一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体及其应用与一种重组表达载体和重组表达菌株

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体及其应用与一种重组表达载体和重组表达菌株。


背景技术：

2.褐藻酸寡糖(aos)是褐藻酸的降解产物，具有显著的生理活性，如免疫调节、抗菌、抗氧化、益生元、抗高血压、抗糖尿病、抗肿瘤和抗凝血活性等。同时aos可加速微生物代谢、促进根的生长、提高植物的产量和质量、提高植物的抗病性、诱导植物免疫性，可用于制备生物肥料。
3.aos的生物活性与其单体组成和聚合度dps(或分子量)有关。不同单体组成及不同聚合度的aos具有不同的生理活性，如治疗阿尔茨海默症新药“甘露寡糖二酸(gv-971)是聚甘露糖醛酸片段；dp5的aos对骨肉瘤细胞显示出抗肿瘤活性，而dp2，dp3和dp4的aos未检测到抗肿瘤活性。低分子量(小于10kda)的gaos和maos能够发挥更高的抗氧化活性；酶降解法制备的aos中存在不饱和末端结构是激活巨噬细胞的必要条件，在不饱和古罗糖醛酸(g3-g9)和甘露糖醛酸(m3-m9)低聚物中，不饱和古罗糖醛酸(g8)和甘露酸(m7)低聚物对raw1.1细胞白细胞介素(il)-6α、il-264β和il-7分泌的诱导作用比其他aos最有效，而饱和古罗糖醛酸和甘露糖醛酸低聚物(sg3-g9和sm3-m9)的效果较差。因此，为充分利用不同aos的活性，急需通过褐藻酸裂解酶alys降解褐藻酸以生产定义明确(指具有特定的单体组成和dps)的aos。
4.依据底物偏好性，alys可以分为polyg特异性裂解酶、polym特异性裂解酶和polymg特异性裂解酶。通过研究不同裂解酶的底物特异性，有助于确定酶解产物的组成，这对于制备明确定义的aos至关重要。例如，由polym特异性裂解酶产生的低聚物往往在其还原端含有m。在制备组成明确的aos时，除了明确单体组成外，还应考虑aos的分子量或dps。通常，内切型褐藻酸裂解酶将褐藻酸盐降解为不同聚合度的aos，其中一些往往以某些聚合度的aos为主要产物，这些褐藻酸裂解酶更适合产生具有特定dps的aos。例如，褐藻酸裂解酶alyb的主要降解产物为三糖。褐藻酸裂解酶alysy08可以将海藻酸降解为单体、二聚体和三聚体，其中二糖是主要产物(占总产物的81.4％)。此外，褐藻酸裂解酶alyl1生成的降解产物中以二糖和三糖为主，含量在90％以上。对降解产物具有dp特异性的褐藻酸裂解酶已成为工业化生产定义明确的aos的有力候选者。
5.高分子量和高聚合度的aos具有更好的医药价值，但是目前利用褐藻酸裂解酶酶解的产物的聚合度低，分子量小，医用潜力小，并不能满足市场的需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种可以生产高分子量、高聚合度的褐藻寡糖的褐藻酸裂解酶，尤其涉及一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体及其应用与一种重组表达载体和
重组表达菌株。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体，包括褐藻酸裂解酶突变体y149a、褐藻酸裂解酶突变体y149s、褐藻酸裂解酶突变体d180g、褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g或褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g；
9.所述褐藻酸裂解酶突变体y149a的氨基酸序列如seq id no：3所示，核苷酸序列如seq id no：4所示；
10.所述褐藻酸裂解酶突变体y149s的氨基酸序列如seq id no：5所示，核苷酸序列如seq id no：6所示；
11.所述褐藻酸裂解酶突变体d180g的氨基酸序列如seq id no：7，核苷酸序列如seq id no：8所示；
12.所述褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g的氨基酸序列如seq id no：9所示，核苷酸序列如seq id no：10所示；
13.所述褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g的氨基酸序列如seq id no：11所示，核苷酸序列如seq id no：12所示。
14.作为优选，所述褐藻酸裂解酶突变体y149a为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丙氨酸；
15.所述褐藻酸裂解酶突变体y149s为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丝氨酸；
16.所述褐藻酸裂解酶突变体d180g为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第180位的天冬氨酸氨酸突变为甘氨酸；
17.所述褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丙氨酸，第180位的天冬氨酸氨酸突变为甘氨酸；
18.所述褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丝氨酸，第180位的天冬氨酸氨酸突变为甘氨酸。
19.作为优选，所述野生型褐藻酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no：1所示，核苷酸序列如seq id no：2所示。
20.本发明还提供了所述的褐藻酸裂解酶突变体在制备具有高分子量、高聚合度的褐藻酸寡糖产品中的应用。
21.本发明还提供了一种重组表达载体，包括所述的褐藻酸裂解酶突变体的核苷酸序列以及空载载体；
22.所述空载载体为大肠杆菌表达载体pet-22b(+)。
23.本发明还提供了一种所述的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：
24.(1)将大肠杆菌表达载体pet-22b(+)和所述的褐藻酸裂解酶突变体的核苷酸序列进行双酶切，得到具有粘性末端的载体pet-22b(+)和具有粘性末端的褐藻酸裂解酶的核苷酸序列；
25.(2)将具有粘性末端的褐藻酸裂解酶的核苷酸序列与具有粘性末端的载体pet-22b(+)重组连接，得到重组表达载体。
26.作为优选，所述双酶切的酶为限制性内切酶nco i和nde i。
27.本发明还提供了所述的重组表达载体或者所述的构建方法构建得到的重组表达载体在制备可以得到具有高分子量、高聚合度的褐藻酸寡糖产品中的应用。
28.本发明还提供了一种重组表达菌，包括重组表达载体和初发菌株；
29.所述重组表达载体为所述的重组表达载体或者所述的构建方法构建得到的重组表达载体；
30.所述初发菌株为大肠杆菌bl21-codonplus-ril。
31.本发明还提供了所述的重组表达菌在制备可以得到具有高分子量、高聚合度的褐藻酸寡糖产品中的应用。
32.本发明提供了一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体及其应用与一种重组表达载体和重组表达菌株，本发明的褐藻酸裂解酶突变体具有如下优点：
33.本发明提供的褐藻酸裂解酶突变体y149a、y149s、d180g、y149a/d180g及y149s/d180g与野生型褐藻酸裂解酶相比，酶解产物多了褐藻五糖，产物由原来的2-4糖变为2-5糖。本发明的褐藻酸裂解酶突变体y149a、y149s、d180g、y149a/d180g及y149s/d180g的酶解产物2-5糖具有良好医用价值，具有广阔的发展前景。
附图说明
34.图1为hplc分析褐藻酸裂解酶突变体的酶解产物(a表示野生型褐藻酸裂解酶0-24h的酶解产物；b、c、d表示褐藻酸裂解酶突变体的酶解产物)。
35.图2为褐藻酸裂解酶突变体分子量的确定(wt表示野生型褐藻酸裂解酶的酶解产物、y149a表示褐藻酸裂解酶突变体y149a的酶解产物、y149s表示褐藻酸裂解酶突变体y149s的酶解产物、d180g表示褐藻酸裂解酶突变体d180g的酶解产物、y149a/d180g表示褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g的酶解产物、y149s/d180g表示褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g的酶解产物)。
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.本发明实施例中涉及的lb液体培养基，以水为溶剂，还包括如下浓度的组分酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l。
38.本发明实施例中涉及的lb固体培养基，以水为溶剂，还包括如下浓度的组分：酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l、琼脂15g/l。
39.本发明实施例中涉及的野生型褐藻酸裂解酶为野生型褐藻酸裂解酶flalya，其氨基酸序列如如seq id no：1所示，核苷酸序列如seq id no：2所示。
40.实施例1
41.褐藻酸裂解酶突变体基因序列的克隆
42.对野生型褐藻酸裂解酶flalya的氨基酸位点进行大量的点突变，筛选得到5种褐藻酸裂解酶突变体，这些突变体可以使产物种类发生改变。这5种突变体命名为褐藻酸裂解酶突变体y149a、褐藻酸裂解酶突变体y149s、褐藻酸裂解酶突变体d180g、褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g、褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g，其氨基酸序列分别为seq id no:3、
seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11，其编码核苷酸序列为seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12。
43.以野生型褐藻酸裂解酶flalya的核苷酸序列为模板，设计引物y149a-f及y149a-r(seq id no:13～14)，pcr扩增得到褐藻酸裂解酶突变体y149a的核苷酸序列；以野生型褐藻酸裂解酶flalya的核苷酸序列为模板，设计引物y149s-f及y149s-r(seq id no:15～16)，pcr扩增得到褐藻酸裂解酶突变体y149s的核苷酸序列；以野生型褐藻酸裂解酶flalya的核苷酸序列为模板，设计引物d180g-f及d180g-r(seq id no:17～18)，pcr扩增得到褐藻酸裂解酶突变体d180g的核苷酸序列；以野生型褐藻酸裂解酶flalya的核苷酸序列为模板，设计引物y149a/d180g-f及y149a/d180g-r(seq id no:19～20)，pcr扩增得到褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g的核苷酸序列；以野生型褐藻酸裂解酶flalya的核苷酸序列为模板，设计引物y149s/d180g-f及y149s/d180g-r(seq id no:21～22)，pcr扩增得到褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g的核苷酸序列；双突变体y149a/d180g和y149s/d180g分别以质粒pet-22b-flalya
y149a
和pet-22b-flalya
y149s
为模板，对d180g进行突变。
44.y149a-f:5'-gaaagtggcttgggataaaggaaaaattcgtgt-3'；
45.y149a-r:5'-tatcccaagccactttcaaaataggcggtgca-3'；
46.y149s-f:5'-gtgagttgggataaaggaaaaattcgtgtgaa-3'；
47.y149s-r:5'-cctttatcccaactcactttcaaaataggcggtgc-3'；
48.d180g-f:5'-ttggggtggtgatgaaggtcgaaattttaaagagaa-3'；
49.d180g-r:5'-cttcatcaccaccccaagcatgttctgaaagc-3'；
50.y149a/d180g-f:5'-ttggggtggtgatgaaggtcgaaattttaaagagaa-3'；
51.y149a/d180g-r:5'-cttcatcaccaccccaagcatgttctgaaagc-3'；
52.y149s/d180g-f:5'-ttggggtggtgatgaaggtcgaaattttaaagagaa-3'；
53.y149s/d180g-r:5'-cttcatcaccaccccaagcatgttctgaaagc-3'。
54.野生型褐藻酸裂解酶flalya的核酸序列由上海生工生物工程股份有限公司完成，其核苷酸序列为seq id no:2。
55.实施例2
56.褐藻酸裂解酶突变体的表达
57.将野生型褐藻酸裂解酶的核苷酸序列和空载载体pet-22b(+)分别用限制性内切酶nco i和nde i双酶切，得到具有粘性末端的载体pet-22b(+)和具有粘性末端的褐藻酸裂解酶核苷酸序列；将具有粘性末端的褐藻酸裂解酶核苷酸序列和具有粘性末端的载体pet-22b(+)通过同源重组连接，获得褐藻酸裂解酶重组表达载体，并转化大肠杆菌dh5α，用含有氨苄青霉素的lb固体培养基中进行选择，并对克隆进行测序验证。测序正确后，即得到含有褐藻酸裂解酶基因的重组表达载体pet-22b(+)-flalya。
58.采用同样方法构建实施例1褐藻酸裂解酶突变体重组表达载体。将实施例1得到的褐藻酸裂解酶突变体的核苷酸序列替换上述野生型褐藻酸裂解酶的核苷酸序列，其余方法一致，得到的重组表达载体分别为：pet-22b(+)-flalya
y149a
、pet-22b(+)-flalya
y149s
、pet-22b(+)-flalya
d180g
、pet-22b(+)-flalya
y149a/d180g
和pet22b(+)-flalya
y149s/d180g
。
59.将上述得到的重组表达载体分别导入大肠杆菌bl21-codonplus-ril中，获得重组表达菌株。
60.将含有野生型褐藻酸裂解酶或褐藻酸裂解酶突变体表达载体的宿主bl21-codonplus-ril单克隆挑至lb液体培养基的试管当中，37℃，220rpm过夜，然后转接至含有lb液体培养基的三角瓶中，37℃，220rpm摇至od
600
到0.8时，添加iptg至终浓度0.1mm，25℃，220rpm诱导24h。诱导结束后，在4℃条件下，8000rpm，20min离心收集菌体。
61.每1g湿菌体加入25mlph7.0的缓冲液(以水为溶剂，包括20mm tris和300mm nacl)重悬菌体，每50ml菌液于100ml烧杯中，冰水浴条件下，以600w功率，超声2s，间歇2s，破碎10min以裂解细胞。在4℃条件下，7200rpm，15min离心后，弃去沉淀，保留上清即为褐藻酸裂解酶以及突变体的粗提取酶溶液。
62.用裂解缓冲液(以水为溶剂，包括20mm tris和300mm nacl，ph7.0)重悬，用购自常州天地人和生物科技有限公司的ni柱纯化粗提取酶溶液，20mm咪唑洗杂，500mm咪唑洗脱，收集洗脱液，进行蛋白sds-page电泳检测。超声破胞，得到纯褐藻酸裂解酶以及纯褐藻酸裂解酶突变体。
63.实施例3
64.hplc分析褐藻酸裂解酶突变体的产物分布
65.反应体系：100μl 0.1mg/ml纯蛋白酶与900μl 0.1％sa(磷酸钠缓冲液ph 8.0)，30℃反应24h，沸水煮沸10min灭活酶液。反应液于4℃，12000rpm离心10min，取上清液过0.22μm水系滤膜进行高效液相色谱(hplc)分析反应产物。纯蛋白酶为实施例2得到的纯褐藻酸裂解酶以及纯褐藻酸裂解酶突变体。分析结果如图1所示。
66.hplc使用tskgel deae-2sw色谱柱(tosoh)对酶解产物进行分析，流动相a为250mm nacl和流动相b为ddh2o，流速1.0ml/min，紫外检测器检测波长230nm。用0-250mm nacl线性梯度洗脱aos，洗脱条件如表1所示。
67.表1 hplc洗脱条件
68.时间(min)流动相a％流动相b％00100401000461000500100600100
69.图1显示，与野生型褐藻酸裂解酶相比，突变体y149a、y149s、d180g、y149a/d180g及y149s/d180g产生新的酶解产物(红框内)。
70.液相色谱-三重串联四级杆质谱仪(安捷伦)确定分子量。将离心后的上清液与纯乙腈1：1混匀，过0.22μm有机滤膜，流动相a为0.1％甲酸，流动相b为纯乙腈，流速为0.2ml/min，采用紫外检测，波长230nm。结果如图2所示。
71.图2所示，野生型褐藻酸裂解酶的酶解产物存在m/z＝351；m/z＝527；m/z＝703、m/z＝725和m/z＝747的产物峰，分别对应褐藻二糖；褐藻三糖；褐藻四糖。与野生型相比，突变体y149a、y149s、d180g、y149a/d180g及y149a/d180g多了m/z为879的产物峰(红框内)，这与五糖分子量一致，可确定新产物为褐藻五糖。
72.由以上实施例可知，本发明提供了一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体及其应用与一种重组表达载体和重组表达菌株。本发明提供的褐藻酸裂解酶突变体y149a、
y149s、d180g、y149a/d180g及y149s/d180g与野生型褐藻酸裂解酶相比，酶解产物多了褐藻五糖，产物由原来的2-4糖变为2-5糖。本发明的褐藻酸裂解酶突变体y149a、y149s、d180g、y149a/d180g及y149s/d180g的酶解产物2-5糖具有良好医用价值，具有广阔的发展前景。
73.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体，其特征在于，包括褐藻酸裂解酶突变体y149a、褐藻酸裂解酶突变体y149s、褐藻酸裂解酶突变体d180g、褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g或褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g；所述褐藻酸裂解酶突变体y149a的氨基酸序列如seq id no：3所示，核苷酸序列如seq id no：4所示；所述褐藻酸裂解酶突变体y149s的氨基酸序列如seq id no：5所示，核苷酸序列如seq id no：6所示；所述褐藻酸裂解酶突变体d180g的氨基酸序列如seq id no：7，核苷酸序列如seq id no：8所示；所述褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g的氨基酸序列如seq id no：9所示，核苷酸序列如seq id no：10所示；所述褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g的氨基酸序列如seq id no：11所示，核苷酸序列如seq id no：12所示。2.根据权利要求1所述的褐藻酸裂解酶突变体，其特征在于，所述褐藻酸裂解酶突变体y149a为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丙氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体y149s为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丝氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体d180g为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第180位的天冬氨酸氨酸突变为甘氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体y149a/d180g为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丙氨酸，第180位的天冬氨酸氨酸突变为甘氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体y149s/d180g为野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列的第149位的酪氨酸突变为丝氨酸，第180位的天冬氨酸氨酸突变为甘氨酸。3.根据权利要求2所述的褐藻酸裂解酶突变体，其特征在于，所述野生型褐藻酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no：1所示，核苷酸序列如seq idno：2所示。4.权利要求1～3任意一项所述的褐藻酸裂解酶突变体在制备具有高分子量、高聚合度的褐藻酸寡糖产品中的应用。5.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的褐藻酸裂解酶突变体的核苷酸序列以及空载载体；所述空载载体为大肠杆菌表达载体pet-22b(+)。6.一种权利要求5所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将大肠杆菌表达载体pet-22b(+)和权利要求1～3任意一项所述的褐藻酸裂解酶突变体的核苷酸序列进行双酶切，得到具有粘性末端的载体pet-22b(+)和具有粘性末端的褐藻酸裂解酶的核苷酸序列；(2)将具有粘性末端的褐藻酸裂解酶的核苷酸序列与具有粘性末端的载体pet-22b(+)重组连接，得到重组表达载体。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述双酶切的酶为限制性内切酶ncoi和ndei。8.权利要求5所述的重组表达载体或者权利要求6～7任意一项所述的构建方法构建得
到的重组表达载体在制备可以得到具有高分子量、高聚合度的褐藻酸寡糖产品中的应用。9.一种重组表达菌，其特征在于，包括重组表达载体和初发菌株；所述重组表达载体为权利要求5所述的重组表达载体或者权利要求6～7任意一项所述的构建方法构建得到的重组表达载体；所述初发菌株为大肠杆菌bl21-codonplus-ril。10.权利要求9所述的重组表达菌在制备可以得到具有高分子量、高聚合度的褐藻酸寡糖产品中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种产物分布改变的褐藻酸裂解酶突变体及其应用与一种重组表达载体和重组表达菌株。本发明的褐藻酸裂解酶突变体，包括褐藻酸裂解酶突变体Y149A、Y149S、D180G、Y149A/D180G或Y149S/D180G。本发明提供的褐藻酸裂解酶突变体Y149A、Y149S、D180G、Y149A/D180G及Y149S/D180G与野生型褐藻酸裂解酶相比，酶解产物多了褐藻五糖，产物由原来的2-4糖变为2-5糖。本发明的褐藻酸裂解酶突变体的酶解产物2-5糖具有良好的医用价值，具有广阔的发展前景。具有广阔的发展前景。具有广阔的发展前景。


技术研发人员：杨登峰 张秀 潘丽霞 阳丽艳 黄艳冰 黄媛林 蒋永强 吕军 欧娜
受保护的技术使用者：广西科学院生物研究所有限责任公司
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/10/20