一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法及应用

1.本发明属于生物与新医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法及应用。


背景技术：

2.外泌体(exosomes)产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30～150nm的膜性囊泡，密度为1.13-1.19g/ml，有典型的“杯盘”形态。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，近乎于平均每个人体细胞产生1000-10000个。通常1ml血液中存在1
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个外泌体。外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、mirna、lncrna、circrna、mrna以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。已有研究报道，外泌体在心血管疾病中起重要作用。中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞分泌的外泌体，携载mirna、lncrna和蛋白质与心血管疾病密切相关。
3.植物外泌体是由植物细胞分泌的纳米级小囊泡，内含dna、小rna(small rna，srna)、微小rna(microrna，mirna)和蛋白质等物质，介导细胞间的通讯。植物外泌体通过所含物质发挥抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等作用，参与病原体侵袭的防御反应。植物外泌体纳米粒大多可食用，可作为递送特定药物的载体，无毒性及副作用。近年来，植物来源外泌体或囊泡，因其低毒性、高靶向性、大规模生产可行性，及其可能在生命健康维系中的重要性受到广泛关注。
4.三七(panax notoginseng(burk.)f.h.chen)别名滇三七，主要分布于云南、广西等地，其以根茎入药，化学成分主要有皂苷、氨基酸、黄酮等。三七具有促进血液循环、保护心脑血管等多种功效；三七能够诱导骨髓间充质干细胞(bmsc)进入外周血，并促进bmsc归巢于受损部位进行修复。三七总皂苷具有保护平滑肌细胞免受高脂损伤、抗炎、抗凋亡、抗氧化、降血脂、抗凝和促血管生成等功能。外泌体在心血管疾病的发生发展中起重要作用，但来源受限，价格昂贵。而植物来源外泌体，毒性低、靶向性好、安全，具备大规模生产潜力。有研究报道，口服植物来源外泌体能够刺激巨噬细胞发挥抗炎作用，然而来源于跨界的外泌体或囊泡，在心血管中的研究，尚未见报道。
5.随着我国居民生活方式改变、饮食、烟草滥用、环境以及工作等多种因素的影响，心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular disease，cvd)的发病率逐年增高。虽然目前面对心血管疾病已有多种多样的药物以及干预手段，但其的发病率仍然逐年增加，对我国造成严重的医疗负担，严重危害国民的生命与健康。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
7.(1)虽然目前面对心血管疾病已有多种多样的药物以及干预手段，但其的发病率仍然逐年增加，对我国造成严重的医疗负担，严重危害国民的生命与健康。
8.(2)细胞来源外泌体在心血管疾病的发生发展中起重要作用，但来源受限，价格昂贵。
9.(3)口服植物来源外泌体能够刺激巨噬细胞发挥抗炎作用，然而来源于跨界的外泌体或囊泡，在心血管中的研究，尚未见报道。


技术实现要素：

10.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法及应用。
11.本发明是这样实现的，一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法，所述用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法包括：
12.步骤一，从市面购买得到三七成品纯干粉，将三七干粉过筛，加入适量pbs，放入匀浆机中制成糊状匀浆，过滤；
13.步骤二，加入蛋白酶抑制剂，并用1mol/l tris-hcl调节ph至7，差速离心法取沉淀；
14.步骤三，用20mmol/l tris-hcl重悬沉淀，并充分涡旋；
15.步骤四，保存在-80℃或更低温度下备用检测。
16.进一步，所述将三七干粉过筛溶解，采用差速离心法离心。
17.本发明的另一目的在于提供一种用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法的应用，所述用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法的应用包括三七干粉外泌体的鉴定和三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的表型影响。
18.进一步，所述三七干粉外泌体的鉴定，包括：
19.(1)外泌体样品透射电镜观察
20.将外泌体取出10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，醋酸双氧铀10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，100kv进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果；
21.(2)外泌体样品粒径分析，取冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置，外泌体样本用1
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pbs进行稀释，直接用于nta检测。
22.进一步，所述三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的表型影响，包括：
23.(1)细胞培养，复苏人脐静脉内皮细胞，传代培养待用；
24.(2)huvecs细胞铺板后，将三七干粉外泌体转染至huvecs培养24小时检测转染效率；
25.(3)细胞活力检测，将添加三七干粉外泌体不同组别的细胞接种至96孔板，以不同时间点培养后每孔加入10μl cck-8溶液检测细胞的增殖；
26.(4)细胞凋亡检测，在添加三七干粉外泌体不同组别不同时间点处理后的细胞，加入195μl annexin v-fitc结合液轻轻重悬细胞；加入5μl annexin v-fitc，轻轻混匀；加入10μl碘化丙啶染色液，上机检测；
27.(5)transwell迁移实验，在24孔板的transwell小室上室接种不同组别的细胞，下室接种含有10％fbs的dmem培养基，培养24小时后，结晶紫染色后在显微镜下拍照。
28.进一步，所述细胞培养，用内皮细胞培养基础培养基+5％胎牛血清+1％内皮细胞
培养添加剂+1％青链霉素双抗；待细胞贴壁面积超过80％后，进行传代或接板；细胞培养需置于培养箱内，培养环境设置为温度37℃，浓度5％co2。
29.进一步，所述三七干粉外泌体转染至huvecs。取1ml三七干粉源外泌体样纳米囊泡，加入2.5μl的外泌体绿色荧光标记染料(pkh67)染色20min，100000g离心1h，20mmol/l tris-hcl重悬沉淀，100000g离心1h，洗去染色液，洗涤过程重复2次，最终用1ml 20mmol/l tris-hcl重悬标记外泌体样纳米囊泡，避光-80℃保存。将huvecs以1.2
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105个细胞/孔接种于6孔培养板内，培养2h，加入上述pkh26染色的外泌体(稀释50倍)在37℃下共孵育24h；用pbs清洗细胞2次，用4％的多聚甲醛固定5分钟，然后用pbs洗3次；用dapi染细胞核；载玻片上加抗荧光猝灭剂，指甲油封片；激光共聚焦显微镜拍照。
30.结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
31.第一，三七，主要分布于云南、广西等地，其以根茎入药，化学成分主要有皂苷、氨基酸、黄酮等，在日常生活中原料易得。三七纯干粉安全性高，制备工艺简单、获得率高，市场前景可观、蕴藏着较好的社会和经济价值。本发明为第一次成功提取一种三七干粉外泌体；通过多种实验，发现三七干粉外泌体可以增强人脐静脉内皮细胞(huvecs)的增殖能力，抑制其凋亡，促进其迁移，具有治疗心血管疾病的潜力。
32.第二，本发明通过高速离心分离提取三七干粉外泌体，用100kv进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果显示三七干粉外泌体呈杯状结构。外泌体样品粒径分析，经nta表明三七干粉外泌体的粒径约为179.5nm。随后通过三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的表型影响，发现三七干粉外泌体可以增强人脐静脉内皮细胞(huvecs)的增殖能力，抑制其凋亡，促进其迁移，具有治疗心血管疾病的潜力。
33.第三，本发明所用的材料三七干粉安全性高，制备工艺简单、市场获得率高。三七干粉外泌体的提取方法简单，易操作。外泌体在心血管疾病的发生发展中起重要作用，本发明克服了细胞外泌体来源受限，价格昂贵的问题。本发明的植物来源外泌体，毒性低、靶向性好、安全，具备大规模生产潜力。
附图说明
34.图1是本发明实施例提供的用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法流程图；
35.图2是本发明实施例提供的三七干粉外泌体结构图；
36.图3是本发明实施例提供的三七干粉外泌体样品粒径分析图；
37.图4是本发明实施例提供的三七干粉外泌体转染至huvecs示意图；
38.图5是本发明实施例提供的细胞活力检测分析图；
39.图6是本发明实施例提供的细胞凋亡检测结果图；a，b，c为huvecs+三七粉-exo的三组对比，d，e，f为huvecs+pbs的三组对比，g，h，i为huvecs+pa+pbs的三组对比，j，k，l为huvecs+pa+三七粉-exo的三组对比，m为blank结果图，n为fitc结果图，o为pi结果图；
40.图7是本发明实施例提供的细胞凋亡检测分析图；
41.图8是本发明实施例提供的三七干粉外泌体促进huvecs细胞的迁移分析图。
具体实施方式
42.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
43.下面结合具体实施例对本发明进一步说明：
44.实例一：
45.如图1所示，本发明实施例提供的用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法包括以下步骤：
46.s101，从市面购买得到三七成品纯干粉，将三七干粉过筛，加入适量pbs，放入匀浆机中制成糊状匀浆，过滤；
47.s102，在滤液中按1：100加入蛋白酶抑制剂，并用1mol/l tris-hcl调节ph至7，依次500g、1000g、15000g离心20min，取上清后，再100000g离心1h；
48.s103，取离心得到的沉淀，用20mmol/l tris-hcl重悬沉淀，并充分涡旋；
49.s104，将重悬液保存在-80℃或更低温度下备用检测。
50.本发明实施例提供的用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法的应用，包括三七干粉外泌体的鉴定和三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的表型影响。
51.实例二：
52.本发明实施例提供的三七干粉外泌体的鉴定，包括：
53.(1)外泌体样品透射电镜观察
54.将冻存在-80℃的外泌体零下解冻取出10μl。吸取样品10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。醋酸双氧铀10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟。100kv进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果，如图2所示，三七干粉外泌体呈杯状结构。
55.(2)外泌体样品粒径分析，取冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置。外泌体样本用1
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pbs进行稀释，直接用于nta检测。如图3所示，三七干粉外泌体的粒径约为179.5nm。
56.实例三：
57.本发明实施例提供的三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的表型影响，包括：
58.细胞培养，复苏人脐静脉内皮细胞(本室传代冻存)：用内皮细胞培养基础培养基+5％胎牛血清+1％内皮细胞培养添加剂+1％青链霉素双抗；待细胞贴壁面积超过80％后，细胞胰酶消化后进行传代或接板；细胞培养需置于thermo细胞培养箱内，培养环境设置为温度37℃，浓度5％co2。
59.三七干粉外泌体转染至huvecs：
60.取1ml三七干粉源外泌体样纳米囊泡，加入2.5μl的外泌体绿色荧光标记染料(pkh67)染色20min，100000g离心1h，20mmol/l tris-hcl重悬沉淀，100000g离心1h，洗去染色液，洗涤过程重复2次，最终用1ml 20mmol/l tris-hcl重悬标记外泌体样纳米囊泡，避光-80℃保存。将huvecs以1.2
×
105个细胞/孔接种于6孔培养板内，培养2h，加入上述pkh26染色的外泌体(稀释50倍)在37℃下共孵育24h；用pbs清洗细胞2次，用4％的多聚甲醛固定5分钟，然后用pbs洗3次；用dapi染细胞核；载玻片上加抗荧光猝灭剂，指甲油封片；激光共聚
焦显微镜拍照。
61.(3)细胞活力检测：将处于对数生长期的细胞胰酶消化后进行分组处理，分别为三七干粉外泌体组(三七粉-exo)，pbs组，pbs+棕榈酸(pa)组(pa 0.8mm+pbs)，三七外泌体+棕榈酸(pa)组(pa 0.8mm+三七粉-exo)。每组接种1000个细胞至96孔板，每孔100μl培养基，将培养板置37℃，5％co2培养箱中培养0h、24h、48h和72h；每孔加入10μl cck-8溶液，用加了相应量细胞培养液和cck-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；在细胞培养箱内继续孵育0.5h-4h，观察培养基颜色变化后用酶标仪在450nm测定吸光度。
62.(4)细胞凋亡检测：将处于对数生长期的细胞胰酶消化以1.2
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105个细胞/孔接种于6孔培养板内进行分组处理，分别为三七干粉外泌体组，pbs组，pbs+棕榈酸(pa)组，三七外泌体+棕榈酸(pa)组培养24小时。把不同组别的细胞培养液吸出至一合适离心管内，pbs洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有edta)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。加入收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用pbs轻轻重悬细胞并计数。取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl annexin v-fitc结合液轻轻重悬细胞。加入5μl annexinv-fitc，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中，立即流式细胞仪检测。
63.(5)transwell迁移实验：将处于对数生长期的细胞胰酶消化后进行分组处理，分别为三七干粉外泌体组，pbs组，pbs+棕榈酸(pa)组，三七外泌体+棕榈酸(pa)组。用无血清的dmem重悬制备成细胞悬液，血球计数板计数；24孔板的transwell小室上室接种1
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104个上述细胞，下室接种含有10％fbs的dmem培养基，置于37℃、5％co2培养箱中进行培养；24小时后吸干孔板里面的培养基；用4％的多聚甲醛固定15min；结晶紫染色20min，用pbs清洗，在显微镜下拍照。
64.如图2所示，三七干粉外泌体呈杯状结构；
65.如图3所示，三七干粉外泌体粒径约为179.5nm，浓度为2.0e+12particles/ml；
66.如图4所示，首先细胞被分为三七粉-exo组，pbs组，pbs+棕榈酸(pa)组，三七粉-exo+棕榈酸(pa)组。不同组别对比表明，带红色荧光的三七干粉外泌体大量聚集在huvecs的细胞质中，说明三七干粉外泌体能成功转入huvecs细胞中。
67.如图5所示，首先细胞被分为三七粉-exo组，pbs组，pbs+棕榈酸(pa)组，三七粉-exo组+棕榈酸(pa)组。棕榈酸(pa)可导致细胞发生氧化应激反应和炎症反应。在0，24，48，24小时时，细胞以时间依赖增长，三七干粉外泌体能促进huvecs细胞的增殖，而pbs+棕榈酸(pa)组呈现出较低的增长趋势。
68.如图6，7所示，细胞不同组别，三七粉-exo组，与pbs组相比，凋亡的细胞数目明显减少；pa+三七粉-exo组，与pa+pbs组相比，凋亡的细胞数目明显减少；pa+三七粉-exo组，与三七粉-exo组相比，凋亡的细胞数目明显增加；pa+pbs组，与pbs组相比，凋亡的细胞数目明显增加。三七干粉外泌体能抑制huvecs细胞的凋亡。***表示p＜0.01。具体数据统计如表1所示。
69.表1
[0070][0071]
如图8所示，经三七粉-exo处理后，与pbs组细胞相比，huvec细胞的迁移能力明显升高，具有统计学意义，三七干粉外泌体能促进huvecs细胞的迁移。***表示p＜0.01。
[0072]
以上数据表明，三七干粉外泌体可以增强huvecs的增殖能力，抑制其凋亡，促进其迁移，具有治疗心血管疾病的潜力。本发明第一次成功提取三七干粉外泌体，并且其有治疗心血管疾病的潜力。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法，其特征在于，所述用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法包括：步骤一，从市面购买得到三七成品纯干粉，将三七干粉过筛，加入适量pbs，放入匀浆机中制成糊状匀浆，过滤；步骤二，加入蛋白酶抑制剂，并用1mol/l tris-hcl调节ph至7，依次500g、1000g、15000g离心20min，取上清后，再100000g离心1h；步骤三，取沉淀，用20mmol/l tris-hcl重悬沉淀，并充分涡旋；步骤四，保存在-80℃或更低温度下备用检测。2.根据权利要求1所述的用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法，其特征在于，所述将三七干粉过筛溶解，采用差速离心法离心。3.一种实施如权利要求1-2任意一项所述用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用包括三七干粉外泌体的鉴定和三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的表型影响。4.根据权利要求3所述的用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述三七干粉外泌体的鉴定，包括：(1)外泌体样品透射电镜观察将外泌体取出10μl，吸取样品10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，醋酸双氧铀10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，100kv进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果；(2)外泌体样品粒径分析，取冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置，外泌体样本用1
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pbs进行稀释，直接用于nta检测。5.根据权利要求3所述的用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的表型影响，包括：(1)细胞培养，复苏人脐静脉内皮细胞，传代培养待用；(2)huvecs细胞铺板后，将三七干粉外泌体转染至huvecs培养24小时检测转染效率；(3)细胞活力检测，将添加三七干粉外泌体不同组别的细胞接种至96孔板，以不同时间点培养后每孔加入10μl cck-8溶液检测细胞的增殖；(4)细胞凋亡检测，在添加三七干粉外泌体不同组别不同时间点处理后的细胞，加入195μl annexin v-fitc结合液轻轻重悬细胞；加入5μl annexin v-fitc，轻轻混匀；加入10μl碘化丙啶染色液，上机检测；(5)transwell迁移实验，在24孔板的transwell小室上室接种不同组别的细胞，下室接种含有10％fbs的dmem培养基，培养24小时后，结晶紫染色后在显微镜下拍照。6.根据权利要求5所述的用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述细胞培养，用内皮细胞培养基础培养基+5％胎牛血清+1％内皮细胞培养添加剂+1％青链霉素双抗；待细胞贴壁面积超过80％后，进行传代或接板；细胞培养需置于培养箱内，培养环境设置为温度37℃，浓度5％co2。7.根据权利要求5所述的用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述三七干粉外泌体转染至huvecs。取1ml三七干粉源外泌体样纳米囊泡，加入2.5μl的外泌体绿色荧光标记染料(pkh67)染色20min，100000g离心1h，20mmol/l tris-hcl重悬
沉淀，100000g离心1h，洗去染色液，洗涤过程重复2次，最终用1ml 20mmol/l tris-hcl重悬标记外泌体样纳米囊泡，避光-80℃保存。将huvecs以1.2
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105个细胞/孔接种于6孔培养板内，培养2h，加入上述pkh26染色的外泌体(稀释50倍)在37℃下共孵育24h；用pbs清洗细胞2次，用4％的多聚甲醛固定5分钟，然后用pbs洗3次；用dapi染细胞核；载玻片上加抗荧光猝灭剂，指甲油封片；激光共聚焦显微镜拍照。

技术总结
本发明属于生物与新医药技术领域，公开了一种用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法及应用，包括：从市面购买得到三七成品纯干粉，将三七干粉过筛，加入适量PBS，放入匀浆机中制成糊状匀浆，过滤；加入蛋白酶抑制剂，并用1mol/L Tris-HCl调节pH至7，依次500g、1000g、15000g离心20min，取上清后，再100000g离心1h；取沉淀，用20mmol/L Tris-HCl重悬沉淀，并充分涡旋；保存在-80℃或更低温度下备用检测。本发明第一次成功提取一种三七干粉外泌体，通过多种实验，发现三七干粉外泌体可以增强HUVECs的增殖能力，抑制其凋亡，促进其迁移，具有治疗心血管疾病的潜力。血管疾病的潜力。血管疾病的潜力。


技术研发人员：蒋立虹 邵瑞飞 滕兆伟 姚梦瑜 曹宇 刘劼 赵婕 程雪梅 罗建丽 陈锐 李昆林 杨童硕
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2023.08.04
技术公布日：2023/10/20