一种改良高温碱性蛋白酶AprThc的稳定性的方法及突变体

一种改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法及突变体
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法及突变体。


背景技术：

2.蛋白酶在洗涤、饲料、食品、酿造以及医药行业具有重要的应用价值，其产量占酶制剂市场的65%以上。
3.在饲料行业，科学补充外源性蛋白酶对于控制饲料配方成本、提高蛋白质消化率、促进动物肠道健康、提高动物生产性能、减少环境污染等方面都有积极作用。在洗涤剂中添加蛋白酶可以提高洗涤剂的效果，制革工业中蛋白酶的利用可以水解角蛋白和一些其他球蛋白等杂蛋白，还会分解毛皮与表皮间连接的类粘蛋白，使鞣制后的皮革松软。蛋白酶在奶制品加工业、焙烤业豆制品以及去除杂味等领域也有着重要的作用。如在葡萄酒的生产过程中，通常加入酸性蛋白酶来水解酒中的蛋白质，可以大大减少蛋白质沉淀浑浊的现象。在奶酪的生产过程中，也同样需要蛋白酶来发酵使其具有特定的香味。蛋白酶在医学方面同样具有非常高的贡献，在用于治疗的酶中，蛋白酶几乎达到了一半以上，比如蛋白酶在体外的涂抹可以用于消炎等皮肤症状，服用蛋白酶类的药物可以治疗消化不良。血栓是人类以及动物中非常危险的一类疾病，具有纤维活性的蛋白酶不但可以在体外降解纤维蛋白，在体内也可以治疗静脉血栓。
4.虽然蛋白酶的应用空间十分广阔。但随着人们对生产要求的不断提高，对蛋白酶的稳定性及适应性提出新的高度。为了满足饲料工业需要，理想的蛋白酶应具有比活性高、热稳定性好、耐酸性强等特点。适用于洗涤剂的蛋白酶要求在碱性以及各种螯合剂氧化剂的环境下具有较好的活性和稳定性。
5.然而，常温中性蛋白酶是目前国内外市场中主要蛋白酶类，最适作用 ph 范围是6-7，在酸碱性环境和高温环境中酶活受到抑制或失活，不能够满足在高温度和酸碱条件下的生产应用需求。因此耐高温耐酸碱蛋白酶的挖掘及改良具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法。
7.本发明的另一目的是提供稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体。
8.本技术的另一目的是提供上述稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体的应用。
9.根据本技术的改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法，包括对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行l362i和/或k211g和/或r173g突变的步骤，其中，所述碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列的氨基酸序列如seq id no：1所示。
10.根据本技术的改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法，所述方法包括对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行k211g和l362i突变的步骤。
11.根据本技术的稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体，所述高温碱性蛋白酶突变体
具有对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行l362i和/或k211g和/或r173g突变后的氨基酸序列，其中，所述碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列的氨基酸序列如seq id no：1所示。突变体l362i的氨基酸序列如seq id no：2所示，突变体k211g的氨基酸序列如seq id no：3所示，突变体r173g的氨基酸序列如seq id no：4所示。
12.根据本技术的稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体，所述高温碱性蛋白酶突变体具有对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行k211g和l362i突变后的氨基酸序列。突变体k211gl362i的氨基酸序列如seq id no：5所示。
13.本技术对高温碱性蛋白酶aprthc进行分子改良，以提升其热稳定性和ph稳定性，对于提升蛋白酶的综合性能，降低蛋白酶的使用成本具有重要意义，为蛋白酶的性质改良提供了有效的技术方法。
附图说明
14.图1显示 aprthc及其突变体在85℃处理5 min后的剩余酶活力；图2 显示重组aprthc及其突变体aprthcmut1的酶学性质检测，其中，a温度对酶活力的影响；bph对酶活力的影响；c热稳定性；dph稳定性。
实施方式
15.lb 液体培养基：蛋白胨 10 g/l，酵母粉 5 g/l，nacl 10 g/l；lb 固体培养基：蛋白胨 10 g/l，酵母粉 5 g/l，nacl 10 g/l, 琼脂粉15 g/l；发酵培养基：豆粕 10 g，玉米粉 5 g，k2hpo
3 1g，明胶 10 g，总体积 300 ml；脱脂奶粉固体培养基：4%脱脂奶粉，2%琼脂粉；lbs培养基：蛋白胨 10 g/l，酵母粉 5 g/l，nacl 10 g/l，山梨醇91.1 g/l；电转洗涤培养基（smg）：山梨醇91.1 g/l，甘露醇91.1 g/l，甘油100 g/l；复苏培养基（lbsm）：蛋白胨 10 g/l，酵母粉 5 g/l，nacl 10 g/l，山梨醇91.1 g/l，甘露醇69.2 g/l。
16.碱性蛋白酶酶活力测定按照中华人民共和国国家标准 gb/t23527
–
2009 中所描述的福林法进行。在试管中加入 ph 10.5、1%酪蛋白溶液0.5 ml，40oc 预热3 min，加入 0.5 ml 适当稀释的酶液，混合均匀后，40℃条件下反应 10 min，加 0.4 m三氯乙酸溶液1 ml终止反应。将该反应液转移至 2 m l ep管中，12,000rpm 离心 10min。取上清液1 m l，依次加入碳酸钠溶液5 m l 和福林试剂使用溶液1 ml，振荡混匀后，置于 40℃ 水浴锅中显色 20 min。680 nm条件下测定吸光度。
17.实施例1 aprthc稳定性改良突变体的设计
18.aprthc为thermobifida cellulosilytica来源的s1 家族的蛋白酶，全长蛋白由373个氨基酸组成（ncbi reference sequence: wp_068753356.1）。signalp预测结果显示，其 n端32个氨基酸为可能的信号肽序列。
19.（1）aprthc单点突变体的构建表达与热稳定性检测依据芽孢杆菌表达系统的密码子偏好性对aprthc野生型蛋白进行编码序列的密码子优化合成，并构建至表达载体pht43的bamhi位点。通过重叠pcr（overlap pcr）法依据单点突变的设计对相应位置氨基酸进行突变，构建aprthc的单点突变体。将转化平板长出
的单克隆借助灭菌过后的牙签分别点在脱脂奶粉固体培养基上，37oc培养 30h 后，观察是否有透明圈的产生，并比较转化子与对照菌株的透明圈的直径，筛选阳性转化子。分别将阳性转化子和对照菌株即 sck6 菌株接种至 lb 培养基中，阳性转化子的培养基中加入四环素，sck6 培养基不加四环素，200 rpm、37oc振荡培养。过夜培养后按 4%的接种量转接到发酵培养基中进行发酵培养，培养三天后收集发酵液并测蛋白酶酶活力。
20.将诱导表达后的蛋白用ni柱进行纯化。将重组aprthc蛋白和其所有的单点突变体进行热稳定性测定。实验结果显示，在85℃处理5 min后的剩余酶活力，其中3个单点突变体蛋白（l362i、k211g、r173g）的热稳定性较野生型aprthc蛋白具有明显的改善，而另外7个单点突变体（r231y、s36g、f198i、t215y、q33a、e234d、t42r）的热稳定性较野生型蛋白并无改善甚至变差（图1）。
21.（2）aprthc多点突变体的选择和酶学性质检测为了进一步提升aprthc的热稳定性，构建了3个有效单突变位点的两点和三点组合突变体，并构建至表达载体pht43的bamhi位点。将aprthc两点或三点组合突变体表达质粒转化芽孢杆菌sck6菌株进行诱导表达。将诱导表达后的蛋白用ni柱进行纯化。热稳定性测定显示，双点突变体蛋白aprthcmut1（k211gl362i）的热稳定性较野生型aprthc蛋白具有明显的提升（图1）。
22.为了检测aprthcmut1的综合酶学性能，将aprthc和aprthcmut1在不同温度条件下进行酶活力测定，结果显示，aprthc的最适温度为65℃，而aprthcmut1最适温度提高至80℃ （图2中a图）。将aprthc和aprthcmut1分别在85℃条件下保温处理5 min和10 min，然后检测其酶活力。结果表明在85℃处理5 min后，aprthc的残余酶活力仅剩35%左右，85℃处理10 min 后aprthc的残余酶活力仅剩20%左右。而aprthcmut1经85℃处理5 min后，剩余酶活力仍在70%以上，在85℃处理10 min 后，剩余酶活力仍高于60%，表现出优异的热稳定性（图2中c图）。
23.对aprthc与aprthcmut1的最适ph值与ph稳定性的检测结果显示，发现aprthcmut1与aprthc的最适ph值相似，aprthc最适ph值为11，plm5amut1最适ph值为10.5（图2中b图）。而aprthcmut1相较于aprthc野生型蛋白具有更强的酸碱耐受性，ph稳定性范围宽泛。在ph 2.0的缓冲液中处理1h后，aprthc野生型蛋白仅剩余30%左右酶活力，在ph 3.0的缓冲液中处理1h后，aprthc野生型蛋白仅剩余40%左右酶活力；而aprthcmut1在ph 2.0的缓冲液中处理1h后，仍保留70%以上的酶活力。在ph 3.0的缓冲液中处理1h后，仍保留80%以上的酶活力（图2中d图）。
24.以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。

技术特征：
1.一种改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行l362i和/或k211g和/或r173g突变的步骤，其中，所述碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列如seq id no:1所示。2.根据权利要求1所述的改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行k211g和l362i突变的步骤。3.一种稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述高温碱性蛋白酶突变体具有对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行l362i和/或k211g和/或r173g突变后的氨基酸序列，其中，所述碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列如seq id no:1所示。4.根据权利要求3所述的稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述高温碱性蛋白酶突变体具有对碱性蛋白酶aprthc的氨基酸序列进行k211g和l362i突变后的氨基酸序列。5.权利要求3所述稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体用于水解蛋白酶的应用。6.权利要求3所述稳定性改良的高温碱性蛋白酶突变体作为饲料添加剂、食品添加剂或洗涤剂制备原料的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种改良高温碱性蛋白酶AprThc的稳定性的方法及突变体。本申请对碱性蛋白酶AprThc进行L362I、K211G和/或R173G突变。本申请对高温碱性蛋白酶AprThc进行分子改良，以提升其热稳定性和pH稳定性，对于提升蛋白酶的综合性能，降低蛋白酶的使用成本具有重要意义，为蛋白酶的性质改良提供了有效的技术方法。良提供了有效的技术方法。良提供了有效的技术方法。


技术研发人员：黄火清 徐欣欣 罗会颖 田健 王苑 柏映国 张红莲 刘波 杨浩萌 于会民 姚斌
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.09.11
技术公布日：2023/10/20