一株能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉、菌剂及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一株能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉、菌剂及其应用。


背景技术：

2.目前，越来越多的国家认识到化学除草剂对环境和人类的危害，全世界已有100余种化学除草剂在多个国家被禁用或取消登记。而且，长期和大量使用单一除草剂，导致了杂草抗药性的产生和发展，使得药效降低、用药量增加、成本提高、也加剧了环境污染，直接威胁到农业安全生产（green,2014）。因此，研制和发展广谱、高效、低毒新型绿色生物除草剂显得十分迫切。
3.长刺蒺藜草[cenchrus longispinus(hack.) fernald]，别名少花蒺藜草，光梗蒺藜草、疏花蒺藜草。原产于北美洲及热带沿海地区的沙质土壤，20世纪80年代侵入我国，目前长刺蒺藜草已在辽宁省西北部、内蒙古自治区东部、吉林省南部三省交会地区广泛传播与扩散。2013年农业部将长刺蒺藜草列入《国家重点管理外来入侵植物名录（第一批）》，收录在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，入侵等级2级。长刺蒺藜草具有极强的适应能力，它极易形成单一优势种群，与农作物和牧草争光、争水、争肥，使作物减产、草场退化，严重影响了生态环境，而且刺苞容易造成放牧牛羊口腔和胃肠的溃疡，造成畜牧业生产的重大损失，刺苞也容易粘到人的衣服和鞋底，给人类活动造成不便。随着传播的加剧，其分布面积逐渐增加，造成农业生产成本增高，干扰牧业生产，降低天然草地生物多样性。内蒙古西辽河平原的科尔沁沙地是长刺蒺藜草发生的重灾区，发生面积占全国总发生面积近80%，并呈逐年递增态势，个别区域其危害等级达到3级（重度发生），累计发生面积超过128万 hm2，发生区域内每年直接经济损失约1.4亿元，严重影响农牧民生活、威胁农牧业生产和生态环境。
[0004]
目前，对于长刺蒺藜草的防治主要采用化学防除、人工刈割。其中，化学防治的效果最佳，但长刺蒺藜草进入花期后防治效果下降，即使当季防除效果达到90%以上，如果残存的植株结实后，仍不会影响长刺蒺藜草第2年的种群数量，而且除草剂的大量使用不仅会造成环境污染，植株也会产生抗药性。因此，化学防除方法不是彻底防除长刺蒺藜草的手段。人工拔除、铲除措施可以彻底杀死长刺蒺藜草植株，防除效果可达85%以上，但只能防治小面积发生的长刺蒺藜草，而对于我国100万 hm2的发生面积，长刺蒺藜草的防控能力并没有得到相应的提升，造成巨大的经济损失，因此，急需开发绿色、高效的新型防控技术。
[0005]
长刺蒺藜草抗逆性强，极少发生病害和虫害。目前，国内外还没有利用病原微生物防控长刺蒺藜草的报道，这方面的研究对入侵植物长刺蒺藜草的绿色防控是一个新的途径。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一株能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉、菌剂及其应
用。
[0007]
本发明针对发生在草地、路边、农田旁的恶性杂草长刺蒺藜草，筛选一种真菌菌株互隔交链孢霉（alternaria alternata），用于入侵植物长刺蒺藜草的生物防治。为入侵植物长刺蒺藜草的防除创制一种新的绿色、低毒、高效的生物除草剂，克服对化学除草剂的依赖。
[0008]
为了实现上述目的，本发明提供一株能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata），所述互隔交链孢霉于2023年5月15日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40626。
[0009]
本发明还提供一种能够防除长刺蒺藜草的菌剂，其包括所述互隔交链孢霉和/或其发酵液。
[0010]
本发明还提供能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在防除长刺蒺藜草中的应用。
[0011]
本发明还提供能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在制备防除长刺蒺藜草产品中的应用，该产品为生物除草剂互隔交链孢霉的发酵液。
[0012]
本发明还提供能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在抑制长刺蒺藜草根芽生长中的应用。
[0013]
本发明还提供能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在制备抑制长刺蒺藜草根芽生长产品中的应用，该产品为互隔交链孢霉的发酵液。
[0014]
本发明还提供所述的菌剂在防除长刺蒺藜草中的应用。
[0015]
本发明还提供所述的菌剂在制备防除长刺蒺藜草产品中的应用，该产品为生物除草剂。
[0016]
本发明还提供所述的菌剂在抑制长刺蒺藜草根芽生长中的应用。
[0017]
本发明还提供所述的菌剂在制备抑制长刺蒺藜草根芽生长产品中的应用，该产品为互隔交链孢霉发酵液。
[0018]
本发明的优点：本发明筛选到的互隔交链孢霉，其菌饼和发酵液可以防除长刺蒺藜草，并且能够有效抑制长刺蒺藜草根芽生长；同时，对除披碱草和苜蓿外的其他植物种子萌发没有抑制作用，对除草木樨和紫花苜蓿外的其他植物根芽生长无抑制作用，可以安全、有效的防除长刺蒺藜草。
[0019]
保藏说明菌种名称：互隔交链孢霉（alternaria alternata）；菌株编号：tl03；保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2023年5月15日；保藏编号：cgmcc no.40626。
附图说明
[0020]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]
图1左图为互隔交链孢霉的菌落背面形态图，右图为互隔交链孢霉的菌落正面形态图。
[0022]
图2左图为互隔交链孢霉的菌丝形态图，右图为互隔交链孢霉的分生孢子形态图。
[0023]
图3为实施例5喷施互隔交链孢霉发酵液3d后对长刺蒺藜草茎叶生长影响对比图。
[0024]
图4为实施例5喷施互隔交链孢霉发酵液10d后对长刺蒺藜草茎叶生长影响对比图。
具体实施方式
[0025]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]
内蒙古通辽市长刺蒺藜草发生的重灾区，发明人从内蒙古通辽市自然发病的长刺蒺藜草罹病植株，发病的长刺蒺藜草叶片和刺苞上均可见大小不等的黑褐色病斑，叶片上的病斑多为圆点状，直径0.5~2.0mm，刺苞上的病斑形状不规则，严重者整个刺苞为黑褐色。从染病刺苞中分离、筛选得到1株具有强致病力的菌株，从形态学和分子生物学两个方面进行鉴定，同时对其防治效果和作物安全性进行评估，旨在为长刺蒺藜草生物除草剂的研发提供技术方案。
[0027]
实施例1：菌株的分离筛选2021年10月从内蒙古通辽市开鲁县东风镇东风村，长刺蒺藜草发生区采集典型的黑斑病发病病株，放入纸袋中保存并编号，带回实验室立即进行病原菌分离。采用常规组织分离法对病菌进行分离纯化。用无菌剪刀剪取病健交接处的病样组织（0.5cm
×
0.5cm），用质量浓度为10%次氯酸钠溶液处理3min，无菌水漂洗3~5次，置于含头孢的pda固体培养基（索莱宝pda培养基马铃薯浸粉6g，琼脂20g，葡萄糖20g，ph值5.6
±
0.2）上，28℃恒温培养箱内培养3d。待病样组织块周围长出菌丝后，用接种针挑取菌落边缘菌丝，对角放置于pda固体培养基（索莱宝pda培养基马铃薯浸粉6g，琼脂20g，葡萄糖20g，ph值5.6
±
0.2）上纯化培养，反复纯化直至菌落形态一致。将纯化后的菌落编号为tl03，放置在4℃冰箱内保存菌种，备用。
[0028]
实施例2：菌株的分离培养特征和鉴定2.1菌株的形态学特征取实施例1获得的菌株tl03在pda培养基（索莱宝pda培养基马铃薯浸粉6g，琼脂20g，葡萄糖20g，ph值5.6
±
0.2）上培养菌种，观察菌落特征；并将培养5天的菌落用接种针挑出一点菌落，放在中间滴有无菌水的载玻片上，打散菌丝，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察菌丝和孢子形态结构。
[0029]
pda培养基上，菌落背面黑黄色；菌丝体灰白色，气生菌丝绵密较短，绒毛状，如图1所示。培养3d后菌丝开始产生色素，最终变为黑褐色。
[0030]
分离菌株在pda固体培养基（索莱宝pda培养基马铃薯浸粉6g，琼脂20g，葡萄糖20g，ph值5.6
±
0.2）上生长迅速，在28℃时，平均生长速率为0.86cm/d。分生孢子椭圆形或棍棒状，褐色，有短喙或无喙，具纵、横膈膜，横膈膜1～5个，纵膈膜0～3个，膈膜处稍有缢缩，如图2所示，大小为11.77～33.35
µm×
8.66～14.70
µ
m。
[0031]
2.2菌株的分子生物学鉴定将实施例1获得的菌株tl03（于25℃黑暗培养5d后，采用bioflux真菌基因组dna提取试剂盒（购于杭州博日科技股份有限公司）提取dna，然后分别利用：rdna-its4/5（5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’、5-ggaagtaaaagt cgtaacaa gg-3）、atpdf1/ atpdr1（5
’‑
atcgtctccatgaccgagttcg-3’，5
’‑
tccgatgg agttcatg atagcc-3’）、caldf1/caldr1（5’agca agtctccgagt tcaagg-3，5
’‑
cttctgcatcat cayctggacg-3’）、alt-4for/alt-4rev （5
’‑
atgcagttcacc accatcgcytc-3,5
’‑
acgagggtgaygtag gcgtcrg-3’）序列为引物，对菌株tl03基因组dna进行pcr扩增。反应体系及扩增条件如表1所示：表1：反应体系及扩增条件
[0032]
分别将得到的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pmd19载体，转化大肠杆菌dh5a，经过蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，进一步扩大培养得到菌液，对菌液进行测序，测序工作交由北京六合华大基因科技有限公司完成。
[0033]
以rdna-its4/5为引物，测得该菌株的its的核苷酸序列长度为544bp，its基因测序结果如seq id no.1所示。
[0034]
以atpdf1/ actdr1为引物，测得该菌株的atpase的核苷酸序列长度为1197bp，atpase基因测序结果如seq id no.2所示。
[0035]
以caldf1/caldr1为引物，测得该菌株的calmodulin的核苷酸序列长度为795bp，calmodulin基因测序结果如seq id no.3所示。
[0036]
以alt-for 和 alt-rev为引物，测得该菌株的alt a1的核苷酸序列长度为468bp，alt a1基因测序结果如seq id no.4所示。
[0037]
将基因序列经blast与ncbi数据库进行同源性比对发现，该菌株与互隔交链孢霉alternaria alternata相似度最高，各扩增序列与互隔交链孢霉alternaria alternata的同源性分别为：以rdna-its4/5序列为引物扩增得到的基因序列与互隔交链孢霉alternaria alternata的同源性为100%；以atpase序列为引物扩增得到的基因序列与互隔交链孢霉alternaria alternata的同源性为99.41%；以calmodulin序列为引物扩增得到的基因序列与互隔交链孢霉alternaria alternata的同源性为99.74%；以alternaria a1 序列为引物扩增得到的基因序列与互隔交链孢霉alternaria alternata的同源性为100%；确定该菌株为互隔交链孢霉alternaria alternata。
[0038]
实施例3：制备互隔交链孢霉的菌株发酵液将互隔交链孢霉经pda固体培养基培养的菌种培养物接种到psk液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司pda培养基马铃薯浸粉300g，葡萄糖20g，ph值5.6
±
0.2）中，150r/min在25℃震荡培养7d后，使用4层纱布进行过滤，得到发酵滤液。
[0039]
实施例4：互隔交链孢霉菌饼对长刺蒺藜草茎叶生长的影响将长刺蒺藜草种子，种植于含有营养土-蛭石1:2的塑料钵中。生长至10cm高时，对幼苗进行接种菌饼，用打孔器将pda平板上培养7d的菌落打成直径0.3cm的菌饼，再利用牙签在叶片上扎一个小孔，将菌饼放置在叶片有小孔的位置，并以接种pda培养基为空白对照组，每个处理3个重复。放置于光照/黑暗交替的生长室内进行培养，观察并记录发病情况。结果发现，如图3所示，接种菌饼的叶片3天后针孔周围变黑，而空白对照组叶片保持正常。
[0040]
实施例5：互隔交链孢霉发酵液对长刺蒺藜草茎叶生长的影响将长刺蒺藜草种子，种植于含有营养土-蛭石1:2的塑料钵中。生长至10cm高时，对幼苗喷施实施例3制备的发酵滤液，并以喷无菌水作为空白对照组，每个处理3个重复。放置于光照/黑暗交替的生长室内进行培养，观察并记录发病情况。结果发现，如图4所示， 10d叶片枯萎，而空白对照组叶片保持正常。
[0041]
实施例6：菌株发酵液对长刺蒺藜根芽生长的影响制备含有ms培养基（广东环凯微生物科技有限公司pda培养基马铃薯浸粉300g，琼脂15g，葡萄糖20g，ph值5.6
±
0.2）的深培养皿，将长刺蒺藜草种子表面消毒后播种在培养皿中，待长刺蒺藜草的幼苗生长4d后，加入实施例3获得的发酵液（稀释3倍），对照组加入无菌水，每个处理设3个重复。4d后测定根长抑制率和芽长抑制率。根长抑制率=(对照组根长-处理组根长)/对照组根长
×
100%，芽长抑制率=(对照组芽长-处理组芽长)/对照组芽长
×
100%。结果表明，互隔交链孢霉tl03发酵液根生长抑制率为67.65%，芽生长抑制率为59.65%，显著影响长刺蒺藜草幼苗生长。
[0042]
表2菌株发酵液对长刺蒺藜草根和芽生长的影响
[0043]
实施例7：菌株发酵液对长刺蒺藜草种子萌发的影响
[0044]
将实施例3制备的发酵液用无菌水稀释至2倍，用于测定发酵液对长刺蒺藜草种子
萌发的影响。
[0045]
利用纸皿法测定种子的萌发率，在滤纸上均匀加入发酵液，选取25粒长刺蒺藜草的种子经消毒后置于平皿中，25℃黑暗条件下培养，同时设置无菌水作为对照组，每个处理重复3次，10d后统计种子萌发情况。种子萌发标准为：种子萌发的芽长超出种子自身长度即为萌发，种子萌发率和萌发抑制率计算公式如下：种子萌发率(%)=种子萌发数/供试种子总数
×
100%；种子萌发抑制率(%)=(对照组种子萌发率-处理组种子萌发率)/对照组种子萌发率
×
100%。试验结果得出，互隔交链孢霉tl03对长刺蒺藜草的种子萌发有轻微抑制作用，种子萌发抑制率为10.02%。
[0046]
实施例8：菌株发酵液对牧草和农作物种子萌发的影响选择牧草和农作物共7种植物作为发酵液生物安全评价的对象，将实施例3制备的发酵液用无菌水稀释至2倍，用于测定发酵液对评价对象种子萌发的影响。
[0047]
利用纸皿法测定种子的萌发率，在滤纸上均匀加入发酵液，分别选取披碱草、白菜、苜蓿、小麦、燕麦、草木樨和玉米种子各25粒，经消毒后置于平皿中，25℃黑暗条件下培养，同时设置无菌水作为对照组，每个处理重复3次，10d后统计种子萌发情况。种子萌发标准为：种子萌发的芽长超出种子自身长度即为萌发，种子萌发率和萌发抑制率计算公式如下：种子萌发率(%)=种子萌发数/供试种子总数
×
100%；种子萌发抑制率(%)=(对照组种子萌发率-处理组种子萌发率)/对照组种子萌发率
×
100%。
[0048]
结果表明，菌株发酵液对苜蓿、披碱草种子的萌发具有抑制作用，对其他植物种子萌发没有抑制作用。
[0049]
表3菌株发酵液对作物种子萌发的影响
[0050]
实施例9：菌株发酵液对牧草和农作物根芽生长的影响制备含有ms培养基（大量元素: nh4no31650 mg/l，cacl2·
2h2o 440mg/l，mgso4·
7h2o 370mg/l，kh2po4700mg/l；微量元素:ki 0.83mg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4·
4h2o 22.3mg/l，znso4·
7h2o 8.6mg/l，na2mno4·
2h2o 0.25mg/l，cuso4·
5h2o 0.025 mg/l， coci2·
6h2o 0.025mg/l，feso4·
7h2o (27.8mg/l) +na
2-edta
·
2h2o (37.3mg/l)；有机成分:肌醇100mg/l，烟酸0.5mg/l，盐酸毗哆醇 (维生素b6)0.5mg/l，盐酸硫胺素(维生素b1) 0.5mg/l，甘氨酸2mg/l）的深培养皿，将披碱草、白菜、紫花苜蓿、小麦、燕麦、草木樨和玉米种子表面消毒后播种在培养皿中，待几种作物的幼苗生长4d后，加入实施例3制备的菌株发酵液（稀释2倍），对照组加入无菌水，每个处理设3个重复。4d后测定根长抑制率和芽长抑制
率。结果发现，菌株发酵液对草木樨和紫花苜蓿的根芽生长具有一定的抑制作用，对其他植物的根生长没有抑制作用。通过测定tl03菌株发酵液对7种牧草和农作物芽生长的影响，结果发现，菌株发酵液对草木犀和紫花苜蓿的根芽生长有抑制作用，但是，相比对长刺蒺藜草的抑制作用，菌株发酵液对草木犀和紫花苜蓿的根芽生长的抑制作用更小一些，对其他植物芽生长的抑制作用不明显，可以适当避免在紫花苜蓿和草木樨地块使用。
[0051]
表4菌株发酵液对牧草和农作物根和芽生长的影响
[0052]
实施例10：互隔交链孢霉的菌株发酵液对牧草和农作物茎叶生长的影响将披碱草、白菜、紫花苜蓿、小麦、燕麦、草木樨和玉米种子播种在在直接12cm的花盆中，置于温室中培养，取实施例3制备的菌株发酵液，并稀释2倍后，用喷雾接种法连续3d接种到正常生长的3-5叶期的植株上，接种后的植株用黑塑料袋保湿培养24h后，放置于28℃，光照/黑暗=12h/12h人工气候箱中，每个处理3次，以接种无菌水的植株作为对照，7d以后观察各种植物的发病情况，计算发病率和鲜重防效。将牧草和作物的安全性评价标准设为4级，第1级植株无病斑，正常生长，说明植株无症状，用ns表示；第2级植株叶子上有零星病斑，生长发育稍受限制，说明有轻微影响，用ls表示；第3级植株有1/5-1/4的叶面积感病，说明生长受抑制，用ms表示；第4级植株大量枯死，说明生长发育受到严重限制，用ss表示。
[0053]
由表5可知，tl03菌株发酵液对白菜、草木犀、披碱草、小麦、燕麦和紫花苜蓿相对安全，供试植物与空白对照相比，长势及株高没有受到影响，表现为无症状（ns），但是玉米生长受到影响，后期部分植株根断裂，枯死，感病率为29%，说明对玉米生长具有抑制作用。
[0054]
表5 发酵液对牧草和农作物生长的影响
[0055]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1. 一株能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata），其特征在于，所述互隔交链孢霉于2023年5月15日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40626。2.一种能够防除长刺蒺藜草的菌剂，其特征在于，其包括如权利要求1所述互隔交链孢霉和/或其发酵液。3. 权利要求1所述的能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在防除长刺蒺藜草中的应用。4. 权利要求1所述的能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在制备防除长刺蒺藜草产品中的应用。5. 权利要求1所述的能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在抑制长刺蒺藜草根芽生长中的应用。6. 权利要求1所述的能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉（alternaria alternata）在制备抑制长刺蒺藜草根芽生长产品中的应用。7.权利要求2所述的菌剂在防除长刺蒺藜草中的应用。8.权利要求2所述的菌剂在制备防除长刺蒺藜草产品中的应用。9.权利要求2所述的菌剂在抑制长刺蒺藜草根芽生长中的应用。10.权利要求2所述的菌剂在制备抑制长刺蒺藜草根芽生长产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一株能够防除长刺蒺藜草的互隔交链孢霉、菌剂及其应用。所述互隔交链孢霉于2023年5月15日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40626。本发明筛选到的互隔交链孢霉，其菌饼和发酵液可以防除长刺蒺藜草，并且能够有效抑制长刺蒺藜草根芽生长；同时，对除披碱草和苜蓿外的其他植物种子萌发没有抑制作用，对除草木樨和紫花苜蓿外的其他植物根芽生长无抑制作用，对玉米生长有一定抑制作用，可以安全、有效的防除非玉米地的长刺蒺藜草。有效的防除非玉米地的长刺蒺藜草。有效的防除非玉米地的长刺蒺藜草。


技术研发人员：郝丽芬 林克剑 李宇宇 张园园 张玉 吴德宝 王遥宁
受保护的技术使用者：中国农业科学院草原研究所
技术研发日：2023.09.13
技术公布日：2023/10/20