异烟酸希帕哌亚在制备预防和或治疗肺动脉高压药物的应用

1.本发明涉及异烟酸希帕哌亚的新药理作用技术领域，具体涉及一种异烟酸希帕哌亚在制备预防和或治疗肺动脉高压药物的应用。


背景技术：

2.肺动脉高压(pah)是一种心血管疾病，其定义是指肺动脉压力升高超过一定阈值的病理生理状态。pah主要由多种心、肺或肺血管本身疾病引起。如在因肺动脉壁增厚所引发的肺动脉和肺毛细血管狭窄的情况下，肺血管阻力增加，此时右心室需要更大的力量来推动血液通过肺循环，从而将导致血流动力学和病理生理状态发生改变，最终可引发右心衰竭。在临床中，pah是一种常见多发病，致残率和病死率都很高，应当引起人们的高度重视。
3.肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)是决定肺动脉壁厚度的重要因素，pasmcs的异常增殖将导致肺动脉壁增厚，从而引发pah。
4.现阶段，pah的主要治疗药物包括依前列醇及其衍生物、内皮素受体拮抗剂、钙通道阻滞剂等，研究关注较多的是磷酸二酯酶-5(pde-5)抑制剂，其主要通过增加细胞内的环磷酸鸟苷(cgmp)浓度来达到选择性扩张血管的目的，从而减少pasmcs的异常增殖。上述药物可以在一定程度上改善pah患者的生活质量，但其存在价格昂贵、不良反应较多、无法逆转疾病的发展等缺点，同时现阶段还缺乏靶向作用于治疗血管重构和右心肥厚的药物。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种异烟酸希帕哌亚在制备预防和或治疗pah药物的应用，采用肺平滑肌细胞(pasmcs)存活率检测(mtt法)实验，为培养的异常增殖肺平滑肌细胞(pasmcs)提供不同浓度梯度的异烟酸希帕哌亚(以下简称为hpapia)并检测细胞存活率，判断hpapia对pasmcs异常增殖的抑制效果。采用sd大鼠建立动物pah模型，分别针对fasudil(现有药物，通过阻断血管收缩过程的最终阶段，肌球蛋白轻链磷酸化，来扩张血管，达到治疗pah的效果)和hpapia两种药剂实施相应给药方案，在实验终点对动物右心室收缩压、肺动脉压力进行检测；采用masson染色对实验动物的心肺进行处理，对肺脏血管的病理变化进行观察，判断hpapia对pah的预防或/和治疗效果。
6.所述异烟酸希帕哌亚的化学名为2-(2-{[3-(3-羟基哌啶-1-基)丙基]氨基}嘧啶-4-基)异烟酸，分子式为c
18h23
n5o3，具有如下结构：
[0007][0008]
本发明是通过以下技术方案来实现的。
[0009]
本发明提供了一种药物，其特征在于：包含异烟酸希帕哌亚(以下简称hpapia)，用于治疗pah。
[0010]
作为本发明的进一步改进，药物的给药方式包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、口服给药、舌下含服、病灶内或脑内的递送、喷雾给药中的至少一种。
[0011]
作为本发明的进一步改进，药物包括hpapia与药学可接受的载体或辅料制成的制剂，制剂剂型选自注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、喷雾剂、散剂、脂质体、口服液、滴丸中的一种。
[0012]
本发明提供了上述包含hpapia的药物在预防和/或治疗pah的用途。
[0013]
作为本发明的进一步改进，pah由肺动脉平滑肌异常增殖所导致。当pasmcs由静止状态下的收缩表型向增殖状态下的合成表型转化后，pasmcs将过度增殖与凋亡受损。其异常增殖直接导致肺动脉管壁增厚；同时，pasmcs也会发生一定程度的迁移，配其异常增殖的状况，肺血管将发生重塑，两种情况下肺血管阻力均将增加。肺血管阻力增加则需要右心室提供更大的力量来推动血液通过肺循环，从而导致pah的发生。
[0014]
作为本发明的进一步改进，pah的症状包括肺动脉压进行性升高、右心室肥大以及肺血管重构中的至少一种。此类表现形式将成为判断预防或/和治疗pah的主要依据。
[0015]
作为本发明的进一步改进，hpapia为一种rhoa激酶(rock)抑制剂，通过提高rock的下游因子p27kip1的表达，达到抑制肺动脉平滑肌异常增殖的效果，实现靶向预防和/或治疗pah。
[0016]
a(rhoa)/rho激酶(rock)信号通路可通过影响其下游因子，如与细胞增殖凋亡相关的bcl-2和bax等，控制细胞增殖、凋亡和收缩，在人pah的发病机制中发挥关键作用。
[0017]
其中，rhoa激酶(rock)是一种丝/苏氨酸激酶，与rho蛋白共同参与调节平滑肌细胞的黏附、迁移、凋亡、增殖和分化，调节血管内皮屏障功能。rock主要的下游因子包括p27kip1，一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，可以阻断细胞周期由g1期进入分裂期(s期)，是平滑肌细胞增殖过程中重要的调控因子。当肺血管中rock被激活后，p27kip1的表达被抑制，从而使得肺血管平滑肌细胞异常增殖。
[0018]
rock抑制剂可以靶向抑制rock的激活，提高p27kip1的表达，抑制pasmcs增生，抑制肺动脉重塑，改善肺部血流分布，降低肺动脉压，降低右心室收缩压，改善内皮细胞功能障碍及炎症细胞迁移。
[0019]
作为本发明的进一步改进，药物通过抑制肺动脉压进行性升高、或抑制右心室肥
大、或抑制肺血管重构，实现预防pah和/或阻止pah病症加深。
[0020]
作为本发明的进一步改进，药物通过抑制肺动脉平滑肌异常增殖，实现pah治疗，治疗作用包括肺血管壁变薄、管腔直径增大。
[0021]
作为本发明的进一步改进，异烟酸希帕哌亚用于治疗所述pah的成人单次应用剂量为0.24～0.80mg/kg/d。
[0022]
上述方案中成人单次剂量的确定，是根据药理学实验中人与动物按体表面积计算法得出的。具体的，临床等效剂量从动物换算到成人的给药量公式为：大鼠剂量/人的剂量＝大鼠比表面积/人比表面积，经过调整可得：人的剂量＝大鼠剂量/(大鼠比表面积/人比表面积)，一般来说一名体重70kg成人的平均体表面积是1.73m2，一只200g大鼠的体表面积约305cm2，人的比表面积＝1.73/70＝0.024，大鼠比表面积＝305/200/10＝0.152。本发明的实施例中，大鼠剂量的优选范围为1.5～5mg/kg/d，经上述公式换算可计算得知成人单次应用剂量的优选范围为为0.24～0.80mg/kg/d。
[0023]
本发明的有益效果包括：
[0024]
(1)异烟酸希帕哌亚通过抑制肺动脉压进行性升高、或抑制右心室肥大、或抑制肺血管重构，实现预防pah和/或阻止pah病症加深；
[0025]
(2)异烟酸希帕哌亚通过抑制pasmcs异常增殖，使肺血管壁变薄、管腔直径增大，实现pah的治疗；
[0026]
(3)异烟酸希帕哌亚通过靶向抑制rock的激活，抑制pasmcs增生，从而靶向预防或/和治疗pah。
附图说明
[0027]
下面将通过附图详细描述本发明中优选实施案例，以助于理解本发明的目的和优点，其中：
[0028]
图1为异烟酸希帕哌亚结构图；
[0029]
图2为实施例1中各浓度异烟酸希帕哌亚对大鼠平滑肌细胞增殖的抑制作用图；
[0030]
图3为实施例2中异烟酸希帕哌亚对肺动脉高压大鼠血流动力学的影响图；
[0031]
图4为实施例2中肺动脉高压大鼠心脏masson染色结果图；
[0032]
图5为实施例2中肺动脉高压大鼠肺血管he染色结果。
具体实施方式
[0033]
下面根据附图和实施案例对本发明作进一步详细说明。
[0034]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加明白清楚，结合附图和实施例，对本发明进一步的详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均在本发明保护范围。
[0035]
实施例1
[0036]
(1)肺平滑肌细胞(pasmcs)存活率检测(mtt法)实验
[0037]
1.取生长状况良好的第2～3代pasmcs细胞，加入胰酶消化30s后，于无菌条件下加入适量胎牛血清终止消化，移液枪轻轻吹打制成细胞悬液。
[0038]
2.将细胞悬液放入离心机中，离心机转速设置为1000r/min，离心时间为5分钟。
[0039]
3.离心完成，经细胞计数后，将pasmcs细胞均匀接种于96孔培养板中(100μl/孔，每孔细胞约5
×
103个)。96孔板四周孔用磷酸盐缓冲溶液(pbs)填充以避免边缘效应。
[0040]
4.将铺板完成的pasmcs细胞置于温度为37℃、气氛条件为5％co2的培养箱中培养24小时。待细胞贴壁后，弃上清液。
[0041]
5.除对照组外，每孔加入100μl血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)，使其最终浓度为20ng/ml，对照组加入等量无血清培养基。
[0042]
6.每孔加入不同浓度梯度(1,2,4,6,8,16,32μm)的hpapia，每种浓度设置6个复孔。给药结束后置于培养箱中，继续培养24小时。
[0043]
7.待培养结束后，吸弃各孔药物，使用磷酸缓冲盐溶液(pbs)清洗2遍后，每孔换成100μl无血清的dmem/f12培养基，加入10μl浓度为5mg/ml的mtt-pbs液，继续培养4h后终止培养。
[0044]
8.弃上清液，每孔加入100μl二甲基亚砜(dmso)并震荡混匀10分钟,在酶标仪上测其在490nm波长处的吸光od值(a)。并根据各孔吸光值求抑制率，实验结果如图2所示。
[0045]
同时，在显微镜下观察到，pasmcs未经处理时密度较小，细胞间空隙较大，分布均匀，而在经过pdgf-bb的刺激后，细胞密度明显变大，细胞间空隙变小，分布十分紧凑，呈异常增殖的趋势，且细胞存活率明显高于正常组，由此可见造模成功。在给予不同浓度梯度的hpapia后，细胞存活率有不同程度的下降，说明hpapia可以有效抑制pasmcs的异常增殖。
[0046]
实施例2
[0047]
1.将60只sd大鼠随机分成4组，每组15只动物。对大鼠进行称重并记录，做好标记，分别为正常组、mct组、hpapia给药组、fasudil组。
[0048]
2.除正常组外，其余各组大鼠每只一次性腹腔注射0.5ml 2％mct溶液(55mg/kg)。造模结束2小时后，向各组大鼠腹腔注射等量生理盐水、hpapia(1.5mg/kg/d)，灌胃给予fasudil(5mg/kg/d)，从第1天开始并持续给药21天。
[0049]
3.在造模后第21天，向大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉并固定于手术台，右侧颈部行纵行切口，钝性分离右颈外静脉，远心端结扎，在近心端剪开颈外静脉约1/3，用预充盈肝素的导管缓缓插入，经上腔静脉入右心房后进入右心室，通过压力换能器连接生物信号采集系统，并根据显示器上的波形变化，确认导管进入右心室及肺动脉后记录肺动脉压(mpap)和右心室收缩压(rvsp)。
[0050]
4.数据稳定10～15分钟后保存，撤出导管，结扎右颈外静脉。具体数据如图3所示，结果显示，在造模后，各组大鼠的rvsp以及mpap相比于正常组均有显著性的上升，而在通过给药治疗后两种压力均有所下降。
[0051]
其中fasudil组和在造模后，各组大鼠的rvsp以及mpap相比于正常组均有显著性的上升，而在通过给药治疗后两种压力均有所下降，其中阳性药fasudil组和hpapia组下降尤为明显，说明hpapia可以有效改善pah大鼠的血流动力学变化。高剂量组下降尤为明显，说明hpapia可以有效改善pah大鼠的血流动力学变化。
[0052]
5.处死大鼠，迅速取出大鼠肺组织和心脏，用冰的生理盐水冲洗，得到无血肺组织与心脏。分离右肺上叶，将其浸泡于4％多聚甲醛中，在装标本的瓶中塞入棉花，使肺组织完全浸没于多聚甲醛中，常温固定24小时后将心脏进行masson染色，肺组织进行he染色，具体
染色结果如图4和图5所示。
[0053]
从masson染色结果图图4可以看出，正常组大鼠心肌组织中心肌细胞排列整齐，大小均一，细胞间质正常，整体无损伤，而模型组大鼠的心肌细胞大小不均，且排列不规则，细胞间质肿大，有明显的心肌纤维断裂，说明心脏组织受到了一定的损伤。在经过给药治疗后，fasudil组和hpapia组均有一定程度的改善作用，而hpapia组改善更为明显，其显著性改善pah所引起的大鼠肺心脏组织损伤，说明hpapia对pah大鼠的心脏有一定的改善作用。
[0054]
从he染色结果图图5可以看出，模型组相比于正常组，肺血管壁有明显增厚，管腔变得狭窄，且有大量细胞增殖与迁移，说明其肺血管发生了一定程度的重塑。而hpapia组与fasudil组的肺血管壁有一定变薄，管腔直径有所变大，hpapia组的改善程度更佳，肺血管壁明显变薄，且细胞的迁移和增殖明显减少。说明hpapia可以有效地改善pah大鼠的肺血管重塑现象。
[0055]
最后应说明的是：以上实施案例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施案例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施案例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施案例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种药物，其特征在于：包含异烟酸希帕哌亚，用于治疗肺动脉高压。2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、口服给药、舌下含服、病灶内或脑内的递送、喷雾给药中的至少一种。3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物包括所述化合物与药学可接受的载体或辅料制成的制剂，制剂剂型选自注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、喷雾剂、散剂、脂质体、口服液、滴丸中的一种。4.一种权利要求1～3中任意一项所述的药物在预防和/或治疗肺动脉高压的用途。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肺动脉高压由肺动脉平滑肌异常增殖所导致。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肺动脉高压的症状包括肺动脉压进行性升高、右心室肥大以及肺血管重构中的至少一种。7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述异烟酸希帕哌亚为一种rhoa激酶抑制剂，通过提高种rhoa激酶的下游因子p27kip1的表达，达到抑制肺动脉平滑肌异常增殖的效果，实现靶向预防和/或治疗肺动脉高压。8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物通过抑制肺动脉压进行性升高、或抑制右心室肥大、或抑制肺血管重构，实现预防肺动脉高压和/或阻止肺动脉高压病症加深。9.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物通过抑制肺动脉平滑肌异常增殖，实现肺动脉高压治疗，治疗作用包括肺血管壁变薄、管腔直径增大。10.根据权利要求4～9任意一项所述的用途，其特征在于，异烟酸希帕哌亚用于治疗所述肺动脉高压的成人单次应用剂量为0.24～0.80mg/kg/d。

技术总结
本发明涉及异烟酸希帕哌亚的新药理作用技术领域，具体公开了一种异烟酸希帕哌亚在制备预防和或治疗肺动脉高压药物的应用。肺动脉高压由肺动脉平滑肌异常增殖所导致，可引发右心衰竭，致残率和病死率较高。本发明的有益效果在于：异烟酸希帕哌亚通过抑制肺动脉压进行性升高、或抑制右心室肥大、或抑制肺血管重构，实现预防肺动脉高压和或阻止肺动脉高压病症加深；其还可以通过提高RhoA激酶主要的下游因子之一p27kip1的表达，抑制RhoA激酶的激活，从而抑制肺动脉平滑肌增生，抑制肺动脉重塑，降低肺动脉压，降低右心室收缩压，实现对肺动脉高压的治疗作用。可见，异烟酸希帕哌亚在预防和/或治疗肺动脉高压中具有良好的应用和开发前景。前景。前景。


技术研发人员：陈艳 郭晨昕 武新海 姚菁蔚 胡林 刘亚楠
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.08.31
技术公布日：2023/10/20