。然后，将该混合物离心，然后去除上清液以去除未与目标细胞结合的磁珠。将角化细胞沉淀混悬在培养介质中，并通过安装在为此目的提供的磁体上的磁柱。首先，在无菌管中收集阴性级分，所述阴性级分含有不表达表面标记物cd71的细胞，对应于富含未保留在柱中的表皮干细胞的群体。
[0254]
此后，将柱从磁性支持物上取下并冲洗，从而收集表达与磁珠结合的表面标记物cd71的细胞(去除干细胞的级分)。对富集细胞和去除细胞的级分进行计数，以计算cd71-/cd71+的比例。
[0255]
与该提取并行，先前培养的包皮角化细胞也经过胰蛋白酶处理并计数，以在同一天接种到真皮上。这些形成了“年轻对照”。
[0256]
将角化细胞cd71+接种到生物打印的真皮上
[0257]
在进行磁力分选并对各个级分进行计数后，去除“年轻”和“年老”生物打印真皮的培养介质。
[0258]
将500000个角化细胞cd71+的等同物沉积在年老真皮的表面。对包皮角化细胞混悬液进行同样的操作，将其接种在“年轻对照”真皮表面，作为参比。
[0259]
在+37℃粘附30分钟后，使用介质浸没真皮表皮集合体。
[0260]
将真皮表皮集合体在mck介质中培养3天，使角化细胞增殖。然后，将它们在空气/液体界面处培养，以启动表皮的分化。该最后的培养步骤持续一周，以获得多层但未完全成熟的表皮。
[0261]
将提取物l2或l3加入至培养介质中。然后，将介质过滤以避免任何污染风险。然后，在培养的最后5天中每天将提取物施用于细胞培养物(培养在第35天停止)。
[0262]
将样品固定在4％缓冲福尔马林溶液(alphapath，法国)中，然后包埋在石蜡中。
[0263]
用苏木精根皮红藏红花进行组织学染色
[0264]
制备5μm石蜡切片。去除石蜡并再水化后，用苏木精-根皮红-藏红花(hps)对样品进行染色。
[0265]
石蜡包埋切片的免疫荧光
[0266]
在5微米和20微米厚的切片上产生抗整合素α6标记。在加热揭开后，进行饱和步骤，其中4％ pbs/bsa封闭非特异性抗原位点。然后，将细胞与1/10000的整合素α6抗原的特异性一抗(兔单克隆抗体，abcam)孵育过夜，然后，与稀释至1/1000的二抗alexa-fluor 568抗兔(thermo fisher scientific，ma，美国)和hoechst核染色剂(thermo fisher scientific)孵育过夜。平行地制备不含一抗的阴性对照。
[0267]
图像采集
[0268]
使用光学显微镜系统axio observer d1/高分辨率相机axiocam(zeiss，the pecq，法国)观察组织学染色和免疫组织学标记。使用zen pro 2012软件获取图像，并以“tif”格式(高分辨率)保存。
[0269]
原子力显微镜(afm)数据的采集
[0270]
所使用的afm为resolve biscope(bruker)，其上安装了落射荧光显微镜(leica dmi8)，使得可以进行相关研究(afm图像/荧光)。
[0271]
使用qnm/fast-force体积模式。所选的afm探针的理论刚度常数为0.4n/m，曲率半径《10nm。在每次使用之前，在蓝宝石上测量探头的偏转灵敏度，并使用热噪声方法校准其刚度常数。由于在冷冻切片上进行了抗整合素α6免疫标记，afm的杠杆位于可见的真皮表皮连接处(jde)。
[0272]
完整的afm分析由在水性条件(pbs1x)下采集目标区域(jde)的力体积组成。
[0273]
用于采集的参数为：
[0274]-力/体积矩阵：20μm x 20μm-64px2
[0275]-力曲线：力＝20nn-斜坡尺寸＝10μm
[0276]
对于真皮的afm成像，还使用了力-体积模式。切片的各个区域都需要力体积，其参数与之前相同。
[0277]
定量分析：弹性模量(ea)的提取
[0278]
使用biomeca analysis(biomeca)处理软件进行原始力曲线中的ea的定量。
[0279]
对每个切片获得的原始接近曲线进行处理，以提取jde的ea(刚性)的精确量化。此处，sneddon理论模型适用于0至1μm的压痕。使用各种力矩阵，提取每个切片的真皮表皮连
接处的弹性变化。统计分析：年轻对照相比于年老去除的未处理的cse：t检验，$$$p《0.001；年老去除的未处理的cse相比于年老去除的经0.05％或0.1％的l3处理的cse：t检验，***p《0.001。
[0280]
结果
[0281]
4.1.组织学分析
[0282]
用唤妍草种子的发酵提取物(l2或l3，浓度为0.05或0.1％)处理能够获得细胞化的真皮，其具有比未处理样品中观察到的更大的新合成成纤维细胞层。表皮也具有改善的结构：它们看起来更厚，具有非常清晰的基底组织和结构化的jde。该区室的分化并未因提取物的施用而受到干扰，相反，在所有条件下都存在角质层。最后，唤妍草种子的发酵提取物l3似乎显示出剂量效应，在剂量为0.1％时，真皮表皮连接处有较厚的成纤维细胞层。
[0283]
4.2.免疫标记
[0284]
对整合素α6表达谱的分析使得能够对含有表皮干细胞群的表皮基底部分进行更精确的研究。用浓度为0.05或0.1％的唤妍草种子的发酵提取物l3处理重建的去除cse的皮肤后，观察到皮肤的整合素α6的表达大幅增加，显示出更多的表皮干细胞群，牢固地锚定在真皮表皮连接处。该标记物的表达水平达到与重建的“年轻”皮肤样本中观察到的水平相当甚至更高。
[0285]
4.3.afm
[0286]
通过afm对每种处理条件下获得的jde的弹性模量进行分析，能够证实上述结果(参见图9)。用0.05或0.1％的提取物l3进行处理导致表皮干细胞数量增加，从而增加在jde上测量的弹性模量(0.05％的l3：+48％，p《0.001；0.1％的l3：+96％，p《0.001)，表明这些连接处的刚性增加。此外，唤妍草种子的发酵提取物显示出剂量效应，弹性模量随着培养介质中施用的活性成分的浓度而增加。
[0287]
此外，唤妍草种子的发酵提取物l3通过增加在表皮基底水平的增殖区室，能够获得更坚硬且更牢固锚定的jde，以及更厚且更具增殖性的表皮，但其具有令人满意的分化。
[0288]
实施例5：化妆品制剂
[0289]
将如实施例1中制备的唤妍草种子的发酵提取物配制为以下说明性且非限制性的组合物，其根据化妆品中的常规配制方法制备。
[0290]
5.1.洗剂形式的组合物
[0291]
[表3]
[0292]
[0293]
*根据实施例1制备
[0294]
施用于皮肤上，特别是面部上，该组合物提供抗老化作用，对皮肤的紧致度和/或弹性具有有益的作用。
[0295]
5.2.精华素形式的组合物
[0296]
[表4]
[0297][0298]
*根据实施例1制备
[0299]
将精华素施用在整个面部，特别是有老化迹象的区域。包含根据本发明的唤妍草种子的发酵提取物的精华素促进表皮更新，获得更紧实且肤色更均匀的弹性皮肤。

技术特征：
1.狭叶豆蔻(aframomum angustifolium)或唤妍草种子的发酵提取物，其包含：-0.05至2％含量的奎宁酸；和-5至15％含量的乙酸，相对于发酵提取物的干燥提取物的重量以重量计。2.根据权利要求1所述的狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物，其特征在于其为液体形式，其包含至少一种防腐剂，所述防腐剂优选选自丁二醇、甘油、丙二醇、苯甲酸钠和山梨酸钾。3.一种用于发酵狭叶豆蔻或唤妍草种子的方法，其包括以下步骤：a)将微生物聚生体在包含碳水化合物的溶液中在17至38℃的温度孵育1至10天，以获得微生物培养物，所述聚生体包含至少一种属于乳杆菌属(lactobacillus)或片球菌属(pediococcus)的乳酸菌，至少一种属于酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schyzosaccharomyces)或有孢圆酵母属(torulaspora)的酵母，和至少一种属于醋菌属(acetobacter)、葡糖杆菌属(gluconobacter)或驹形杆菌属(komagataeibacter)的乙酸菌；b)将狭叶豆蔻或唤妍草种子研磨，以获得由平均尺寸为100μm至1mm的颗粒组成的粉末；c)将所述粉末加入至包含微生物培养物的发酵介质中，以获得发酵混合物，所述发酵介质包含选自蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜或其一种或多种的混合物的碳水化合物，d)将发酵混合物在25至35℃的温度孵育7至13天；e)过滤发酵混合物，以获得狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物。4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤a)中每升发酵介质加入约60g或更少的粉末，更优选约50g或更少的粉末，还更优选约12g/l或50g/l。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述发酵介质进一步包含茶叶的水提取物。6.一种通过根据权利要求3至5中任一项所述的方法获得的狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物。7.一种化妆品组合物，其包含在生理学上可接受的介质中的根据权利要求1、2或6所述的狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物。8.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于所述狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物以相对于所述组合物的总重量以活性物质(狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物的干物质)的重量计0.0000012％至0.0825％，优选0.000006％至0.033％，更优选0.000012％至0.0165％的百分比存在。9.根据权利要求7至8中任一项所述的化妆品组合物，其特征在于其进一步包含至少一种化妆品助剂，所述化妆品助剂选自抗氧化剂、润肤剂、保湿剂、抗老化剂、香料及其混合物。10.根据权利要求7至9中任一项所述的化妆品组合物，其特征在于其为霜剂、水包油乳剂、油包水乳剂或多重乳剂、溶液、混悬液、凝胶、乳液、洗剂或精华素的形式。11.一种用于护理和/或化妆角蛋白材料，特别是皮肤和/或嘴唇的美容方法，其包括在所述角蛋白材料上局部施用至少一层根据权利要求7至10中任一项所述的化妆品组合物。
12.根据权利要求11所述的美容方法，其特征在于其旨在促进和/或刺激表皮更新、皮肤的脱屑、皮肤细胞的活力和/或皮肤细胞的凝聚力，和/或预防和/或减少皮肤老化的迹象，特别是紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皱纹和/或细纹的出现、皮肤干燥、皮肤屏障功能的改变、皮肤柔软度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。13.根据权利要求1、2或6所述的狭叶豆蔻或唤妍草种子的发酵提取物作为活性成分的美容用途，用于促进和/或刺激表皮更新、皮肤的脱屑、皮肤细胞的活力和/或皮肤细胞的凝聚力，和/或预防和/或减少皮肤老化的迹象，特别是紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皱纹和/或细纹的出现、皮肤干燥、皮肤屏障功能的改变、皮肤柔软度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。

技术总结
本发明涉及一种唤妍草种子的发酵提取物，以及其制备方法和含有其的化妆品组合物。唤妍草种子的发酵提取物可以特别地用作活性成分以促进和/或刺激表皮更新、皮肤的脱屑、皮肤细胞的活力和/或皮肤细胞的凝聚力，和/或预防和/或减少皮肤老化的迹象，特别是紧致度的降低、弹性的降低、密度的降低、皱纹和/或细纹的出现、皮肤干燥、皮肤屏障功能的改变、皮肤柔软度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。度的改变和/或肤色的均匀性或光泽的改变。


技术研发人员：L
受保护的技术使用者：LVMH研究公司
技术研发日：2021.12.17
技术公布日：2023/10/20