一种阔盘吸虫的实时荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用与流程

一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针及其检测方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针及其检测方法和应用。


背景技术：

2.阔盘吸虫病是由歧腔科（又称双腔科）、阔盘属的阔盘吸虫寄生于牛、羊、鹿等草食反刍动物的胰脏胰管中，偶可寄生于胆管和十二指肠引起的疾病。由于虫体的刺激和毒素作用，使胰管发生慢性增生性炎症，胰管壁增厚，管腔缩小，甚至完全闭塞，导致消化障碍。阔盘吸虫可引起病畜消瘦，营养不良，贫血，水肿，下痢，粪便带有粘液，严重时可引起死亡。我国已发现6种阔盘吸虫分别为胰阔盘吸虫、枝睾阔盘吸虫、腔阔盘吸虫、河鹿阔盘吸虫、福建阔盘吸虫及圆睾阔盘吸虫。而造成肉牛阔盘吸虫病的主要是胰阔盘吸虫、枝睾阔盘吸虫及腔阔盘吸虫。阔盘吸虫病在我国东北、西北、内蒙古等广大草原上流行颇为严重，长江流域、西南各省和广东、福建等省均有发生，除反刍兽外，猪和人也有被寄生的报道。
3.目前对于阔盘吸虫病的检测方法相对较少，一般运用水洗沉淀法进行类便检查，但是此法并不适用于本病，因为虫卵极小一般很难在类便中以此方法检出虫卵。在具体实践中一般应结合症状及流行病情况做判断，想要确诊只能进行尸体剖检，在做剖检时主要通过观察胰脏情况，但此鉴定方法往往靠人为主观进行判断，容易造成误判。因此，依靠形态学鉴定阔盘吸虫受到了很大的局限。免疫学诊断较病原体检测敏感性高，但由于经药物治疗后病人体内的抗体仍将持续较长时间，所以抗体检测法的疗效考核效果不理想，尤其在疫区反复感染人群中无法区别是现行感染还是既往感染。
4.随着分子生物学技术的发展，pcr技术已广泛应用于病原的快速检测领域。与常规检测技术相比，此种方法不仅缩短了检测时间，而且节约了人力和物力，为病原的快速诊断提供了可靠的依据。目前国内外尚无有关利用实时荧光pcr检测方法检测阔盘吸虫的报道。


技术实现要素：

5.为此，本发明提供一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针及其检测方法和应用，其能够直观地从基因水平检测到胰阔盘吸虫、枝睾阔盘吸虫及腔阔盘吸虫的存在，实现阔盘吸虫快速、准确、特异性的检测。
6.为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：本发明的目的之一在于提供一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针，其包括引物对和探针，所述引物对为如下任一种：a1)由seq id no.1所示的单链dna和seq id no.2所示的单链dna组成；a2)由seq id no.1所示的单链dna和seq id no.2所示的单链dna经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链dna，且与a1)中所述引物对功能相同的引物对；
所述探针为seq id no.3所示的单链dna。
7.进一步的，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
8.本发明的目的之二在于提供一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测方法，所述方法为：提取待测样本的dna，以所述dna为模板，采用所述的引物、探针进行pcr扩增。
9.进一步的，所述实时荧光pcr的反应体系为：2
×
probe qpcr buffer 12.5 μl，上、下游引物（10 μmol/l）各0.8μl，探针（10 μmol/l）0.4 μl，dna模板5 μl，最后加入无核酸酶水补至25 μl。
10.进一步的，所述实时荧光pcr的反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 15 s，40个循环。
11.进一步的，合理范围内缩短或延长程序中的反应时间、更换荧光标记基团均在保护范围内。
12.本发明的目的之三在于提供一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测方法在制备阔盘吸虫检测产品中的应用。
13.本发明的有益效果：本发明针对胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫共有的基因片段作为靶基因，提供的引物对、探针灵敏度高，特异性好，利用该引物对、探针建立pcr扩增体系和反应程序，能够检测样本中的胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫这三种阔盘吸虫，检测速度快，特异性好，重复性高，灵敏度高，消除了常规检测中误检、漏检和耗时等问题，对控制阔盘吸虫感染、传播和及时防治均具有重要意义。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
15.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
16.图1为本发明实施例提供的阔盘吸虫的实时荧光pcr特异性验证试验扩增曲线图；图2为本发明实施例提供的胰阔盘吸虫的实时荧光pcr敏感性验证试验扩增曲线图；图3为本发明实施例提供的腔阔盘吸虫的实时荧光pcr敏感性验证试验扩增曲线图；图4为本发明实施例提供的枝睾阔盘吸虫的实时荧光pcr敏感性验证试验扩增曲线图。
具体实施方式
17.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明
书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、阔盘吸虫的实时荧光pcr引物对、探针设计
18.针对胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫共有的基因片段设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时设计位于上下游引物间的taq man荧光探针。合成特异的针对胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫共有的基因片段的实时荧光pcr检测引物、探针如表1所示。
19.表1 实时荧光pcr检测引物、探针
20.胰阔盘吸虫基因序列如下（seq id no.4）：tcattaaatcagctatggttccttagatcgtacatactacatggataactgtagtaattctagagctaatacatgccaacatgccctgacccgggaacgggaacgggtggttttattagaacagaaccaaccggttgtggttcacgccacagccgttgcactctgtgatgactctggataacttcactgatcgcagtcgg。
21.腔阔盘吸虫基因序列如下（seq id no.5）：ggttccttagatcgtacctactacatggataactgtagtaattctagagctaatacatgccaacatgccctgacccgggaacgggaacgggtggttttattagaacagaaccaaccggctgtggttcgcgccacagctgttgcactctgtgatgactctggataacttcactgatcgcagtcggccttgtgtcggcgacg。
22.枝睾阔盘吸虫基因序列如下（seq id no.6）：ctgtagtaattctagagctaatacatgccaacatgccctgacccgggaacgggaacgggtggttttattagaacagaaccaaccggttgtggttcacgccacatccgttgcactctgtgatgactctggataacttcactgatcgcagtcggccttgcgtcggcgacggatctttcaaatgtctgccctatcaattttcg。
实施例2、胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫阳性质粒制备
23.1、申请人委托生物公司（通用生物（安徽）股份有限公司）分别合成含有胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫的基因组片段的质粒。
24.将含有目标扩增片段的质粒用核酸蛋白分析仪测定260nm与280nm波长下的od值，判断其纯度（od
260nm
/od
280nm
》1.8者为纯品），运用公式：拷贝数（copies/μl）=质粒浓度（ng/μl）
×
10-9
×
6.02
×
10
23
/（660（bp）
×
质粒碱基数（bp））计算出质粒浓度拷贝数。胰阔盘吸虫质粒浓度为40.6 ng/ μl，总长为3026 bp，所得拷贝数为1.23
×
10
10 copies/μl；腔阔盘吸虫质粒浓度为50.5 ng/μl，总长为3026 bp，所得拷贝数为1.53
×
10
10 copies/μl；枝睾阔盘吸虫质粒浓度为61.2 ng/μl，总长为3026 bp，所得拷贝数为1.85
×
10
10 copies/μl，将3种阳性质粒标准品放-20℃以下保存备用。
25.将阳性质粒标准品按10倍倍比稀释，稀释为1.23～1.23
×
107copies/μl 8个梯度
的胰阔盘吸虫质粒，1.53～1.53
×
107copies/μl 8个梯度的腔阔盘吸虫质粒，1.85～1.85
×
107copies/μl 8个梯度的枝睾阔盘吸虫质粒。
实施例3、实时荧光pcr反应条件的构建
26.以实施例2制备的阳性质粒为模板进行pcr扩增，对pcr反应体系、反应程序进行优化，选取ct值最小、荧光值最高的pcr反应条件。优化后的pcr反应条件为：实时荧光pcr的反应体系为：2
×
probe qpcr buffer 12.5 μl，上、下游引物（10 μmol/l）各0.8μl，探针（10 μmol/l）0.4 μl，dna模板5 μl，最后加入无核酸酶水补至25 μl。
27.实时荧光pcr的反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 15 s，40个循环。
28.实时荧光pcr判定标准：ct值小于38则判定为阳性，ct值＞38或无ct值，且无明显扩增曲线，则判定为阴性。
实施例4、实时荧光pcr检测方法特异性验证试验
29.为了验证建立的实时荧光pcr检测方法的特异性，采用实施例1设计的引物对、探针以及实施例3中实时荧光pcr反应条件，分别以牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、羊组织匀浆核酸作为检测模板，实施例2中的阳性质粒标准品为阳性模板，同时设立双蒸水为阴性对照，进行实时荧光pcr检测，由图1可知，该实时荧光pcr检测方法只能特异性扩增胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫、枝睾阔盘吸虫，其他样本和阴性对照均无特异性扩增。
30.图1扩增曲线从左到右依次为：浓度为1.23
×
105copies/μl胰阔盘吸虫的阳性质粒、浓度为1.53
×
105copies/μl腔阔盘吸虫的阳性质粒、浓度为1.85
×
105copies/μl枝睾阔盘吸虫的阳性质粒。
实施例5、实时荧光pcr检测方法敏感性验证试验
31.为了验证建立的实时荧光pcr检测方法的敏感性，采用实施例1设计的引物对、探针以及实施例3中实时荧光pcr反应条件，分别以实施例2中稀释后的不同稀释梯度的胰阔盘吸虫质粒、腔阔盘吸虫质粒、枝睾阔盘吸虫质粒为阳性模板，同时设置双蒸水作为阴性对照，进行实时荧光pcr扩增，检验实时荧光pcr方法的敏感性。该实时荧光pcr方法所能检出的胰阔盘吸虫模板的最低拷贝数浓度为：1.23 copies/μl（见图2），腔阔盘吸虫的最低拷贝数浓度为：1.53 copies/μl（见图3），枝睾阔盘吸虫的最低拷贝数浓度为：1.85 copies/μl（见图4）。每个反应体系加入5μl核酸，因此本方法所能检出的检测下限为：胰阔盘吸虫6.15 copies/反应、腔阔盘吸虫7.65 copies/反应、枝睾阔盘吸虫9.25 copies/反应，表明该实时荧光pcr检测方法具有极高的灵敏性。
32.图2扩增曲线从左到右依次为：1.23
×
107copies/μl、1.23
×
106copies/μl、1.23
×
105copies/μl、1.23
×
104copies/μl、1.23
×
103copies/μl、1.23
×
102copies/μl、1.23
×
101copies/μl、1.23
×
100copies/μl胰阔盘吸虫的阳性质粒。
33.图3扩增曲线从左到右依次为：1.53
×
107copies/μl、1.53
×
106copies/μl、1.53
×
105copies/μl、1.53
×
104copies/μl、1.53
×
103copies/μl、1.53
×
102copies/μl、1.53
×
101copies/μl、1.53
×
100copies/μl腔阔盘吸虫的阳性质粒。
34.图4扩增曲线从左到右依次为：1.85
×
107copies/μl、1.85
×
106copies/μl、1.85
×
105copies/μl、1.85
×
104copies/μl、1.85
×
103copies/μl、1.85
×
102copies/μl、1.85
×
101copies/μl、1.85
×
100copies/μl枝睾阔盘吸虫的阳性质粒。
实施例6、实时荧光pcr检测方法重复性验证试验
35.采用实施例1设计的引物对、探针以及实施例3中实时荧光pcr反应条件，分别以实施例2中稀释过的不同稀释梯度的胰阔盘吸虫质粒、腔阔盘吸虫质粒、枝睾阔盘吸虫质粒分别设置3个批内重复和批间重复，进行组间平行试验和组内平行试验。比较组内和组间的ct值及变异系数，检验分析该方法的重复性。批内批间重复变异系数均小于3%（见表2-4），结果表明该检测方法具有良好的重复性。
36.表2胰阔盘吸虫的实时荧光pcr重复性试验结果
37.表3 腔阔盘吸虫的实时荧光pcr重复性试验结果
38.表4 枝睾阔盘吸虫的实时荧光pcr重复性试验结果
实施例7、阔盘吸虫实时荧光pcr检测试剂盒制备
39.1、pcr反应液的制备：2
×
probe qpcr buffer 12.5 μl，上、下游引物（10 μmol/l）各0.8μl，探针（10 μmol/l）0.4 μl，dna模板5 μl，最后加入无核酸酶水补至25 μl。根据样本反应数量等比例放大或缩小。
40.2、阳性对照的制备：实施例2制备的胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫阳性质粒分别稀释至1.23
×
105copies/μl、1.53
×
105copies/μl、1.85
×
105copies/μl，各5μl，混合后作为阳性对照。
41.3、阴性对照的制备：以双蒸水为阴性对照。
42.4、组装：将pcr反应液、阳性对照、阴性对照组装后，即为阔盘吸虫实时荧光pcr检测试剂盒。
实施例8、阔盘吸虫实时荧光pcr检测试剂盒应用
43.收集肉牛养殖场30份临床粪便样本，样本采集后，用购于天根生化科技有限公司的基因组dna提取试剂盒提取样本核酸，提取的核酸作为模板，采用实施例7制备的阔盘吸虫实时荧光pcr检测试剂盒进行检测，结果表明，3份样本为阳性，27份样本为阴性，见表5，制备的阔盘吸虫实时荧光pcr检测试剂盒可应用于临床样本检测。
44.表5临床样本检测结果
45.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针，其特征在于，包括引物对和探针，所述引物对为如下任一种：a1)由seq id no.1所示的单链dna和seq id no.2所示的单链dna组成；a2)由seq id no.1所示的单链dna和seq id no.2所示的单链dna经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链dna，且与a1)中所述引物对功能相同的引物对；所述探针为seq id no.3所示的单链dna。2.根据权利要求1所述的一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。3.一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，所述方法为：提取待测样本的dna，以所述dna为模板，采用权利要求1中所述的引物、探针进行pcr扩增。4.根据权利要求3所述的一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，所述实时荧光pcr的反应体系为：2
×
probe qpcr buffer 12.5 μl，上、下游引物（10 μmol/l）各0.8μl，探针（10 μmol/l）0.4 μl，dna模板5 μl，最后加入无核酸酶水补至25 μl。5.根据权利要求3所述的一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，所述实时荧光pcr的反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 15 s，40个循环。6.权利要求3-5任一项所述的一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测方法在制备阔盘吸虫检测产品中的应用。

技术总结
本发明涉及一种阔盘吸虫的实时荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用。一种阔盘吸虫的实时荧光PCR检测引物、探针，包括引物对和探针，所述引物对为如下任一种：a1)由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；a2)由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链DNA，且与a1)中所述引物对功能相同的引物对。本发明采用的荧光PCR检测方法重复性好，灵敏度高，特异性强，可对胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫和枝睾阔盘吸虫进行筛查，对控制阔盘吸虫感染、传播和防治具有重要意义。传播和防治具有重要意义。传播和防治具有重要意义。


技术研发人员：赵方圆 宋铮 巩玉洁 赵荣茂 张琼林 陈娟 杨晓霞 袁婷婷
受保护的技术使用者：北京纳百生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.13
技术公布日：2023/10/20