一种使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株及其构建方法与流程

一种使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素
λ
重组菌株及其构建方法
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株及其构建方法。


背景技术：

2.酵母是生物学研究中常用的真核单细胞生物，遗传背景清晰、培养方式便捷，在自然界中分别广泛，也是人类文明史中最早“驯化”的微生物。不同种属的酵母在食品、医疗等产业中广泛应用，例如假丝酵母中的部分种类可转化工业废料为可食用蛋白，减少环境污染，还有如白色念珠菌、新生儿隐球菌等在某些情况下与人类致病相关；酿酒酵母则常用于酿造啤酒、白酒、果酒等含酒精的饮料，以及作为“细胞工厂”生产乙醇、赖氨酸、谷胱甘肽等多种产品；同时，作为普遍公认安全性 (generally recognized as safe, gras)菌种，酿酒酵母已广泛用于医药生物制品的创制。近年来，以该菌株为工程化底盘成功研制了包括新型冠状病毒（sars-cov-2）口服疫苗等多种防疫制剂。
3.病毒抗原等多种异源蛋白能够利用酵母细胞完整的翻译后修饰途径正确折叠组装形成天然构象，同时对宿主细胞酵母而言，外源基因的稳定性及其拷贝数是影响工程菌株表达效率、发酵生产收益的关键因素。与穿梭质粒相比，染色体整合能够确保传代过程中外源基因的稳定性，降低发酵成本、更适合工业化生产的需求；同时拷贝数的增加可更直接地实现外源基因在酵母中的高水平表达。通过酵母自身携带的rdna、tdna、转座子特征序列或外源插入的合成dna着陆垫序列等，均可实现目的蛋白的多拷贝和高效表达。
4.rdna重复序列是常用的外源基因多拷贝整合位点，在酿酒酵母中存在100-200个重复序列。fang、zheng等课题组构建了表达13.64拷贝木聚糖酶和18拷贝木糖异构酶的重组酵母。但因rdna位点的整合效率常处于波动状态，外源基因的拷贝数会随酵母有丝分裂次数的增加而减少，同时当整合片段长度大于rdna单元会影响整合的稳定性。此外，具有425拷贝的δ随机重复序列也可实现外源基因的高拷贝整合，但具有内在的遗传不稳定性。2017年，研究人员开发了一种替代工具“wicket”，用于酿酒酵母外源途径的高效整合和快速优化。wicket是由两侧与任何物种不存在同源性的50 bp dna片段（uni-hal、uni-har）和中间23 bp的单一grna序列共同组成短dna盒，可以作为外源基因的整合靶点。所有wicket含相同grna序列。通过将wicket插入到酵母基因组的基因间隔区，构建不同拷贝数底盘菌株，结合crispr/cas9技术实现外源序列整合与代谢途径重构。然而，由于wicket系统两端uni重复序列相同，供体dna随机整合，无法实现dna拷贝数的精确控制。2018年，通过在酿酒酵母中引入一系列合成dna着陆垫，也开发了类似的crispr/cas9集成系统。与wicket方法不同的是，lp平台具有4条更长的人工合成序列（560 bp）作为同源臂，其间插入20 bp不同特征性grna序列，与酵母细胞基因组不同靶位整合后构建得到了不同拷贝数的底盘酵母。4个不同的lp模块以不同的拷贝数分散在酵母基因组中，特征性grna能够在一个菌株中实现基因拷贝数的精确控制。同时作者全面的表征并优化了lp系统，有效地加快了菌株改良的
过程，使基因表达量与基因拷贝数成正比。
5.我国是禽类养殖大国，为提供健康的鸡肉每年要花费大量资金用于饲养和防疫。肉鸡和蛋鸡的生长过程中都会受到多种不同病原体的侵染。如法氏囊炎病毒引起的鸡传染性法氏囊病是一种严重的急性动物传染病，会在大范围内引发鸡群的感染。此外还有禽流感、新城疫、马立克氏病等每年会在不同的季节暴发，这些都对养禽业造成了沉重的打击和巨大的经济损失。注射型传统疫苗的应用加大了动物应激，因不能有效激发局部黏膜免疫、细胞免疫等问题，多种病毒疫苗应用后仍存在无症状带毒感染的情况。而过度使用广谱抗生素极易引发耐药性，同时人类长时间食用抗生素残留的肉制品，药物在人体内不断蓄积会产生毒性作用，对器官造成损害。
6.细胞因子可调控免疫反应的类型与程度，是一种高效、天然的治疗方法。其中，干扰素在抗病毒感染中发挥功效。根据抗原性、基因序列、干扰素产生细胞、理化性质、生物学活性的不同，干扰素分为i、ii和iii型。肠道、呼吸道黏膜细胞产生的iii型干扰素ifn-λ在局部黏膜抗感染中发挥重要作用。
7.目前，缺乏利用食品级安全的酵母表达重组鸡干扰素ifn-λ的记载。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株及其构建方法。
9.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种优化后的鸡干扰素λ（chiifn λ），其核苷酸序列如seq id no.4 所示。
10.本发明还提供了一种表达载体pot-chiifn λ，该表达载体pot-chiifn λ包含所述的鸡干扰素λ。
11.本发明还提供了一种重组工程菌，该工程菌含有所述的鸡干扰素λ；所述的工程菌为酵母；所述的酵母为酿酒酵母、毕赤酵母、马克思克鲁维酵母、光滑念珠菌或白色念珠菌中的至少一种；所述的酿酒酵母为酿酒酵母jdy52、酿酒酵母by4741、酿酒酵母by4742、酿酒酵母w303a或酿酒酵母w303α中的至少一种。
12.本发明还提供了一种使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株的构建方法，包括如下步骤：步骤1是构建具有n个靶点的酵母底盘细胞；步骤2是构建所述的鸡干扰素λ的完整转录单位，使用步骤1所述的具有n个靶点的酵母底盘细胞构建整合具有n个拷贝的鸡干扰素λ重组酵母菌株；步骤3是将所述的鸡干扰素λ的完整转录单位通过同源重组整合于步骤2所述的鸡干扰素λ重组酵母菌株的基因组，得到具有n+1个拷贝的鸡干扰素λ重组菌株。
13.进一步，所述的步骤1的具体步骤为：通过体外和体内组装质粒的方式在酵母基因组的多个染色体高表达位点插入靶序列，经筛选后得到具有n个靶点的酵母底盘细胞；所述的n大于等于1。
14.进一步，所述的组装质粒步骤使用的工具质粒为质粒pcut-syn-gal1p，所述的质粒pcut-syn-gal1p的核苷酸序列如seq id no.5 所示；
所述的筛选步骤使用的筛选培养基含有2%的半乳糖与2%的麦芽糖（均为质量分数）。
15.所述的质粒pcut-syn-gal1p的cas9启动子为gal, 突变删除了cas9序列中的bsmbi酶切位点，同时包含grna转录元件。
16.所述的筛选培养基保证pcut-syn-gal1p质粒转化酵母后的工作效率，减少实验流程。
17.更进一步，所述的步骤1的具体步骤为：通过体外和体内组装cas9质粒的方式在酿酒酵母jdy52基因组的3个染色体高表达位点(a、p、g) 插入23 bp的syn.grna靶序列（seq id no.5），分别获得单靶点、双靶点和三靶点底盘酵母sjdy1、sjdy2和sjdy3。底盘细胞a位点插入syn.grna片段后核苷酸序列为seq id no.1，底盘细胞p位点插入syn.grna片段后核苷酸序列为seq id no.2，底盘细胞g位点插入syn.grna片段后核苷酸序列为seq id no.3。
18.进一步，所述的酵母为酿酒酵母、毕赤酵母、马克思克鲁维酵母、光滑念珠菌或白色念珠菌中的至少一种；所述的酿酒酵母为酿酒酵母jdy52、酿酒酵母by4741、酿酒酵母by4742、酿酒酵母w303a或酿酒酵母w303α中的至少一种。
19.进一步，所述的步骤2的具体步骤为：通过crispr/cas9技术将鸡干扰素λ整合于步骤1所述具有n个靶点的酵母底盘细胞，获得1-3拷贝鸡干扰素λ分泌型重组酵母菌株sjdy1-pot、sjdy2-2pot、sjdy3-3chiifn λ。具体包括以下步骤：（1）ptarget-chiifn λ整合质粒的构建：通过xhoi单酶切线性化含有syn.grna的3种不同位点同源臂核苷酸序列seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3 所在载体ptarget-a、ptarget-p和ptarget-g，无缝克隆将含有chiifn λ基因片段（序列特征为seq id no.4）的转录单位pot-chiifn λ连接至同源臂质粒xhoi位点处，获得重组质粒ptarget-a-chiifn λ、ptarget-p-chiifn λ、ptarget-g-chiifn λ；（2）1-3拷贝鸡干扰素λ重组酵母菌株的构建：以构建完成的ptarget-a/p/g chiifn λ整合质粒为模板，使用同源臂引物pcr扩增获得转化所需的3种chiifn λ-donor dna片段，分别以多靶点底盘细胞sjdy1-3为宿主菌，同时加入pcut-syn质粒（根据cas9转录单位启动子不同分为：pcut-syn-gal1p 载体特征序列为seq id no.5和pcut-syn-tef1p载体tef1启动子部分特征为seq id no.6）及chiifn λ-donor dna片段进行酵母转化，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，western blot进行蛋白表达水平验证。
20.进一步，所述的步骤3的具体步骤为：将转录单位质粒与同源臂质粒、筛选标记质粒进行酶切拼接，得到同源臂、转录单位、筛选标记串联的重组dna片段，转化所述的dna片段至步骤2所述的鸡干扰素λ重组酵母菌株的基因组，经筛选后得到具有n+1个拷贝的鸡干扰素λ重组菌株。
21.更进一步，所述的步骤3的具体步骤为：利用yeastfab系统将转录单位质粒pot-chiifn λ与同源臂质粒t-sur-tu/td、筛选标记质粒pmv-trp1进行酶切拼接，获得同源臂、chiifn λ转录单位、筛选标记串联的重组dna片段；转化该dna片段至具有n个拷贝的鸡干扰素λ重组酵母菌株，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，western blot进行蛋白表达水平验证。
22.本发明还提供了一种使用所述的构建方法构建得到的多拷贝鸡干扰素λ重组菌
株。
23.本发明还提供了一种重组菌株在制备外源片段重组酵母染色体中的应用，所述的外源片段重组酵母染色体为鸡干扰素λ。
24.本发明还提供了一种重组菌株在制备鸡干扰素λ治疗性疫苗中的应用。
25.相对于现有技术，本发明具有以下优势：本发明所述的构建方法对外源基因在酿酒酵母中的多拷贝整合方法进行优化，构建多靶点底盘细胞，开发简便、高效的酵母基因操作工具，能够实现外源基因的一步多靶点无标记整合，显著提升了基因编辑效率，缩短工程菌株的构建周期；加速了酿酒酵母细胞工厂基因工程改造、代谢通路重构等工程化模块的构筑；在此基础上制备的chiifn λ多拷贝重组酵母，提高了鸡干扰素λ的表达量，为禽病的防控提供了新的策略。
26.本发明所述的构建方法适用于任意外源基因在酵母染色体中多拷贝精准插入与整合。
附图说明
27.图1为本发明实施例1所述的syn donor dna片段的示意图。
28.图2为本发明实施例1所述的同源臂基因的扩增与overlap pcr连接电泳图：其中a图为a位点syn-donor上下游片段的扩增；b图为p位点syn-donor上下游片段的扩增；c图为g位点syn-donor下游片段的扩增；d图为g位点syn-donor上游片段的扩增；e图为a位点syn-donor上下游片段的overlap连接；f图为p位点syn-donor上下游片段的overlap连接；g图为g位点syn-donor上下游片段的overlap连接。
29.图3为本发明实施例1所述的pcut-a质粒的扩增电泳图。
30.图4为本发明实施例1所述的构建单靶点底盘细胞转化子的基因型验证电泳图：其中1-12号分别为12个不同的酵母转化子，ck为ddh2o为模板的阴性对照。
31.图5为本发明实施例1所述的线性化pcut载体及grna插入片段的示意图。
32.图6为本发明实施例1所述的pcut质粒的线性化电泳图。
33.图7为本发明实施例1所述的制备靶向a位点与p位点grna插入片段的电泳图：其中a图为靶向a位点grna插入片段的扩增，；b图为靶向p位点grna插入片段上下游序列的扩增；c图为靶向p位点grna插入片段上下游序列的overlap pcr连接。
34.图8为本发明实施例1所述的构建双靶点底盘细胞转化子的基因型验证电泳图：其中1-6号分别为6个不同的酵母转化子，ck为ddh2o为模板的阴性对照。
35.图9为本发明实施例1所述的构建三靶点底盘细胞的电泳图：其中a图为靶向p位点grna插入片段上下游序列的扩增；b图为靶向p位点grna插入片段上下游序列的overlap pcr连接。
36.图10为本发明实施例1所述的构建三靶点底盘细胞转化子的基因型验证电泳图：其中1-8号分别为8个不同的酵母转化子，ck为ddh2o为模板的阴性对照。
37.图11为本发明实施例2所述的制备1-3拷贝鸡干扰素λ donor dna的电泳图：其中a图为3种ptarget载体的酶切结果；b图为chiifn λ转录单位的扩增结果。
38.图12为本发明实施例2所述的转化子菌落pcr验证结果：其中a图为chiifn λ转录单位与ptarget-a连接后转化子菌落pcr验证结果，1-8号分别代表不同的大肠杆菌转化子
donor-r(seq id no.16)、g-overlap-f(seq id no.17)、g-overlap-r(seq id no.18)扩增g位点上下游同源臂片段。并使用重叠延伸pcr反应连接两个含syn.grna序列的同源臂片段，作为底盘细胞构建时的syn-donor dna片段。
50.配置同源臂片段扩增pcr反应体系如下：2
×
hieff robust pcr master mix (yeasen) 10
ꢀµ
l，基因组dna 2
ꢀµ
l，上游引物 (10 μm) 0.5
ꢀµ
l，下游引物 (10 μm) 0.5
ꢀµ
l，ddh2o 7
ꢀµ
l。
51.a、p、g位点同源臂基因的pcr扩增结果如图2中a所示，各片段理论长度为 a-donor-up 543 bp、a-donor-down 525 bp、p-donor-up 611 bp、 p-donor-down 547 bp、g-donor-up 519 bp、g-donor-down 279 bp。
52.控制参与overlap pcr连接的两个dna片段摩尔浓度相同，且在20 ng左右。配置overlap pcr反应体系如下：2
×
hieff robust pcr master mix (yeasen) 10
ꢀµ
l上游同源臂片段x
ꢀµ
l，下游同源臂片段x
ꢀµ
l，上游引物 (10
ꢀµ
m) 0.5
ꢀµ
l，下游引物 (10
ꢀµ
m) 0.5
ꢀµ
l，用ddh2o补齐至 20
ꢀµ
l.同源臂基因的扩增及overlap pcr反应程序如下：94 ℃ 预变性3 min
→
（94 ℃ 10 s
→
55 ℃ 20 s
→
72 ℃ 1kb/30s）30 个循环
→
72 ℃ 延伸5 min.a、p、g位点syn-donor上下游片段的overlap连接结果如图2中b所示，各片段理论长度依次为a-donor 1044 bp、p-donor 1135 bp、g-donor 793 bp。
53.2、单靶点底盘细胞的构建（1）pcut-a质粒的构建：以末端为靶向a位点的grna引物a-grna-f(seq id no.19)、a-grna-r (seq id no.20)反向扩增pcut-gal1p质粒，将原质粒中的grna部分的n20引导序列替换为靶向a位点的n20序列，并删除cas9序列中的bsai酶切位点，获得靶向a位点的pcut质粒pcut-a。pcr反应体系及程序设定采用如上文所述常规方法。扩增结果如图3所示，pcut-a片段理论长度为11373 bp。
54.（2）酵母转化：以jdy52为宿主菌进行转化，加入500 ng gal启动子诱导cas9的 pcut-a质粒，及1
ꢀµ
g靶向a位点的syn donor dna。转化完成后将菌液涂布在含有2%半乳糖+2%麦芽糖的sgm-ura的平板上。
55.（3）单靶点底盘细胞sjdy1基因型的验证：选择在sgm-ura培养基中生长的单菌落接种至500
ꢀµ
l ypd中，30 ℃过夜培养，提取其基因组pcr验证syn.grna序列是否成功整合到基因组a位点。次日取50
ꢀµ
l培养后的菌液6000 rpm离心1 min弃去上清，用100
ꢀµ
l裂解液(200 mm liac, 1% sds)重悬细胞，90
°
c孵育5 min， 加入300
ꢀµ
l无水乙醇混匀，于15000 g离心3 min收集沉淀。加入75%乙醇颠倒洗涤沉淀，12000 rpm 2 min 弃上清，将ep管开口置于通风橱吹干清洗后加入50
ꢀµ
l ddh2o重悬沉淀。15000 g离心15s取2
ꢀµ
l上清作模板，使用引物syn-grna-f(seq id no.21)和a-donor-r(seq id no.8)进行pcr验证。pcr反应体系及程序设定采用如上文所述常规方法。
56.单靶点底盘细胞转化子的基因型验证如图4所示，pcr片段理论长度为524 bp，其中5-12号为验证正确的转化子。
57.3、双靶点底盘细胞的构建（1）线性化pcut载体的制备：如图5所示，使用pcut-f(seq id no.22)、pcut-r(seq id no.23)引物反向扩增pcut-gal1p质粒，删除原质粒中的grna表达盒的n20引导序列，用
ng pcut-gal1p线性化载体，300 ng靶向g位点的grna 插入片段，及1
ꢀµ
g靶向g位点的syn.grna donor dna。转化完成后将菌液涂布在sgm-ura的平板上。
64.（4）三靶点底盘细胞sjdy3基因型的验证：选择在sgm-ura培养基中生长的单菌落接种至500
ꢀµ
l ypd中，30 ℃过夜培养，提取其基因组pcr验证syn.grna序列是否成功整合到基因组g位点。转化子基因组的提取及验证pcr体系、程序同单靶点底盘细胞sjdy1基因型的验证。使用引物syn-grna-f(seq id no.21)和g-donor-r2(seq id no.29)进行pcr验证。三靶点底盘细胞转化子的基因型验证如图10所示，pcr片段理论长度g-syn.grna 715 bp，其中8号为验证正确的转化子。
65.实施例2 1-4拷贝鸡干扰素λ重组酵母菌株的构建及检测1、1-3拷贝鸡干扰素λ donor dna的制备通过无缝克隆将鸡干扰素λ转录单位连接到3种ptarget同源臂质粒的xhoi酶切位点，分别构建靶向a、p、g位点的chiifn λ整合质粒。
66.（1）三种同源臂质粒的酶切：用xhoi酶切同源臂质粒ptarget-a、ptarget-p、ptarget-g。在100
ꢀµ
l的酶切体系中继续加入300
ꢀµ
l的ddh2o和2倍体积800
ꢀµ
l的无水乙醇，轻柔混匀后-20 ℃静置2 h。将醇沉体系在4 ℃ 13000 rpm 离心20 min，弃上清，在通风橱吹干ep管内的残余液体，加入30
ꢀµ
l ddh2o溶解沉淀，得到纯化后的同源臂载体片段。3种ptarget载体的酶切结果如图11中a所示，片段理论长度分别为ptarget-a 3715 bp、ptarget-p 3806 bp、ptarget-g 3464 bp。
67.（2）鸡干扰素λ基因的克隆：根据酵母密码子的偏好性对chiifnλ基因序列进行优化，从而提高鸡干扰素λ在酵母中的表达水平，并委托安升达公司合成。以含有密码子优化后chiifnλ基因的pot质粒为模板，用带有3种ptarget线性化载体两末端15-20 bp同源序列的引物a-chiifn λ-f (seq id no.30)、a-chiifn λ-r(seq id no.31)、p-chiifn λ-f (seq id no.32)、p-chiifn λ-r(seq id no.33)、g-chiifn λ-f (seq id no.34)、g-chiifn λ-r(seq id no.35)分别扩增鸡干扰素λ转录单位。pcr反应体系及程序设定采用如上文所述常规方法。chiifn λ转录单位的扩增结果如图11中b所示，片段理论长度分别为a位点 1693 bp、 p位点1666 bp、g位点1687 bp。
68.（3）目的片段与同源臂载体的连接：使用无缝克隆试剂盒(c112-01, vazyme)分别连接3种线性化的ptarget同源臂载体和鸡干扰素λ转录单位。随后将连接产物转化e.coli top 10感受态细胞。大肠杆菌转化子经amp抗性平板筛选，用检测引物chiifn λ-f (seq id no.36)和a-donor-r2(seq id no.26)进行ptarget-a连接后pcr验证；用检测引物chiifn λ-f和p-donor-r(seq id no.12)进行ptarget-p连接后pcr验证；用检测引物chiifn λ-f和 g-donor-r(seq id no.16)进行ptarget-g连接后pcr验证，并将验证正确的菌液扩大培养并提质粒。chiifn λ转录单位与ptarget-a连接后转化子菌落pcr验证结果如图12中a所示，片段理论长度1191 bp，其中4、5、8号为正确转化子。chiifn λ转录单位与ptarget-p连接后转化子菌落pcr验证结果如图12中b所示，片段理论长度1231 bp，1-9号均为正确转化子；chiifn λ转录单位与 ptarget-g连接后转化子菌落pcr验证结果如图12中c所示，片段理论长度1203 bp，其中1-4、6、8号为正确转化子。
69.（4）靶向a、p、g位点chiifn λ donor dna的制备：以ptarget a/p/g-chiifn λ整合质粒为模板，用同源臂质粒引物a-donor-f2 (seq id no.37)、a-donor-r(seq id no.8)、
p-donor-f2 (seq id no.38)、p-donor-r(seq id no.12)、g-donor-f (seq id no.15)、g-donor-r(seq id no.16) no.进行pcr扩增即得到分别靶向a、p、g位点含有chiifn λ 转录单位的donor dna片段。pcr反应体系及程序设定采用如上文所述常规方法。1-3拷贝鸡干扰素λ donor dna的扩增结果如图13所示，各片段理论长度分别为a位点2460 bp，p位点2489 bp，g位点2418 bp。
70.2、4拷贝鸡干扰素λ donor dna的制备基因间区域的高表达位点c作为鸡干扰素λ第四个整合位点。用bsai酶切转录单位，同时bsmbi酶切同源臂质粒（t-sur-tu和t-sur-td）和选择性标记质粒（pmv-trp）。参照dai课题组的yeastfab实验步骤，将surs同源臂、trp选择性标签、gpd-chiifn λ-tu转录单位按照特异性前后缀序列进行拼接，t4连接酶16
°
c过夜连接，拼接产物用于酵母转化。
71.3、1-4拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的构建（1）酵母转化：如前文所述，1-4拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的构建依次以sjdy1、sjdy2、sjdy3、sjdy3-3chiifn λ为宿主菌进行转化。挑取宿主菌单菌落于3 ml ypd，30 ℃ 180 rpm过夜培养，次日按1:50转接至10 ml ypd，30 ℃ 180 rpm 培养4-5h至对数期，采用liac转化法将500-800 ng pcut-syn-gal1p质粒、1-2
ꢀµ
g chiifn λ-donor dna片段转化到酵母细胞，将菌体涂布在sgm-ura固体培养基表面，30
°
c 培养箱生长2~3天，直至形成典型菌落。1-4拷贝鸡干扰素λ重组菌株转化加入组分及用量见表1。
72.表1 1-4拷贝鸡干扰素λ重组菌株转化数据
73.（2）chiifn λ重组菌株的基因型验证选择在sd-ura（1-3拷贝整合）或sd-trp（4拷贝整合）培养基中生长的挑单菌落至500
ꢀµ
l ypd中，30 ℃过夜培养，提取其基因组pcr验证chiifn基因是否成功整合到基因组。次日取50
ꢀµ
l培养后的菌液6000 rpm离心1 min弃去上清，用100
ꢀµ
l裂解液(200 mm liac, 1% sds)重悬细胞，90
°
c孵育5 min， 加入300
ꢀµ
l无水乙醇混匀，于15000 g离心3 min收集沉淀。加入75%乙醇颠倒洗涤沉淀，12000 rpm 2 min 弃上清，将ep管开口置于通风橱吹干清洗后加入50
ꢀµ
l ddh2o重悬沉淀。15000 g离心15s取2
ꢀµ
l上清作模板进行pcr验证。用检测引物chiifn λ-f (seq id no.36)和a-donor-r2(seq id no.37)进行单拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的基因型pcr验证；用检测引物chiifn λ-f和p-donor-r(seq id no.12)进行双拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的基因型pcr验证；用检测引物pot-r(seq id no.39)和g-donor-f2(seq id no.40)进行三拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的基因型pcr验证。pcr反应体系及程序设定采用如上文所述常规方法。
74.单拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的基因型的验证结果如图14所示，pcr验证片
段理论长度1191 bp，其中3、5、6、7、8、9号为正确的重组酵母转化子。双拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的基因型验证结果如图15所示，pcr验证片段理论长度分别为a位点1191 bp、p位点1231 bp，其中2、3、8号转化子在a、p两个位点均正确整合，5、7号转化子仅在p位点正确整合。三拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的基因型验证结果如图16所示，pcr验证片段理论长度分别为a位点1191 bp，p位点1231 bp，g位点1085 bp，1-4号均为正确的重组酵母转化子。四拷贝鸡干扰素λ重组酿酒酵母菌株的基因型验证结果如图17所示，pcr验证片段理论长度 1122 bp，其中2、3号为正确的重组酵母转化子。
75.（3）1-4拷贝chiifn λ菌株的表型验证由于chiifn λ的c端带有his标签，利用western blot抗his抗体检测目的基因chiifn λ的表达情况。
76.挑取宿主菌jdy52及1-4拷贝鸡干扰素λ重组酵母单菌落于5 ml ypd培养基中，30 ℃ 160 rpm培养30 h后转20 ℃继续培养42 h。收集2 ml培养液，12000 rpm离心1 min分别收集上清液和菌体。胞内总蛋白的提取：向菌体中加入60
ꢀµ
l 预冷的peb及与菌体等体积的玻璃珠，使用细胞破碎仪震荡破碎30 s，重复5次，4 ℃ 12000 rpm 10 min，取上清液与5
ꢀ×ꢀ
sample buffer混合煮沸10 min制样。上清蛋白制样采用tca法：将上清液收集于新的ep管中，加入1/9体积的tca溶液4 ℃ 10000 rpm离心10 min，加入200
ꢀµ
l预冷的ddh2o洗涤一次，之后用40
ꢀµ
l 0.1 m naoh 溶解沉淀，并加入10
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l 5
ꢀ×ꢀ
sample buffer煮沸10 min。
77.western blot检测蛋白表达。配置12 %的分离胶和5 %的浓缩胶。将制备的蛋白样分别吸取10
ꢀµ
l上样。sds-page 电泳结束后，通过湿转法将蛋白分离胶蛋白样转移至与经甲醇活化过的pvdf膜上；转膜完成后，在室温下用5 % 脱脂牛奶封闭pvdf膜1 h；小鼠抗his-tag单克隆抗体(yeasen, 30401es10)结合并4
º
c 孵育过夜；pbst洗涤后用过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg(yeasen, 33201es60)二抗室温孵育1 h后检测(34075, thermofisher)，通过bio-rad化学发光多色荧光凝胶成像系统(uvitec)曝光显色，观察蛋白表达情况，结果如图18 所示。进一步使用 image j 软件对 western blot 的检测结果进行灰度分析，计算鸡干扰素λ蛋白在胞内及分泌至胞外的表达总量。以单拷贝重组菌株鸡干扰素λ的蛋白表达量为标准进行归一化处理，比较1-4拷贝重组菌株鸡干扰素λ蛋白的相对表达量，结果如图19所示。在3个拷贝鸡干扰素λ的表达量随着拷贝数的增加而增大，4拷贝重组酿酒酵母菌株鸡干扰素λ的表达量与3拷贝菌株相比无统计学差异。
78.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种鸡干扰素λ，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no.4 所示。2.一种表达载体pot-chiifn λ，其特征在于：该表达载体pot-chiifn λ包含权利要求1所述的鸡干扰素λ。3.一种重组工程菌，其特征在于：该工程菌含有权利要求1 所述的鸡干扰素λ；所述的工程菌为酵母；所述的酵母为酿酒酵母、毕赤酵母、马克思克鲁维酵母、光滑念珠菌或白色念珠菌中的至少一种；所述的酿酒酵母为酿酒酵母jdy52、酿酒酵母by4741、酿酒酵母by4742、酿酒酵母w303a或酿酒酵母w303α中的至少一种。4.一种使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1是构建具有n个靶点的酵母底盘细胞；步骤2是构建权利要求1所述的鸡干扰素λ的完整转录单位，使用步骤1所述的具有n个靶点的酵母底盘细胞构建整合具有n个拷贝的鸡干扰素λ重组酵母菌株；步骤3是将所述的鸡干扰素λ的完整转录单位通过同源重组整合于步骤2所述的鸡干扰素λ重组酵母菌株的基因组，得到具有n+1个拷贝的鸡干扰素λ重组菌株。5.根据权利要求1所述的使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株的构建方法，其特征在于：所述的步骤1的具体步骤为：通过体外和体内组装质粒的方式在酵母基因组的多个染色体高表达位点插入靶序列，经筛选后得到具有n个靶点的酵母底盘细胞；所述的n大于等于1。6.根据权利要求5所述的使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株的构建方法，其特征在于：所述的组装质粒步骤使用的工具质粒为质粒pcut-syn-gal1p，所述的质粒pcut-syn-gal1p的核苷酸序列如seq id no.5 所示；所述的筛选步骤使用的筛选培养基含有2%的半乳糖与2%的麦芽糖。7.根据权利要求6所述的使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株的构建方法，其特征在于：所述的酵母为酿酒酵母、毕赤酵母、马克思克鲁维酵母、光滑念珠菌或白色念珠菌中的至少一种；所述的酿酒酵母为酿酒酵母jdy52、酿酒酵母by4741、酿酒酵母by4742、酿酒酵母w303a或酿酒酵母w303α中的至少一种。8.根据权利要求1所述的使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株的构建方法，其特征在于：所述的步骤3的具体步骤为：将转录单位质粒与同源臂质粒、筛选标记质粒进行酶切拼接，得到同源臂、转录单位、筛选标记串联的重组dna片段，转化所述的dna片段至步骤2所述的鸡干扰素λ重组酵母菌株的基因组，经筛选后得到具有n+1个拷贝的鸡干扰素λ重组菌株。9.一种使用权利要求4-8中任一项所述的构建方法构建得到的多拷贝鸡干扰素λ重组菌株。10.权利要求9所述的重组菌株在制备外源片段重组酵母染色体中的应用；所述的外源片段重组酵母染色体为鸡干扰素λ。

技术总结
本发明提供了一种使用酵母一步多靶点底盘细胞构建的鸡干扰素λ重组菌株及其构建方法，构建方法包括如下步骤：步骤1是构建具有n个靶点的酵母底盘细胞；步骤2是使用所述的酵母底盘细胞构建整合具有n个拷贝的鸡干扰素λ重组酵母菌株；步骤3是将所述的鸡干扰素λ的完整转录单位通过同源重组整合于所述的鸡干扰素λ重组酵母菌株的基因组，得到重组菌株。本发明所述的构建方法构建多靶点底盘细胞，开发简便、高效的酵母基因操作工具，能够实现外源基因的一步多靶点无标记整合。源基因的一步多靶点无标记整合。源基因的一步多靶点无标记整合。


技术研发人员：黄金海 张丽琳 姚兰 孙瑞骐 李志博 曹宁
受保护的技术使用者：天津瑞臻生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.12
技术公布日：2023/10/20