一种高产虫草素的蛹虫草菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高产虫草素的蛹虫草菌及其应用。


背景技术：

2.蛹虫草（cordyceps militaris）又名北冬虫夏草，食药用历史悠久，现代又把蛹虫草列为新食品原料，从安全性和食用性方面蛹虫草具有天然的优势。虫草素作为蛹虫草的重要活性成分之一，具有调节血糖、治疗白血病、抗癌、抗病毒、调节免疫力等多种生物活性作用，是健康养生产品开发的优质原料。目前市场上虫草素价格昂贵，但市场前景广阔。最新研究结果表明虫草素对新冠病毒（sars-cov-2）作用显著，可抑制新冠病毒本身的复制和存活，减轻和缓解新冠病毒特有的严重症状和后遗症，是一种极具开发价值的潜在治疗新冠病毒的药物。最新研究报道，采用protide 技术对虫草素进行改造之后能够有效的提高虫草素在体内的稳定性和抗肿瘤活性，这一研究发现将极大推动虫草素的抗癌应用，因此提高虫草素产量对于促进虫草素开发利用具有重要意义。
3.由于虫草素化学合成工艺复杂，副产物难于分离，尚不能实现工业化生产，目前虫草素的主要来源是从蛹虫草子实体中提取，但子实体生长周期长，且易菌种退化至无法出草。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种高产虫草素的蛹虫草菌及其应用。
5.第一方面，本发明以蛹虫草菌cm3为出发菌株，通过离子束注入诱变得到一株高产虫草素的蛹虫草菌cmn006，并对其进行了生物保藏，保藏信息如下：保藏编号：cgmcc no.40446；分类命名：蛹虫草cordyceps militaris；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101；保藏日期：2022年12月25日。
6.本发明进一步提供包含所述蛹虫草菌cmn006的菌剂。
7.本发明进一步提供包含所述蛹虫草菌cmn006或其发酵产物，或所述菌剂的药物组合物。
8.本发明所述发酵产物可以为不包括蛹虫草菌的发酵产物，或是包括蛹虫草菌cmn006的发酵产物。
9.本发明进一步提供所述蛹虫草菌cmn006，或所述菌剂在生产虫草素中的应用。
10.本发明针对蛹虫草菌cmn006经过培养基配方和培养工艺的优化，大大提高了虫草素产量，液体发酵培养与固体培养相比能够更好地控制条件，保证生产的稳定性。
11.第二方面，本发明提供一种蛹虫草菌培养基，包括：蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化亚铁、氯化钙和腺嘌呤；所述蔗糖和所述蛋白胨的质量比为（3~5）：（1~3）。
12.进一步地，以重量份计，包括蔗糖30~50份、蛋白胨10~30份、磷酸二氢钾1~3份、氯化亚铁0.1~0.3份、氯化钙1~3份和腺嘌呤1~5份。
13.第三方面，本发明提供一种培养蛹虫草菌的方法，包括：采用所述的蛹虫草菌培养基对所述蛹虫草菌进行培养。
14.进一步地，所述培养的培养条件包括：在23~27℃，120~180rpm的条件下培养7~10天后；在23~27℃条件下静置培养10~12天，昼夜比例为（6~10）：（14~18）。
15.本发明具备如下有益效果：本发明以蛹虫草菌为基础，通过离子束注入诱变法得到一株高产虫草素的突变菌株cmn006，其生产虫草素的能力是出发菌株的2.87倍以上。虫草素是一种天然活性成分，具备多种药理作用，本发明提供的蛹虫草菌cmn006对于虫草素的相关药物研发，以及临床应用具有重要意义。
16.本发明进一步对蛹虫草菌cmn006的发酵条件和培养基配方进行了优化，提高虫草素产量，有效降低虫草素生产成本，对于促进虫草素作为健康产品、药品的应用开发具有极大的推动作用。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1是本发明实施例2提供的碳源筛选实验结果示意图。
19.图2是本发明实施例2提供的氮源筛选实验结果示意图。
20.图3是本发明实施例2提供的无机盐筛选实验结果示意图。
21.图4是本发明实施例2提供的虫草素合成相关化合物的添加实验结果示意图。
具体实施方式
22.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1
24.本发明以蛹虫草菌cm3（公开于专利zl 201510229665.4）为出发菌株，通过离子束注入诱变法得到一种高产虫草素的突变株（命名为蛹虫草菌cmn006），并对其进行了生物保藏，具体保藏信息如下：保藏编号：cgmcc no.40446；分类命名：蛹虫草cordyceps militaris；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101；保藏日期：2022年12月25日。
25.1、本发明针对蛹虫草菌cm3和突变株蛹虫草菌cmn006进行了虫草素生产，具体将蛹虫草孢子涂布到pda平板上培养，挑取单菌落转接到pda平板上培养15-20d，然后将蛹虫
草固体菌种接种到装有100ml液体培养基1的250ml三角瓶中，25℃恒温摇床培养7d，摇床转速为150r/min。将蛹虫草培养液吸取到ep管中，8000r/min，离心3min，无菌注射器吸取上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液直接放入高效液相色谱仪（hplc）的样品瓶中，然后采用hplc方法测定虫草素含量。
26.所采用的培养基如下：pda固体培养基：葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，土豆汁1000ml，ph自然，琼脂20g，121℃，灭菌30min。
27.液体培养基1：葡萄糖30g，胰蛋白胨 4g，酵母粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，ph 自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000ml，121℃，灭菌30min。
28.试剂：葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁均为分析纯试剂，购自国药集团北京化学试剂公司；虫草素为高效液相色谱纯级别，购自sigma公司；胰蛋白胨、酵母粉、琼脂均为生物培养基级别，购自国药集团北京化学试剂公司。
29.虫草素含量hplc测定方法如下：采用dad检测器，检测波长为260nm，色谱柱：xdb-c18，4.6
×
250mm，5μm，流动相为甲醇：纯水=15：85（v%：v%），流速1ml/min，进样量10μl，柱温箱温度为25℃ 。
30.结果显示，出发菌株蛹虫草菌cm-3的虫草素含量为：78.98mg/l；突变菌株蛹虫草菌cmn006的虫草素含量为305.78 mg/l，相较于出发菌株而言提升了2.87倍。
31.2、本发明进一步验证了突变菌株蛹虫草菌cmn006的遗传稳定性，对其进行传代稳定性实验，以转接1次为传代1次计算，总计传代8次，每次采用相同的液体发酵培养条件，采用相同的样品处理方法和虫草素含量测定方法，各代之间虫草素产量无显著性差异（p》0.05）。
32.实施例2
33.本实施例针对蛹虫草菌cmn006的培养条件进行了进一步优化，具体如下：基础培养基：碳源为葡萄糖20g/l、氮源为蛋白胨20g/l、无机盐为磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，本发明在此基础上对碳源、氮源和无机盐组分进行筛选优化。
34.1、碳源筛选选择葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、麦芽糖、乳糖、麦芽浸粉、可溶性淀粉、糊精为碳源，替代基础培养基中的葡萄糖，浓度为20 g/l。
35.结果如图1所示，根据碳源筛选实验结果，可知添加蔗糖的蛹虫草菌cmn006虫草素含量最高，且统计学分析结果表明，蔗糖为碳源的虫草素含量与其他相比具有显著性差异，因此选择蔗糖为最佳碳源。
36.2、氮源筛选选择蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酸水解酪蛋白、酵母浸粉、牛肉浸膏、奶粉、豆柏粉、蚕蛹粉、硝酸钾、硫酸铵为碳源，替代基础培养基中的蛋白胨，浓度为20 g/l。
37.结果如图2所示，根据氮源筛选实验结果，可知添加蛋白胨的蛹虫草菌cmn006虫草素含量最高，且统计学分析结果表明，蛋白胨为氮源的虫草素含量与其他相比具有显著性差异，因此选择蛋白胨为最佳氮源。
38.3、响应面优化碳氮比碳源和氮源的配比对蛹虫草发酵液中虫草素的含量具有重要影响，因此采用响应
面法优化培养基中碳氮比。采用design-expert 12软件进行响应面实验设计，采用ccd（central composite design）设计，实验采用2因素5水平设计，具体如下表：表1 响应面实验因素水平设计表
39.表2 响应面实验结果
40.表3 响应面实验结果分析
41.根据响应面实验结果分析拟合得到模型为：r=411.46+32.37a+28.32b+3.82a
×
b-30.75a
2-90.59b2，其中r为虫草素含量（mg/l），a为蔗糖浓度（g/l），b为蛋白胨浓度（g/l）。根据模型优化得到最佳碳氮比，蔗糖为45.3g/l，蛋白胨为21.7g/l。
42.4、无机盐筛选以蔗糖45.3g/l，蛋白胨21.7g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l的培养基为对照，将其中的磷酸二氢钾和硫酸镁替换为1g/l的磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸钙、氯化钙，0.1g/l的硫酸锰，硫酸锌、氯化亚铁、氯化铁、氯化钴。考察无机盐对蛹虫草菌cmn006发酵液中虫草素含量的影响。
43.结果如图3所示，根据无机盐筛选实验结果，可知添加磷酸二氢钾、氯化钙、氯化亚铁的蛹虫草菌cmn006菌虫草素含量最高，且统计学分析结果表明，添加上述三种无机盐对虫草素含量的影响与对照差异不显著，与其他无机盐相比具有显著性差异，因此选择磷酸二氢钾、氯化钙、氯化亚铁为最佳无机盐。
44.5、虫草素合成相关化合物的添加通过上述实验得到蛹虫草菌cmn006最佳培养基配方为：蔗糖45.3g/l,蛋白胨21.7g/l，磷酸二氢钾2g/l，氯化亚铁0.2g/l，氯化钙2g/l，将此培养基作为对照培养基，在此基础上添加0.5 g/l的腺苷、一磷酸腺苷（amp）、尿苷、鸟苷、肌苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤。
45.结果如图4所示，根据虫草素合成相关化合物的添加实验结果，可知添加腺苷和腺嘌呤能够促进虫草素含量的提高，且腺嘌呤对虫草素含量的提高与腺苷提高相比具有显著性差异，因此选择腺嘌呤为最佳添加物。
46.6、蛹虫草菌株的静置培养蛹虫草菌株：cm-3与突变菌株蛹虫草菌cmn006。
47.优化培养基配方：蔗糖45.3g/l，蛋白胨21.7g/l，磷酸二氢钾 2g/l，氯化亚铁0.2g/l，氯化钙2g/l，腺嘌呤3g/l，ph 自然，加热溶解，121℃，灭菌30min。
48.静置培养条件：首先将蛹虫草菌cmn006菌株进行液体摇床培养，250ml三角瓶装上述液体培养基100ml，摇床25℃恒温培养，转速为150r/min，培养时间为7d。然后将含有蛹虫草菌cmn006菌丝体的三角瓶放置于25℃光照培养箱中静置培养10d，设定白天为8h，黑夜为16h。培养结束后将蛹虫草菌cmn006培养液吸取到ep管中，8000r/min，离心3min，无菌注射器吸取上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液直接放入高效液相色谱仪（hplc）的样品瓶中，然后采用hplc方法测定虫草素含量。上述实验重复3个批次，每批次实验中设置6个平行样品，实验结果取平均值。结果显示出发菌株cm-3虫草素含量为212.56 mg/l，突变菌株蛹虫草菌cmn006虫草素含量为2083.73 mg/l，虫草素含量比出发菌株cm-3提高8.8倍。
49.7、结论本发明采用筛选用液体培养基1培养蛹虫草菌株，出发菌株cm-3虫草素含量为78.98mg/l，突变菌株蛹虫草菌cmn006虫草素含量为305.78 mg/l，虫草素含量比出发菌株cm-3提高2.87倍。
50.本发明进一步采用优化的液体培养基培养蛹虫草菌株，出发菌株cm-3虫草素含量为212.56 mg/l，突变菌株蛹虫草菌cmn006虫草素含量为2083.73 mg/l，虫草素含量比出发菌株cm-3提高8.8倍。
51.由此可以看出，本发明提供的突变菌株蛹虫草菌cmn006具有显著较高的虫草素产量，在虫草素生产领域具有重要意义。
52.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种蛹虫草菌（cordyceps militaris）cmn006，其特征在于，保藏编号为：cgmcc no.40446。2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的蛹虫草菌cmn006。3.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述的蛹虫草菌cmn006或其发酵产物，或权利要求2所述的菌剂。4.权利要求1所述的蛹虫草菌cmn006，或权利要求2所述的菌剂在生产虫草素中的应用。5.权利要求1所述的蛹虫草菌cmn006，或权利要求2所述的菌剂在提高虫草素产量中的应用。6.一种蛹虫草菌培养基，其特征在于，包括：蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化亚铁、氯化钙和腺嘌呤；所述蔗糖和所述蛋白胨的质量比为（3~5）：（1~3）。7.根据权利要求6所述的蛹虫草菌培养基，其特征在于，以重量份计，包括蔗糖30~50份、蛋白胨10~30份、磷酸二氢钾1~3份、氯化亚铁0.1~0.3份、氯化钙1~3份和腺嘌呤1~5份。8.一种培养蛹虫草菌的方法，其特征在于，包括：采用权利要求6或7所述的蛹虫草菌培养基对所述蛹虫草菌进行培养。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的培养条件包括：在23~27℃，120~180 rpm的条件下培养7~10天后；在23~27℃条件下静置培养10~12天，昼夜比例为（6~10）：（14~18）。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高产虫草素的蛹虫草菌及其应用。所述蛹虫草菌的保藏编号为：CGMCC No.40446。本发明针对蛹虫草菌CM3进行离子束注入诱变得到一株生产虫草素效率显著提升的蛹虫草菌，并对其进行了生物保藏。该菌株遗传稳定，且各代之间虫草素产量无明显差异，比出发菌株蛹虫草菌CM3虫草素产量最高可提高8.8倍。本发明提供的蛹虫草菌虫草素产量较高，这在生产虫草素的领域具有重要意义。要意义。要意义。


技术研发人员：刘桂君 王平 乔宇琛 周思静 顾海科 候莉 宋梅芳
受保护的技术使用者：北京市科学技术研究院
技术研发日：2023.09.13
技术公布日：2023/10/20