一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法

1.0mg/l 6-ba、0.15-0.3mg/l iaa，ph值为5.8-6.0；
15.所述的步骤(4)中，不定芽伸长培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.5-1.0mg/l 6-ba、0.15-0.3mg/l iaa、0.5-1.0mg/lga3，ph值为5.8-6.0；
16.所述的步骤(5)中，根的诱导培养基为：1/2ms培养基中添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.6-0.9mg/l iaa，ph值为5.8-6.0。
17.再进一步的，所述的步骤(1)中，萌发培养基为：1/2ms培养基中添加15g/l蔗糖、8g/l琼脂条，ph值为5.8；
18.所述的步骤(2)-(3)中，培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.2mg/l iaa；
19.所述的步骤(4)中，不定芽伸长培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.3mg/l iaa、1.0mg/lga3；
20.所述的步骤(5)中，根的诱导培养基为：1/2ms培养基、15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.8mg/l iaa。
21.本发明的另一个目的在于提供一种老汉瓜的遗传转化方法，可成功获得遗传转化的老汉瓜苗，并且遗传转化效率达到86％。
22.为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
23.一种老汉瓜的遗传转化方法，所述的遗传转化方法包括：采用上述的再生方法后，再进行遗传转化苗的鉴定；
24.其中，其中，所述的步骤(2)愈伤组织的诱导培养前要进行外植体的预培养、侵染和共培养，再进行愈伤组织的诱导培养；
25.所述的外植体的预培养过程为：将所述的无菌外植体剪去头部和尾部，接入预培养培养基中，在25-28℃的培养条件下进行暗培养；
26.所述的侵染及共培养过程为：用携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液，侵染所述的预培养后的老汉瓜子叶，再转移至愈伤组织诱导培养基，并用无菌滤纸将外植体与培养基隔开，进行共培养；
27.所述的遗传转化方法中步骤(3)不定芽的诱导培养中：不定芽诱导培养中还包括特美汀及抗生素潮霉素b；
28.所述的遗传转化方法中步骤(4)不定芽的伸长：不定芽伸长培养基中还包括特美汀及抗生素潮霉素b；
29.所述的遗传转化方法中步骤(5)根的诱导培养：根的诱导培养基中还包括特美汀及抗生素潮霉素b；
30.所述的遗传转化苗的鉴定：对所述的根的诱导培养后的遗传转化的老汉瓜苗进行gfp荧光的检测；提取遗传转化的老汉瓜苗基因组dna，进行pcr阳性检测，筛选阳性遗传转化苗。
31.进一步的，所述的步骤(2)中，根癌农杆菌菌液为携带有植物表达载体的根癌农杆菌重悬于ms液体培养基而成，ms液体培养基的成分为：ms基础粉末、15g/l蔗糖、15g/l葡萄糖，ph值为5.8；
32.所述的预培养的培养基为ms培养基、30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.25mg/l 6-ba、0.15mg/l iaa；
33.所述的步骤(3)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l；
34.所述的步骤(4)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l；
35.所述的步骤(4)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l。
36.再进一步的，所述的步骤(2)中，根癌农杆菌菌液还含有50-100mg/l乙酰丁香酮。
37.再进一步的，所述的根癌农杆菌菌液的od
600
为0.4-0.6。
38.进一步的，所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌gv3101，植物表达载体为pcambia1302。
39.进一步的，所述的步骤(2)中，侵染及共培养过程在25-28℃的培养条件下暗培养2天；
40.所述的步骤(3)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基；
41.所述的步骤(4)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基；
42.所述的步骤(5)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养。
43.与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
44.本发明提供的老汉瓜子叶离体再生及遗传转化的方法，通过筛选获得了一组再生频率非常高的激素配比。在建立高效再生体系的基础上又建立了高效的老汉瓜遗传转化体系，并使遗传转化率保持在86％左右。本发明的方法对老汉瓜后续基因工程育种上具有较高的实用性和高效性。
附图说明
45.图1老汉瓜无菌外植体的获得；
46.图2老汉瓜愈伤组织的诱导培养；
47.图3老汉瓜抗性不定芽形成图；
48.图4老汉瓜不定芽伸长图；
49.图5老汉瓜生根图；
50.图6老汉瓜gfp荧光检测图；
51.图7老汉瓜pcr分子检测图。
具体实施方式
52.为了进一步阐述本发明一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
53.下面将结合具体的实施例，对本发明一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法做进一步的详细介绍：
54.本发明属于基因工程及植物组织培养技术领域，涉及一种老汉瓜子叶高效再生及
遗传转化体系的建立方法。老汉瓜是一种典型的呼吸跃变型果实，是一种极其不耐储藏的甜瓜品种，其在采摘后的运输、保藏、销售等过程中，极易发生过熟、软化、变质。本发明针对缺乏对老汉瓜遗传转化体系的研究。提供了一种新的老汉瓜子叶高效再生及遗传转化体系的建立方法，该方法成功的获得了遗传转化的老汉瓜苗，并且遗传转化效率达到86％。
55.农杆菌介导法是目前双子叶植物遗传和部分单子叶植物转化的主要方法。fang和grumet首次报道了利用根癌农杆菌介导法将新霉素转移酶n-ptⅱ倒入甜瓜。与其他方法比较，农杆菌介导法比较成熟，且操作简单、成本较低。具体技术方案为：
56.一种老汉瓜的再生方法，包括以下步骤：
57.(1)种子的消毒及无菌外植体的获得：老汉瓜种子去壳、消毒灭菌后，在萌发培养基中进行培养，至老汉瓜子叶完全展开，真叶未长出时，得无菌外植体；
58.(2)愈伤组织的诱导培养：将所述的无菌外植体剪去头部和尾部，接入愈伤组织诱导培养基，在25-28℃的培养条件下培养15-20天；
59.(3)不定芽的诱导培养：待出现愈伤组织后，将外植体转入到芽诱导培养基中，培养至出现不定芽；
60.(4)不定芽的伸长：待所述的不定芽长至0.5-1cm时，将带有不定芽的外植体，接入到不定芽伸长培养基中进行培养；
61.(5)根的诱导培养：待所述的不定芽伸长至1.5-3cm时，将不定芽切下来，接入到根的诱导培养基中进行培养。
62.优选的，所述的步骤(1)中，萌发培养基为：1/2ms培养基中添加15-20g/l蔗糖、8-9g/l琼脂条，ph值为5.8-6.0；
63.所述的步骤(2)-(3)中，培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.5-1.0mg/l 6-ba、0.15-0.3mg/l iaa，ph值为5.8-6.0；
64.所述的步骤(4)中，不定芽伸长培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.5-1.0mg/l 6-ba、0.15-0.3mg/l iaa、0.5-1.0mg/lga3，ph值为5.8-6.0；
65.所述的步骤(5)中，根的诱导培养基为：1/2ms培养基中添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.6-0.9mg/l iaa，ph值为5.8-6.0。
66.近一步优选的，所述的步骤(1)中，萌发培养基为：1/2ms培养基中添加15g/l蔗糖、8g/l琼脂条，ph值为5.8；
67.所述的步骤(2)-(3)中，培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.2mg/l iaa；
68.所述的步骤(4)中，不定芽伸长培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.3mg/l iaa、1.0mg/lga3；
69.所述的步骤(5)中，根的诱导培养基为：1/2ms培养基、15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.8mg/l iaa。
70.一种老汉瓜的遗传转化方法，包括：采用上述的再生方法后，再进行遗传转化苗的鉴定；具体的：
71.(1)如上述的再生方法中种子的消毒及无菌外植体的获得；
72.(2)外植体的预培养：将所述的无菌外植体剪去头部和尾部，接入预培养培养基中，在25-28℃的培养条件下进行暗培养；
73.侵染及共培养：用携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液，侵染上述的步骤(2)中暗培养后的老汉瓜子叶，再转移至原培养基，并用无菌滤纸将外植体与培养基隔开，培养条件培养时间同上述步骤(2)；
74.(3)如上述的再生方法中愈伤组织的诱导培养，但区别在于，培养条件改为暗培养，培养时间缩短至2天；
75.(4)如上述的再生方法中不定芽的诱导培养，但区别在于向权利要求1所述不定芽诱导培养中加入抑菌成分特美汀及抗生素潮霉素b；
76.(5)如上述的再生方法中不定芽的伸长培养，但区别在于向权利要求1所述不定芽伸长培养中加入抑菌成分特美汀及抗生素潮霉素b；
77.(6)如上述的再生方法中根的诱导培养，但区别在于向权利要求1所述根诱导培养中加入抑菌成分特美汀及抗生素潮霉素b；
78.(7)遗传转化苗的鉴定：对所述的步骤(6)中遗传转化的老汉瓜苗进行gfp荧光的检测；提取遗传转化的老汉瓜苗基因组dna，进行pcr阳性检测，筛选阳性遗传转化苗。
79.优选的，所述的步骤(2)中，根癌农杆菌菌液为携带有植物表达载体的根癌农杆菌重悬于ms液体培养基而成，ms液体培养基的成分为：ms基础粉末、15g/l蔗糖、15g/l葡萄糖，ph值为5.8；
80.所述的预培养的培养基为ms培养基、30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.25mg/l 6-ba、0.15mg/l iaa；
81.所述的步骤(3)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l；
82.所述的步骤(4)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l。
83.近一步优选的，所述的步骤(2)中，根癌农杆菌菌液还含有50-100mg/l乙酰丁香酮。
84.近一步优选的，所述的根癌农杆菌菌液的od
600
为0.4-0.6。
85.优选的，所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌gv3101，植物表达载体为pcambia1302。
86.优选的，所述的步骤(2)中，侵染及共培养过程在25-28℃的培养条件下暗培养2天；
87.所述的步骤(3)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基；
88.所述的步骤(4)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基；
89.所述的步骤(5)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养。
90.本发明是针对老汉瓜品种建立的最优的再生及遗传转化方法，与现有同类甜瓜相关技术相比，此方法在培养基中的植物生长调节剂的种类，含量和配比上对老汉瓜这一品种更为适合。
91.本发明所述技术方案，如未特殊说明，均为本领域的常规技术。
92.本发明所用的植物表达载体为pcambia1302，农杆菌为根癌农杆菌gv3101。
93.ms培养基均指市面上所销售的ms基础粉末，用量为4.4g/l。1/2ms培养基指半强度的ms培养基，用量为2.2g/l。
94.实施例1：一种老汉瓜子叶高效离体再生方法
95.具体操作步骤如下：
96.(1)种子的消毒及无菌外植体的获得
97.选取饱满，无病害斑点的老汉瓜种子，剥去种壳，剥取一定数量的种子后，将其放置到一个干净的锥形瓶中备用，在无菌操作台中，将上述中备用的种子，倒进一个灭菌的锥形瓶中，首先用无菌水将种子清洗一遍，洗去一些小的杂质。接着用75％的酒精消毒30s(酒精消毒的时间应严格)，无菌水洗两次后，在用2％的次氯酸钠消毒10min。最后用无菌水在清洗3-4次。
98.消毒完的种子放置在无菌滤纸上晾干表面的水份后播种于萌发培养基其为：半强度的ms培养基(1/2ms培养基)中添加15g/l蔗糖、8g/l琼脂条，ph值为5.8。种子暗培养两天后在放置到温度为25-28℃、光照强度为5000lx-8000lx，光周期16h光照/8h的组培室中培养。待甜瓜种子长至子叶展开真叶未长出时，以这种状态下老汉瓜的子叶为外植体(图1)。
99.(2)6-ba和iaa浓度对愈伤组织的诱导及不定芽的影响
100.选取4-6d的子叶作为外植体，切除子叶顶部和基部，然后从中部切为两部分。将叶片正面朝上，接种到含有不同浓度6-ba和iaa的培养基(ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条，和不同浓度6-ba和iaa，ph值为6.0)中培养，共设计了12种不同的激素配比。每个激素配比有10个平板，每个平板有6个外植体。放于温度为26℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为8000lx的组培室中进行培养，25d左右观察外植体出愈率，统计不定芽分化率。
101.表1 6-ba和iaa对老汉瓜子叶不定芽分化的影响
[0102][0103]
不同浓度的6-ba和iaa会影响其对不定芽的诱导。结果见表1，在培养基中加入浓度为1.0mg
·
l-1
的6-ba和0.2mg
·
l-1
iaa对愈伤组织及不定芽的诱导率最高，诱导率为
91.66％。而外植体在其他激素配比中，愈伤组织的诱导率都为100％，但是不定芽的分化率不同，不定芽的生长状态也不同。因此，采用培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.2mg/l iaa为最佳愈伤组织及芽诱导培养基。
[0104]
(3)不定芽的伸长
[0105]
当诱导出的芽长到0.5-1.0cm左右时，将其切下接种在伸长培养基上，所述的伸长培养基为：激素1.0mg/l 6-ba、0.3mg/l iaa和1mg/l ga3以及30g/l蔗糖和9g/l琼脂条的ms培养基，ph值为6.0。
[0106]
(4)不定芽生根培养基的确定
[0107]
不定芽伸长14d左右后，待不定芽长至2-3cm左右时(图3)，将其从基部切下接种于添加不同种类和浓度的iaa(0.1、0.2和0.5mg/l)的根的诱导培养基(根的诱导培养基为：半强度的ms培养基中添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.2-0.9mg/l iaa，ph值为6.0)中。统计出现根的天数、生根率和生根数，筛选出最佳生根培养基配方。实验重复三次。选择最适的老汉瓜生根条件进行后续遗传转化实验。结果见表2。
[0108]
表2不同浓度的iaa(吲哚乙酸)对老汉瓜不定芽生根的影响
[0109][0110]
从表2可以看出当培养基中添加了不同浓度的iaa时，不定芽都能够生根，只是浓度不同生根率不同，当iaa的浓度在0.6-0.9mg/l时，生根率都达到了60％以上。其中，当培养基中添加了0.8mg/l iaa时，生根效果最好，生根率达到了80％。因此最佳的生根培养基为1/2ms培养基添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.8mg/l iaa。
[0111]
实施例2.
[0112]
具体操作步骤如下：
[0113]
(1)种子的消毒及无菌外植体的获得：
[0114]
种子的消毒过程与实施例1的步骤(1)相同。
[0115]
消毒完的种子放置在无菌滤纸上晾干表面的水份后播种于萌发培养基其为：半强度的ms培养基(1/2ms培养基)中添加20g/l蔗糖、9g/l琼脂条，ph值为6.0。种子暗培养两天后在放置到温度为26℃、光照强度为5000lx-7000lx，光周期16h光照/8h的组培室中培养。待甜瓜种子长至子叶展开真叶未长出时，以这种状态下老汉瓜的子叶为外植体。
[0116]
(2)愈伤组织和不定芽的诱导培养
[0117]
将无菌外植体剪去头部和尾部，接入愈伤组织诱导培养基，在25℃的培养条件下培养20天。
[0118]
待出现愈伤组织后，将外植体转入到芽诱导培养基中，培养至出现不定芽。
[0119]
愈伤组织和不定芽的诱导培养的培养条件为：放于温度为25℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为8000lx的组培室中进行培养，25d左右观察外植体出愈率。
[0120]
愈伤组织和不定芽的诱导培养采用培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.2mg/l iaa。
[0121]
(3)不定芽的伸长
[0122]
当诱导出的芽长到0.5-1.0cm左右时，将其切下接种在伸长培养基上，所述的伸长培养基为：激素0.5mg/l 6-ba、0.15mg/l iaa和0.5mg/l ga3以及30g/l蔗糖和9g/l琼脂条的ms培养基。
[0123]
(4)不定芽生根培养基的确定
[0124]
不定芽伸长14d左右后，待不定芽长至1.5-3cm左右时，将其从基部切下接种于的根的诱导培养基(根的诱导培养基为：半强度的ms培养基中添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.8mg/l iaa，ph值为5.8)中进行培养。
[0125]
实施例3.
[0126]
具体操作步骤如下：
[0127]
(1)种子的消毒及无菌外植体的获得：
[0128]
种子的消毒过程与实施例1的步骤(1)相同。
[0129]
消毒完的种子放置在无菌滤纸上晾干表面的水份后播种于萌发培养基其为：半强度的ms培养基(1/2ms培养基)中添加18g/l蔗糖、8.5g/l琼脂条，ph值为5.9。种子暗培养两天后在放置到温度为25℃、光照强度为6000lx-8000lx，光周期16h光照/8h的组培室中培养。待甜瓜种子长至子叶展开真叶未长出时，以这种状态下老汉瓜的子叶为外植体。
[0130]
(2)愈伤组织和不定芽的诱导培养
[0131]
将无菌外植体剪去头部和尾部，接入愈伤组织诱导培养基，在28℃的培养条件下培养18天。
[0132]
待出现愈伤组织后，将外植体转入到芽诱导培养基中，培养至出现不定芽。
[0133]
愈伤组织和不定芽的诱导培养的培养条件为：放于温度为28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为8000lx的组培室中进行培养，25d左右观察外植体出愈率。
[0134]
愈伤组织和不定芽的诱导培养采用培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.8mg/l 6-ba、0.2mg/l iaa，ph值为5.9。
[0135]
(3)不定芽的伸长
[0136]
当诱导出的芽长到0.5-1.0cm左右时，将其切下接种在伸长培养基上，所述的伸长培养基为：激素0.7mg/l 6-ba、0.20mg/l iaa和0.6mg/l ga3以及30g/l蔗糖和9g/l琼脂条的ms培养基，ph值为5.9。
[0137]
(4)不定芽生根培养基的确定
[0138]
不定芽伸长14d左右后，待不定芽长至2-3cm左右时，将其从基部切下接种于的根的诱导培养基(根的诱导培养基为：半强度的ms培养基中添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、
0.8mg/l iaa，ph值为5.9)中进行培养。
[0139]
实施例4：一种农杆菌介导的老汉瓜子叶高效遗传转化方法
[0140]
具体操作步骤如下：
[0141]
a外植体预培养的时间
[0142]
适当的预培养使刚从植株上分离出来的外植体(采用实施例1的步骤(1)获得)，能更好的调节生理状态，从而加快细胞分裂，并且植物在伤口愈合的过程中，细胞需要一定的时间完成酚类化合物等信号分子的产生与释放，从而更好的诱导农杆菌侵染到外植体当中，因此合适的预培养可以提高植物的遗传转化效率。
[0143]
将老汉瓜子叶(去除头部和基部)为遗传转化受体，接种在预培养培养基上，成分为ms培养基+30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.25mg/l6-ba+0.15mg/l iaa，在25-28℃暗培养培养2天。
[0144]
b表达载体电击法导入农杆菌及根癌农杆菌菌液的制备
[0145]
首先用电穿孔转化法将pcambia1302载体转入活化的农杆菌gv3101感受态中，其具体过程如下：
[0146]
电击杯刚开始要浸泡在70％酒精里，首先用无菌水清洗三次，将电击杯拿出，用无菌水润洗多次，用提前准备的滤纸，将电击杯放上，倒放吹干，待菌生长至对数生长期，即菌体活力最大的时候(od值约为0.6，菌液开始由酒红色转换成橙色)，以2ml菌液收集菌体(5000r，2min)。
[0147]
加200u无菌水，重悬，加质粒5ul，混匀，冰浴30min；将电击杯装入到提前修剪好的一次性手套中，预冷30min；加1ml的菌液加到电击杯中，菌液悬空一滴一滴加，加在中间，将电击杯放到电转仪上，电击1s；电击后，像电击杯中加入l ml lb稀释菌液，移至新的离心管。
[0148]
电击杯清洗干净。
[0149]
将200ul的菌液涂板，28℃避光倒置培养培养42h。直至有单菌落长出时，挑取单菌落进行pcr检测，确定阳性菌落，将鉴定为阳性菌液的农杆菌接种到含有50mg/l卡那霉素，50mg/l庆大霉素和100mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃、150rpm培养过夜。用40％甘油保菌后于-80℃冰箱备用。
[0150]
c侵染及共培养
[0151]
侵染：前一天晚上将含有pcambia1302载体的农杆菌菌液按照1％的接种量接种到含有50mg/l卡那霉素，50mg/l庆大霉素和100mg/l利福平的lb液体培养基中。
[0152]
待菌液浓度为0.5时，将菌液倒到无菌的50ml的离心管中，5000rpm、离心10min收集菌体，用ms液体培养基(含有15g/l的蔗糖，15g/l的白砂糖，ph为5.8)重悬菌体，并向重悬液中加入50mg/l的乙酰丁香酮(as)。
[0153]
将含有重悬液的锥形瓶封好瓶口，放到28℃，180rpm摇床中诱导30-60min。与此同时，将暗培养两天后的甜瓜外植体用无菌镊子夹到一个无菌的空锥形瓶中。
[0154]
共培养：待全部的外植体都全部转移到锥形瓶中后，在预培养的平板中铺上一层无菌滤纸。待菌液诱导完成后倒入到含有外植体的无菌瓶中，侵染10min后，倒掉重悬液，将外植体用无菌镊子夹到滤纸上，吸掉外植体周围多于的菌液。
[0155]
自然晾上5min后平铺在含有一层滤纸的预培养培养基中。接着在25-28℃下黑暗
中共培养两天。
[0156]
暗培养所用的培养基为ms培养基添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.50mg/l 6-ba和0.15mg/l的iaa，ph值为5.8。
[0157]
d抗性愈伤组织及抗性芽的筛选培养
[0158]
共培养结束后，将外植体转移到愈伤组织及芽诱导培养基中，愈伤组织及芽诱导培养基成分为ms培养基添加了30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.5-1.0mg/l 6-ba和0.15-0.3mg/l iaa，还添加了200mg/l特美汀+10mg/l潮霉素，ph值为5.8。
[0159]
培养条件为26℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx，20d更换一次培养基，该培养基既能形成愈伤组织(图2)又能形成不定芽。
[0160]
e抗性不定芽的伸长培养
[0161]
待不定芽长至1cm左右时(图3)，将外植体转移到芽伸长培养基中。芽伸长培养基为ms培养基添加了30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.5mg/l 6-ba和0.15mg/l iaa+1mg/lga3,还添加了200mg/l特美汀+10mg/l潮霉素，ph值为5.8。
[0162]
培养条件为26℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx。
[0163]
f抗性不定芽的生根
[0164]
待不定芽长至2-3cm时(图4)用无菌剪刀将不定芽减下来或者用无菌解刨刀将不定芽切下来。将切下来的不定芽放到生根培养基中。生根培养基为1/2ms培养基添加了15g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.6-0.9mg/l iaa，还添加了200mg/l特美汀+10mg/l潮霉素，ph值为5.8。
[0165]
培养条件：在26℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养。
[0166]
g遗传转化苗pcr分子检测
[0167]
待不定芽长至6-8cm，根系长到4-7根时(图5)，对无菌苗进行练苗移栽。
[0168]
待无菌苗练苗成活后，采用dnasecure新型植物基因组dna提取试剂盒(tiangen)提取遗传转化株系的dna，以老汉瓜基因组dna为模板，使用引物gfp-f 5
’‑
ggtctagaatggtgagcagggcg-3’和gfp-r5
’‑
ggctgcagttacttgtacagctcgtccatg-3’对700bp的gfp片段进行pcr扩增。
[0169]
pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃45s(该节35个循环)；72℃7min。以未进行转化的老汉瓜基因组dna为模板pcr作为阴性对照。取10ul的pcr产物用于琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图7所示。老汉瓜gfp荧光检测图如图6所示。
[0170]
实施例5.
[0171]
具体操作步骤如下：
[0172]
a外植体的预培养：与实施例4的步骤a相同，在26℃暗培养培养2天。
[0173]
b表达载体电击法导入农杆菌及根癌农杆菌菌液的制备：与实施例4的步骤b相同。
[0174]
c侵染及共培养
[0175]
侵染过程与实施例4的步骤c相同。不同的在于：重悬液中加入60mg/l的乙酰丁香酮(as)。将含有重悬液的锥形瓶封好瓶口，放到28℃，180rpm摇床中诱导60min。
[0176]
共培养：待全部的外植体都全部转移到锥形瓶中后，在预培养的平板中铺上一层无菌滤纸。待菌液诱导完成后倒入到含有外植体的无菌瓶中，侵染10min后，倒掉重悬液，将
外植体用无菌镊子夹到滤纸上，吸掉外植体周围多于的菌液。
[0177]
自然晾上5min后平铺在含有一层滤纸的预培养培养基中。接着在26℃下黑暗中共培养两天。
[0178]
暗培养所用的培养基为ms培养基添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba和0.30mg/l的iaa，ph值为6.0。
[0179]
d抗性愈伤组织及抗性芽的筛选培养
[0180]
共培养结束后，将外植体转移到愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养。愈伤组织及芽诱导培养基成分为ms培养基添加了30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.6mg/l 6-ba和0.20mg/l iaa，还添加了250mg/l特美汀+20mg/l潮霉素，ph值为6.0。
[0181]
培养条件为25℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx，15d更换一次培养基，该培养基既能形成愈伤组织又能形成不定芽。
[0182]
e抗性不定芽的伸长培养
[0183]
待不定芽长至1cm左右时，将外植体转移到芽伸长培养基中进行培养。芽伸长培养基为ms培养基添加了30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+1mg/l 6-ba和0.30mg/l iaa+0.8mg/lga3,还添加了250mg/l特美汀+20mg/l潮霉素，ph值为6.0。
[0184]
培养条件为25℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx，15d更换一次培养基。
[0185]
f抗性不定芽的生根
[0186]
待不定芽长至2-3cm时用无菌剪刀将不定芽减下来或者用无菌解刨刀将不定芽切下来。将切下来的不定芽放到生根培养基中进行培养。生根培养基为1/2ms培养基添加了15g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.8mg/l iaa，还添加了250mg/l特美汀+20mg/l潮霉素，ph值为6.0。
[0187]
培养条件：在25℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养。
[0188]
g遗传转化苗pcr分子检测
[0189]
待不定芽长至6-8cm，根系长到4-7根时，对无菌苗进行练苗移栽。
[0190]
待无菌苗练苗成活后，采用dnasecure新型植物基因组dna提取试剂盒(tiangen)提取遗传转化株系的dna，以老汉瓜基因组dna为模板，对700bp的gfp片段进行pcr扩增，筛选阳性遗传转化苗。
[0191]
实施例6.
[0192]
具体操作步骤如下：
[0193]
a外植体的预培养：与实施例4的步骤a相同，在28℃暗培养培养2天。
[0194]
b表达载体电击法导入农杆菌及根癌农杆菌菌液的制备：与实施例4的步骤b相同。
[0195]
c侵染及共培养
[0196]
侵染过程与实施例4的步骤c相同。不同的在于：重悬液中加入50mg/l的乙酰丁香酮(as)。将含有重悬液的锥形瓶封好瓶口，放到28℃，180rpm摇床中诱导30min。
[0197]
共培养：待全部的外植体都全部转移到锥形瓶中后，在预培养的平板中铺上一层无菌滤纸。待菌液诱导完成后倒入到含有外植体的无菌瓶中，侵染10min后，倒掉重悬液，将外植体用无菌镊子夹到滤纸上，吸掉外植体周围多于的菌液。
[0198]
自然晾上5min后平铺在含有一层滤纸的预培养培养基中。接着在26℃下黑暗中共培养两天。
[0199]
暗培养所用的培养基为ms培养基添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.7mg/l 6-ba和0.25mg/l的iaa，ph值为5.9。
[0200]
d抗性愈伤组织及抗性芽的筛选培养
[0201]
共培养结束后，将外植体转移到愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养。愈伤组织及芽诱导培养基成分为ms培养基添加了30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.7mg/l 6-ba和0.25mg/l iaa，还添加了220mg/l特美汀+15mg/l潮霉素，ph值为5.9。
[0202]
培养条件为25℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx，18d更换一次培养基，该培养基既能形成愈伤组织又能形成不定芽。
[0203]
e抗性不定芽的伸长培养
[0204]
待不定芽长至1cm左右时，将外植体转移到芽伸长培养基中，芽伸长培养基为ms培养基添加了30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.8mg/l 6-ba和0.25mg/l iaa+0.5mg/lga3,还添加了230mg/l特美汀+15mg/l潮霉素，ph值为5.9。
[0205]
培养条件为28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx，18d更换一次培养基。
[0206]
f抗性不定芽的生根
[0207]
待不定芽长至2-3cm时用无菌剪刀将不定芽减下来或者用无菌解刨刀将不定芽切下来。将切下来的不定芽放到生根培养基中进行培养。
[0208]
生根培养基为1/2ms培养基添加了15g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.6mg/liaa，还添加了225mg/l特美汀+15mg/l潮霉素，ph值为5.9。
[0209]
培养条件：在28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养。
[0210]
g遗传转化苗pcr分子检测
[0211]
待不定芽长至6-8cm，根系长到4-7根时，对无菌苗进行练苗移栽。
[0212]
待无菌苗练苗成活后，采用dnasecure新型植物基因组dna提取试剂盒(tiangen)提取遗传转化株系的dna，以老汉瓜基因组dna为模板，对700bp的gfp片段进行pcr扩增，筛选阳性遗传转化苗。
[0213]
实施例4-6的遗传转化率在86％以上。
[0214]
以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种老汉瓜的再生方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子的消毒及无菌外植体的获得：老汉瓜种子去壳、消毒灭菌后，在萌发培养基中进行培养，至老汉瓜子叶完全展开，真叶未长出时，得无菌外植体；(2)愈伤组织的诱导培养：将所述的无菌外植体剪去头部和尾部，接入愈伤组织诱导培养基，在25-28℃的培养条件下培养15-20天；(3)不定芽的诱导培养：待出现愈伤组织后，将外植体转入到芽诱导培养基中，培养至出现不定芽；(4)不定芽的伸长：待所述的不定芽长至0.5-1cm时，将带有不定芽的外植体，接入到不定芽伸长培养基中进行培养；(5)根的诱导培养：待所述的不定芽伸长至1.5-3cm时，将不定芽切下来，接入到根的诱导培养基中进行培养。2.根据权利要求1所述的再生方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，萌发培养基为：1/2ms培养基中添加15-20g/l蔗糖、8-9g/l琼脂条，ph值为5.8-6.0；所述的步骤(2)-(3)中，培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.5-1.0mg/l 6-ba、0.15-0.3mg/l iaa，ph值为5.8-6.0；所述的步骤(4)中，不定芽伸长培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.5-1.0mg/l 6-ba、0.15-0.3mg/l iaa、0.5-1.0mg/lga3，ph值为5.8-6.0；所述的步骤(5)中，根的诱导培养基为：1/2ms培养基中添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.6-0.9mg/l iaa，ph值为5.8-6.0。3.根据权利要求2所述的再生方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，萌发培养基为：1/2ms培养基中添加15g/l蔗糖、8g/l琼脂条，ph值为5.8；所述的步骤(2)-(3)中，培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.2mg/l iaa；所述的步骤(4)中，不定芽伸长培养基为：ms培养基中添加30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、1.0mg/l 6-ba、0.3mg/l iaa、1.0mg/lga3；所述的步骤(5)中，根的诱导培养基为：1/2ms培养基添加15g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.8mg/l iaa。4.一种老汉瓜的遗传转化方法，其特征在于，所述的遗传转化方法包括：采用权利要求1-3任一项所述的再生方法后，再进行遗传转化苗的鉴定；其中，所述的步骤(2)愈伤组织的诱导培养前要进行外植体的预培养、侵染和共培养，再进行愈伤组织的诱导培养；所述的外植体的预培养过程为：将所述的无菌外植体剪去头部和尾部，接入预培养培养基中，在25-28℃的培养条件下进行暗培养；所述的侵染及共培养过程为：用携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液，侵染所述的预培养后的老汉瓜子叶，再转移至愈伤组织诱导培养基，并用无菌滤纸将外植体与培养基隔开，进行共培养；所述的步骤(3)不定芽的诱导培养中：不定芽诱导培养中还包括特美汀及抗生素潮霉
素b；所述的步骤(4)不定芽的伸长：不定芽伸长培养基中还包括特美汀及抗生素潮霉素b；所述的步骤(5)根的诱导培养：根的诱导培养基中还包括特美汀及抗生素潮霉素b；所述的遗传转化苗的鉴定：对所述的根的诱导培养后的遗传转化的老汉瓜苗进行gfp荧光的检测；提取遗传转化的老汉瓜苗基因组dna，进行pcr阳性检测，筛选阳性遗传转化苗。5.根据权利要求4所述的遗传转化方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，根癌农杆菌菌液为携带有植物表达载体的根癌农杆菌重悬于ms液体培养基而成，ms液体培养基的成分为：ms基础粉末、15g/l蔗糖、15g/l葡萄糖，ph值为5.8；所述的预培养的培养基为ms培养基、30g/l蔗糖、9g/l琼脂条、0.25mg/l 6-ba、0.15mg/l iaa；所述的步骤(3)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l；所述的步骤(4)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l；所述的步骤(5)中，特美汀浓度为200-250mg/l，潮霉素浓度为10-20mg/l。6.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，根癌农杆菌菌液还含有50-100mg/l乙酰丁香酮。7.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述的根癌农杆菌菌液的od
600
为0.4-0.6。8.根据权利要求4所述的遗传转化方法，其特征在于，所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌gv3101，植物表达载体为pcambia1302。9.根据权利要求4所述的遗传转化方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，侵染及共培养过程在25-28℃的培养条件下暗培养2天；所述的步骤(3)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基；所述的步骤(4)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基；所述的步骤(5)中，在25-28℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养。

技术总结
本发明为一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法。一种老汉瓜的再生方法，包括以下步骤：(1)种子的消毒及无菌外植体的获得；(2)愈伤组织的诱导培养；(3)不定芽的诱导培养；(4)不定芽的伸长；(5)根的诱导培养。本发明还公开了一种老汉瓜的遗传转化方法。本发明所述的一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法，成功实现了老汉瓜子叶高效离体再生及遗传转化体系的建立，使得遗传转化率在86％以上。使得遗传转化率在86％以上。使得遗传转化率在86％以上。


技术研发人员：祝建波 侯梦娟 孔辉 谢照松 王嘉萌 刘瑞娜
受保护的技术使用者：石河子大学
技术研发日：2023.08.28
技术公布日：2023/10/20