一种生物转化合成尿苷酸的方法与流程

1.本发明涉及制备尿苷酸的方法，以尿嘧啶核苷和乙酰磷酸钾盐为主原料，通过酶法合成尿嘧啶核苷酸，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.尿苷酸(uridine monophosphate,ump)又名尿嘧啶核苷酸，由尿嘧啶、核糖及磷酸构成，与其他三种核苷酸共同构成rna分子，化学分子式为c9h
13
n2o9p，分子量为324.18，cas号为58-97-9，白色晶体，尿苷酸分子中的共轭结构，使其在波长260nm处有强烈紫外吸收。
3.尿苷酸作为重要的核苷酸产品，在农业、畜牧业、食品领域及医药领域中均有广泛的应用。作为母乳中含量第二大的核苷酸，它是婴幼儿食品中常用的添加剂，提高婴幼儿的免疫功能，促进生长发育。医药领域中，尿苷酸作为药物前体，参与肝炎等的治疗。尿苷酸也可作为膜磷脂的前体提高脑部尿苷胆碱和乙酰胆碱水平。尿苷酸在心肌保护方面可以通过激活心脏的线粒体atp依赖性钾通道的活性来发挥作用，对于改善冠心病等具有辅助治疗的作用。
4.现有的尿苷酸的生产方法主要为化学合成法、酶解法、生物法。化学合成法包括磷酸化法和脱氨法，其中磷酸法是以尿苷为原料，将2,3位羟基保护后再采用有毒pocl3试剂作为磷酸化试剂合成尿苷酸；脱氨法是以胞苷酸为原料，在酸性条件下经过脱氨反应，将胞苷酸直接变成尿苷酸，化学法生产安全性差、容易造成污染生产成本也很高。酶解法是利用核酸酶水解核糖核酸(rna)得到四种单核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸)混合物后，再经过离子交换法分离精制得到尿苷酸。酶解法生产周期长，分离精制工序复杂，加工成本高。生物法包括利用产氨短杆菌以乳清酸为底物通过两步法转化成尿苷酸，利用酿酒酵母全细胞催化乳清酸合成尿苷酸，但存在生产周期长，生产工艺繁琐等问题。
5.利用尿苷激酶以尿苷为底物催化合成尿苷酸，该方法生产周期短收率高，但现有技术高度依赖gtp或六偏磷酸钠为磷酸供体，生产成本过高。


技术实现要素：

6.鉴于以上生产技术缺陷，本发明提供了一种生物转化合成尿苷酸的方法。该工艺在于以廉价的原料乙酰磷酸二钾盐为磷酸供体、尿苷为底物，利用尿苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同作用进行生物转化，得到尿苷酸(ump)，整个过程相当于乙酰磷酸二钾盐上磷酸直接转到尿苷上生成尿苷酸，开发了一条合成ump新途径。该工艺过程简单、原料来源方便，成本低廉、生产周期短、产物收率高、可操作性强，具备极强市场竞争力。
7.本发明所述生物转化合成尿苷酸的方法，包括如下步骤：以尿苷和乙酰磷酸二钾盐为原料，在尿苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同作用下进行生物转化，得到尿苷酸。
8.进一步地，在上述技术方案中，在转化体系中加入少量atp、mg
2+
启动反应；采用的反应方程式表示为：
[0009][0010]
本发明是一种以尿苷为底物，偶联合成尿苷酸的方法，整个合成过程具体包括：多聚磷酸盐激酶的制备、尿苷激酶的制备、偶联生物转化反应等三个过程。
[0011]
进一步地，在上述技术方案中，所述多聚磷酸盐激酶制备包括：
[0012]
a、将ppk基因工程菌在合适条件下进行活化培养。所述ppk基因序列为序列表中，seq id no.1所示的核苷酸序列。
[0013]
b、将ppk基因工程菌进行补料分批高密度发酵培养，待菌体浓度od
600
＝12-16时加入诱导剂iptg诱导培养8-12h。离心收集多聚磷酸盐激酶基因工程菌湿菌体。
[0014]
进一步地，在上述技术方案中，尿苷激酶制备包括：
[0015]
a、将uck基因工程菌在合适条件下进行活化培养。所述uck基因为序列表中，seq id no.2所示的核苷酸序列。
[0016]
b、将uck基因工程菌进行补料分批高密度发酵培养，待菌体浓度od
600
＝12-16时加入诱导剂iptg诱导培养8-12h。离心收集尿苷激酶基因工程菌湿菌体。
[0017]
进一步地，在上述技术方案中，偶联生物转化包括：在反应体系中添加包括尿苷及乙酰磷酸二钾盐在内的底物原料，两种湿菌体酶，并加入少量atp、mg
2+
催化反应。
[0018]
发明有益效果
[0019]
1、生物转化反应底物
[0020]
该生物转化合成尿苷酸的底物为尿苷，磷酸供体底物原料是以乙酰磷酸二钾盐，极大降低了生产成本。
[0021]
2、转化反应体系
[0022]
该工艺合成目标产物尿苷酸所用反应体系是以纯化水作为反应体系直接进行生物转化反应，成本低廉、对环境友好、易操作、易产业化。
[0023]
3、生产效率高
[0024]
该合成技术以纯化水为溶剂，不需要缓冲体系直接进行生物转化反应合成产物尿苷酸，与文献报道相比该工艺目的产物积累浓度高，合成液中ump达到106.23g/l，工艺过程简单、原料来源方便，成本低廉、生产周期短、产物收率高、可操作性强，易于产业化。
[0025]
说明书附图
[0026]
图1为实施例3中反应温度优化图；
[0027]
图2为实施例4中ph值优化图；
[0028]
图3为实施例5中反应液液相色谱检测图。
具体实施例
[0029]
实施例1多聚磷酸盐激酶制备
[0030]
将甘油管中的ppk菌划线至lb固体平板中，挑取单克隆菌落再次划线获取ppk纯菌种，挑取ppk菌种接至lb液体培养基中，37℃、200rpm培养6h。将上述活化后的菌液以2％接种量转接至二级培养基中，先以37℃、200rpm的条件培养至菌体浓度od
600
＝0.6，再以10％接种量接种至4l发酵罐，培养菌体浓度od
600
＝16时加入诱导剂iptg，诱导培养8h后，离心收集ppk湿菌体236g。
[0031]
实施例2尿苷激酶制备
[0032]
将甘油管中的uck菌划线至lb固体平板中，挑取单克隆菌落再次划线获取uck纯菌种，挑取uck菌种接至lb液体培养基中，37℃、200rpm培养6h。将上述活化后的菌液以2％接种量转接至二级培养基中，先以37℃、200rpm的条件培养至菌体浓度od
600
＝0.6，再以10％接种量接种至4l发酵罐，培养菌体浓度od
600
＝16时加入诱导剂iptg，诱导培养8h后，离心收集ppk湿菌体260g。
[0033]
实施例3温度优化反应
[0034]
根据底物配比准确称取：尿苷3g、乙酰磷酸二钾盐4g、atp二钠盐0.15g、氯化镁0.165g，用碱调节ph至7.2，加入uck酶0.6g、ppk酶0.6g，纯化水定容到30ml。分别在20、30、40、50、60℃条件下反应3-9h，经高效液相色谱检测ump的生成量。最终测定在30℃反应温度下，ump生成量更佳(图1)，7h时尿苷酸生成量达到51.68g/l，底物摩尔转化率为38.93％。
[0035]
实施例4ph优化反应
[0036]
根据底物配比准确称取：尿苷3g、乙酰磷酸二钾盐4g、atp二钠盐0.15g、氯化镁0.165g，分别用碱调节ph为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入uck酶0.6g、ppk酶0.6g，纯化水定容到30ml。在30℃条件下以500rpm转速搅拌反应3-9h，经高效液相色谱检测ump的生成量。最终测定在ph为6.0、7.0时产物尿苷酸的转化率达到42.75％、43.7％，显著高于其他ph水平，即反应初始ph在6.0-7.0范围内的反应效果最佳(图2)。
[0037]
实施例5 3l放大反应
[0038]
根据底物配比准确称取：尿苷300g、atp二钠盐15g、氯化镁16.5g、乙酰磷酸二钾盐600g，用碱调节ph为7.2，分别按比例加入uck酶60g、ppk酶60g，纯化水定容到3l。
[0039]
在30℃条件下反应9-12h，经高效液相色谱检测ump的生成量(图3)。最终测定反应至10h，尿苷酸浓度最高为106.23g/l，底物摩尔转化率可达到80％。
[0040]
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书的描述只是用来解释本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
[0041]
序列表
[0042]
seq id no.1
[0043]
atgggtcaggaaaagctatacatcgaaaaagagctcagttggttatcgttcaatgaacgcgtgcttcaggaagcggcggacaaatctaacccgctgattgaaaggatgcgtttcctggggatctattccaataaccttgatgagttctataaagtccgcttcgctgaactgaagcgacgcatcattattagcgaagaacaaggctccaactctcattcccgccatttactgggcaaaattcagtcccgggtgctgaaagccgatcaggaattcgacggcctctacaacgagctatt
gctggagatggcgcgcaaccagatcttcctgattaatgaacgccagctctccgtcaatcaacaaaactggctgcgtcattattttaagcagtatctgcgtcagcacattacgccgattttaatcaatcctgacactgacttagtgcagttcctgaaagatgattacacctatctggcggtggaaattatccgtggcgataccatccgttacgcgctgctggagatcccatcagataaagtgccgcgctttgtgaatttaccgccagaagcgccgcgtcgacgcaagccgatgattcttctggataacattctgcgttactgccttgatgatattttcaaaggcttctttgattatgacgcgctgaatgcctattcaatgaagatgacccgcgatgccgaatacgatttagtgcatgagatggaagccagcctgatggagttgatgtcttccagtctcaagcagcgtttaactgctgagccggtgcgttttgtttatcagcgcgatatgcccaatgcgctggttgaagtgttacgcgaaaaactgactatttcccgctacgactccatcgtccccggcggtcgttatcataattttaaagactttattaatttccccaatgtcggcaaagccaatctggtgaacaaaccactgccgcgtttacgccatatttggtttgataaagcccagttccgcaatggttttgatgccattcgcgaacgcgatgtgttgctctattatccttatcacacctttgagcatgtgctggaactgctgcgtcaggcttcgttcgacccgagcgtactggcgattaaaattaacatttaccgcgtggcgaaagattcacgcatcatcgactcgatgatccacgccgcacataacggtaagaaagtcaccgtggtggttgagttacaggcgcgtttcgacgaagaagccaacattcactgggcgaagcgcctgaccgaagcaggcgtgcacgttatcttctctgcgccggggctgaaaattcacgccaaactgttcctgatttcacgtaaagaaaacggtgaagtggtgcgttatgcacacatcgggaccgggaactttaacgaaaaaaccgcgcgtctttatactgactattcgttgctgaccgccgatgcgcgcatcaccaacgaagtacggcgggtatttaactttattgaaaacccataccgtccggtgacatttgattatttaatggtatcgccgcaaaactcccgccgcctattgtatgaaatggtggaccgcgagatcgccaacgcgcagcaagggctgcccagtggtatcaccctgaagctaaataaccttgtcgataaaggcctggttgatcgtctgtatgcggcctccagctccggcgtaccggttaatctgctggttcgcggaatgtgttcgctgatccccaatctggaaggcattagcgacaacattcgtgccatcagtattgttgaccgttaccttgaacatgaccgggtttatatttttgaaaatggcggcgataaaaaggtctacctttcttccgccgactggatgacgcgcaatattgattatcgtattgaagtggcgacgccgctgctcgatccgcgcctgaagcagcgggtactggacatcatcgacatattgttcagcgatacggtcaaagcacgttatatcgataaagaactcagtaatcgctacgttccccgcggcaatcgccgcaaagtacgggcgcagttggcgatttatgaseq id no.2
[0044]
atgactgatcagtctcatcagtgcgtcattatcggtatcgctggcgcatcggcttccgg
[0045]
caagagtcttattgccagtaccctttatcgtgaattgcgtgagcaagtcggtgatgaac
[0046]
acatcggcgtaattcccgaagactgctattacaaagatcaaagccatctgtcgatggaa
[0047]
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[0048]
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[0049]
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[0050]
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[0051]
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[0052]
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[0053]
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[0054]
aaccgcatcgcgatcgatatattgaaagcgaaaataagtcagttctttgaataa。

技术特征：
1.一种生物转化合成尿苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：以尿苷和乙酰磷酸二钾盐为原料，在尿苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同作用下进行生物转化，得到尿苷酸。2.根据权利要求1所述生物转化合成尿苷酸的方法，其特征在于：反应体系中加入atp、mg
2+
启动反应。3.根据权利要求1所述生物转化合成尿苷酸的方法，其特征在于：整个合成过程具体包括，多聚磷酸盐激酶制备、尿苷激酶的制备、偶联生物转化反应。4.根据权利要求3所述生物转化合成尿苷酸的方法，其特征在于：偶联转化反应体系为：尿苷80-100g/l，atp 1-5g/l，氯化镁1-5.5g/l，多聚磷酸盐激酶2-20g/l，尿苷激酶2-20g/l，乙酰磷酸二钾盐100-200g/l。5.根据权利要求3所述生物转化合成尿苷酸的方法，其特征在于：多聚磷酸盐激酶制备为，菌种活化后制备种子液，以2-10％接种量接种至发酵罐，进行连续流高密度发酵培养。6.根据权利要求3所述生物转化合成尿苷酸的方法，其特征在于：尿苷激酶的制备为，菌种活化制备种子液，以2-10％接种量接种至发酵罐，进行连续流高密度发酵培养。7.根据权利要求3所述生物转化合成尿苷酸的方法，其特征在于：偶联生物转化反应条件为ph＝6.0-8.0、反应温度25-35℃，反应时间6-10h。

技术总结
本发明提供一种生物转化合成尿苷酸的方法，属于生物化学技术领域。以尿苷和乙酰磷酸二钾盐为原料，加入少量ATP及Mg


技术研发人员：杨邵华 邢善涛 方家瑞 熊梦朝 韩全州 陈德宜 郑立斌
受保护的技术使用者：河南省核苷药物研究院有限公司 河南鼎新医药科技有限公司 新乡制药股份有限公司
技术研发日：2023.08.04
技术公布日：2023/10/20