动态突变STR和VNTR基因位点的检测探针组、试剂盒及方法与流程

动态突变str和vntr基因位点的检测探针组、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及一种动态突变str和vntr基因位点的检测探针组、检测设备及试剂盒。


背景技术：

2.目前已知的动态突变疾病超过70种，主要涉及神经系统疾病，总患病率约1/1000。随着分子遗传学技术的发展，这类疾病的疾病谱在不断扩大，但目前仍有70%以上的动态突变疾病得不到及时确诊。鉴于动态突变疾病的种类繁多且普遍高发，涉及的基因数量众多，新基因仍在不断被发现，且致病性重复扩增的大小和序列构象具有多样性，而我们对其基础生物学机制的理解仍存在较大不足，因此，越来越需要改进异常重复扩增的分子检测方法。
3.目前，检测动态突变疾病的常用诊断方法有southern blot、重复引物pcr和二代ngs测序。southern blot方法复杂，费时费力，且没有致病基因的重复区序列信息。重复引物pcr技术虽然方法简便，对于重复序列扩增次数超过100次，甚至1000次以上的动态突变疾病都能够指示异常重复扩增的存在，但无法得到确切长度和序列信息，且针对每个不同的基因都需要使用特定的引物/探针进行单独测定。
4.得到致病基因的重复区序列信息有助于疾病分析。举例来说，脊髓小脑性共济失调1型(sca1)是一种常染色体显性遗传病，由atxn1基因中cag单元的异常重复扩增所引起。在诊断具有39-44个重复等位基因的sca1患者时，cat中断的存在很重要，因为只有不间断的等位基因被认为是异常的。因此，在对这类患者进行分子诊断时，需要同时分析cag和cat两种单元的重复次数。二代ngs测序在分析重复扩增方面具有一定的实用性，利用str生信算法，可以提示出部分基因的重复次数是否超过正常范围，但是仍然需要第二种方案验证。许多大片段致病性重复扩增、低复杂性序列和高gc含量片段难以通过ngs平台进行分析，所以二代ngs测序并不能很好地探索动态突变相关变异。
5.随着第三代长读长测序技术的出现以及计算分析方面的进步，动态突变疾病相关基因的发现速度得到了显著提升。仅2019年至2021年间，就有17个新的致病性和与风险相关的串联重复扩增被发表。三代测序为发现更长和更复杂的重复序列提供了强有力的工具。
6.2023年，希望组公司发布了三代动态突变检测芯片“repeat hunter”，并公开了相关专利cn116042610a。根据其专利内容，第一，在探针设计方面，其在str位点的上、下游分别延伸3 kb的区域设计，每两个相邻探针所覆盖位点的平均间隔为1000 bp。这种探针设计方法可能不适合有高同源序列或gc含量异常的区域，进而影响到单个基因的捕获效率。第二，在基因组dna片段化方面，其打断后dna片段为4.5～5.5 kb。基因组dna是随机打断的，且需要侧翼区进行基因定位，片段化dna长度越短，包含两侧翼区的目标重复区模板就越少。第三，在测序文库长度方面，合格文库要求主带长度为2 kb以上。希望组公司在文库构建流程中进行了2次pcr扩增，由于短片段更具有扩增优势，2次pcr扩增可能导致文库主带小于5 kb。目前，已有文献报道plin4基因的异常扩增重复区可达4 kb以上，因此，提高文库
主带长度，有利于检测超大异常重复扩增样本。


技术实现要素：

7.鉴于目前第三代长读长测序技术可满足对动态突变疾病重复扩增进行快速、准确、全面分子诊断的迫切需求，克服传统检测技术的单病单检、无目标重复区序列信息、可检测范围少且鉴别诊断所需时间长的缺点，本发明提供了一种可以同时检测多种动态突变疾病并提供目标重复区序列信息的技术，以期辅助临床更快、更准确进行鉴别诊断，缩短确诊时间。
8.本发明人发现，人类基因组中包含超过100万个注释的串联重复序列。由于其重复性和在人类基因组中的丰度，目标重复区区域可能不适宜设计探针，且异常重复扩增样本存在高gc或高at区域，检测难度大，所以探针设计区域是str和vntr基因位点的两侧翼区，即使用两侧翼区的特异性序列捕获目标重复区。
9.本发明人发现，在动态突变疾病谱中，致病重复单元多种多样，同一单元的重复次数在不同个体之间差异很大，有些甚至高达千次。因此，基因组dna随机片段化的长度越长、捕获模板的pcr扩增产物的长度越长、三代测序文库的长度越长，越有利于分析致病重复区的序列信息，尤其是针对超大异常重复扩增样本的检测。
10.本发明人发现，因为随机片段化后的dna长度不同，所以捕获模板在进行长片段扩增时，短片段更有扩增优势。对于本领域的技术人员来说，pcr产物的量与引物浓度和循环数均有关。本发明的建库过程中不含捕获前pcr，不仅可以减少实验操作步骤，即省去纯化和捕获前扩增过程，还可以避免捕获前pcr产物有扩增偏好性。
11.本发明人发现，使用y型接头，且无捕获前pcr，在杂交时可以省去用于封闭接头的封闭序列，并不会对捕获效率、覆盖度和覆盖均一性产生较大影响，从而节约杂交捕获成本。
12.因此，在第一个方面，本发明提供了一种用于检测动态突变str和vntr基因位点的探针组，靶向以下位点：1）str基因位点（69个）：atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、atxn8os/atxn8、atxn10、ppp2r2b、tbp、bean1/tk2、nop56、dab1、atn1、fxn、gls、rfc1、ar、dmpk、cnbp、lrp12、gipc1、nutm2b-as1/loc642361、pabpn1、c9orf72、nipa1、taf1、dmd、vwa1、spast、cstb、samd12、stard7、marchf6、yeats2、tnrc6a、rapgef2、notch2nlc、fmr1、aff2、aff3、znf713、c11orf80、dip2b、cbl、htt、jph3、prdm12、prnp、sox3、arx、zic2、hoxd13、eif4a3、runx2、hoxa13、foxl2、zic3、tbx1、xylt1、comp、tcf4、phox2b、fgf14、rilpl1、thap11、polg；2）vntr基因位点（4个）：cacna1c、plin4、abca7、wdr7。
13.进一步的，其中所述探针组满足以下要求：1）覆盖所述str和vntr基因位点的5’侧翼区及3’侧翼区各2 kb区域，主体采用1
×
平铺覆盖的方式设计探针；对于不适宜设计探针的区域，如序列特异性差则不设计探针；探针覆盖区域少时，根据以下原则提高探针密度：如果两侧翼区各2 kb区域探针覆盖的碱基在700
ꢀ‑ꢀ
1000 bp，采用2
×
平铺覆盖的方式设计探针；如果两侧翼区各2 kb区域探针覆盖的碱基在500
ꢀ‑ꢀ
700 bp，采用3
×
平铺覆盖的方式设计探针；如果两侧翼区各2 kb区域探针覆盖的碱基《500 bp，采用4
×
平铺覆盖
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×
平铺探针具体序列为（共计109条）：chr12:50502921-50503041;chr12:50502961-50503081;chr12:50503001-50503121;chr12:50503041-50503161;chr12:50503081-50503201;chr12:50503761-50503881;chr12:50503801-50503921;chr12:50503841-50503961;chr12:50503881-50504001;chr12:50504521-50504641;chr12:50504561-50504681;chr12:50504601-50504721;chr12:50504641-50504761;chr12:50504681-50504801;chr12:50504721-50504841;chr12:50504761-50504881;chr12:50504801-50504921;chr12:50504841-50504961;chr12:50504881-50505001;chr12:50504921-50505041;chr12:50504961-50505081;chr14:92068930-92069050;chr14:92068970-92069090;chr14:92069010-92069130;chr14:92070050-92070170;chr14:92070090-92070210;chr14:92070130-92070250;chr14:92070170-92070290;chr14:92070210-92070330;chr14:92070570-92070690;chr14:92070610-92070730;chr14:92070730-92070850;chr14:92070770-92070890;chr14:92070810-92070930;chr14:92070850-92070970;chr14:92070890-92071010;chr14:92070930-92071050;chr14:92070970-92071090;chr19:4508527-4508647;chr19:4508567-4508687;chr19:4508607-4508727;chr19:4508647-4508767;chr19:4508687-4508807;chr19:4508727-4508847;chr19:4508767-4508887;chr19:4508807-4508927;chr19:4508847-4508967;chr19:4508887-4509007;chr19:4508927-4509047;chr19:4508967-4509087;chr19:4510327-4510447;chr19:4510367-4510487;chr19:4510407-4510527;chr19:4510447-4510567;chr19:4513501-4513621;chr19:4513541-4513661;chr19:4513581-4513701;chr19:4513621-4513741;chr19:4513661-4513781;chr19:4513701-4513821;chr19:4513741-4513861;chr19:4513781-4513901;chr19:4513821-4513941;chr19:4513861-4513981;chr19:4513901-4514021;chr19:
4513941-4514061;chr19:4513981-4514101;chr19:4514021-4514141;chr19:4514061-4514181;chr19:4514101-4514221;chr19:4515541-4515661;chr2:96194975-96195095;chr2:96195015-96195135;chr2:96195055-96195175;chr2:96195095-96195215;chr2:96195135-96195255;chr2:96195175-96195295;chr2:96195215-96195335;chr2:96195255-96195375;chr2:96195295-96195415;chr2:96195335-96195455;chr2:96195375-96195495;chr2:96195415-96195535;chr2:96195455-96195575;chr2:96195495-96195615;chr2:96195535-96195655;chr2:96195575-96195695;chr2:96195615-96195735;chr2:96195655-96195775;chr2:96195695-96195815;chr2:96195735-96195855;chr2:96197415-96197535;chr2:96197455-96197575;chr2:96197495-96197615;chr2:96197535-96197655;chr2:96197575-96197695;chr2:96197935-96198055;chr2:96197975-96198095;chr2:96198375-96198495;chr2:96198415-96198535;chr2:96198455-96198575;chr2:96198495-96198615;chr2:96198775-96198895;chr2:96198815-96198935;chr2:96198855-96198975;chr2:96198895-96199015;chr2:96198935-96199055;chr2:96199055-96199175;chr2:96199095-96199215;4）4
×
平铺探针设计区域包括以下基因位点：str基因位点：atxn10、znf713；4
×
平铺探针具体序列为（共计37条）：chr22:45795329-45795449;chr22:45796769-45796889;chr22:45796799-45796919;chr22:45796829-45796949;chr22:45796859-45796979;chr22:45796889-45797009;chr22:45796919-45797039;chr22:45796949-45797069;chr22:45796979-45797099;chr22:45797009-45797129;chr22:45797039-45797159;chr22:45797069-45797189;chr22:45797099-45797219;chr22:45797129-45797249;chr22:45797159-45797279;chr22:45797189-45797309;chr22:45797219-45797339;chr7:55887874-55887994;chr7:55887904-55888024;chr7:55887934-55888054;chr7:55887964-55888084;chr7:55887994-55888114;chr7:55888024-55888144;chr7:55888054-55888174;chr7:55888084-55888204;chr7:55888114-55888234;chr7:55888204-55888324;chr7:55888234-55888354;chr7:55888264-55888384;chr7:55888294-55888414;chr7:55889434-55889554;chr7:55889464-55889584;chr7:55889494-55889614;chr7:55889524-55889644;chr7:55889554-55889674;chr7:55889584-55889704;chr7:55889614-55889734。
18.本发明所述探针根据人类参考基因组版本hg38设计，其中所述探针组中的每条探针为dna双链、dna单链、rna单链的至少一种；所述dna双链探针的正向序列与反向互补序列均可用于捕获动态突变str和vntr基因位点。
19.本发明所述探针组中的每个探针均带有标记。所述标记用于探针与片段化dna进行特异性结合后的信号放大和发光检测，包括生物素、亲和素、抗生物素蛋白、抗体或化学偶联剂中的至少一种，优选生物素。
20.在第二个方面，本发明提供一种构建单分子长读长测序文库的方法，包括以下步骤：
1）对dna进行随机片段化；2）对片段化dna进行末端修复和预文库接头连接，得到预文库；3）在不存在封闭序列的情况下，使预文库与本发明所述探针组进行杂交，得到杂交产物；4）使用磁珠捕获杂交产物并清洗后，进行pcr扩增，得到捕获文库；5）构建三代测序文库。
21.在一个实施方案中，基因组dna可以有多种来源，例如血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液、组织等样本。本领域技术人员知晓打断基因组dna的方法，例如通过超声处理、机械打断或通过酶切等，可根据实际需要可以调节打断条件。
22.在一个实施方案中，所述片段化dna长度为5
ꢀ–ꢀ
15 kb，优选7
ꢀ–ꢀ
10 kb。
23.在一个实施方案中，所述预文库接头呈y型结构，可为悬t接头或平端接头。“y型接头”是指不完全互补的两条dna单链经退火反应后形成的接头，所述接头的一端由于两条链的碱基互补形成双链，而另一端由于两条链的碱基之间不完全互补，没有形成双链。举例来说，可用于本发明的y型接头包含的两条链的序列如下：f：5
’ꢀ‑
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc
‑ꢀ3’ꢀ
(seq id no. 1)r：（5’端p代表磷酸化修饰）5
’ꢀ‑
pgatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatctcgtatgccgtcttctgcttg
‑ꢀ3’ꢀ
(seq id no. 2)其中下划线表示两条单链中碱基互补配对的部分。
24.在本发明的上下文中，“封闭序列”是指用于封闭接头和/或标签序列的序列，包括设计为与接头和/或标签序列反向互补的序列。在一些实施方案中，为增加封闭序列的封闭效果，在封闭序列的末端添加特殊修饰，如反向dt修饰、氨基修饰、ddntp修饰(包括ddctp、ddatp、ddgtp和ddttp)、间臂(spacer)修饰、次黄嘌呤修饰、随机碱基修饰等。
25.基于本发明人的发现，在无需进行捕获前pcr预扩增并且采用y型接头的情况下，杂交体系中不需要加入任何封闭序列也能实现较好的捕获效率。因此，在一个实施方案中，无需进行捕获前pcr扩增即可获得预文库。在另一个实施方案中，用于杂交的体系包括杂交缓冲液、增强液、人cot-1 dna和杂交探针，但不包括封闭序列。本领域技术人员可以根据实际需要调节杂交捕获的条件，如杂交温度、杂交时间、热洗温度和热洗次数等。设计和制备杂交探针的一般原理也是本领域技术人员熟知的。
26.在一个实施方案中，所述磁珠用于捕获杂交产物，优选链霉亲和素磁珠。
27.在一个实施方案中，捕获后pcr扩增体系包括扩增酶、扩增缓冲液、pcr添加剂、扩增引物及磁珠捕获后产物。其中所述扩增酶具有高保真性和优良扩增性，适用于扩增长片段和高gc/at含量等复杂模板；所述pcr添加剂可以降低二级结构、增强酶稳定性或抑制非特异性扩增，选自二甲基亚砜、甜菜碱、牛血清白蛋白、甲酰胺中的至少一种；所述扩增引物终浓度范围为0.1-1 μm，带有磷酸化修饰，适配预文库接头；扩增程序包括：94℃ 2-4min；98℃ 10-15sec，tm℃ 30sec，68℃ 5-10min，15-25cycles；68℃ 5-10min。
28.在一个实施方案中，捕获后pcr扩增产物和三代测序文库的主带约8 kb。
29.在一个具体的实施方案中，使用多个动态突变测序文库进行smrt测序，单张芯片下机数据表明整体的插入片段长度集中在5-10 kb，如图1所示。
30.在第三个方面，本发明提供一种str和vntr基因位点重复次数的检测设备，包括：1）捕获模块：用于构建捕获文库；2）文库构建模块：用于构建单分子长读长测序文库；3）测序及分析模块：对测序文库进行三代测序，并进行数据分析，获得目标重复区序列信息。
31.在一个实施方案中，本发明设备用于构建捕获文库的探针组选自如上文所述的探针组。
32.在一个实施方案中，本发明设备用于构建捕获文库及单分子长读长测序文库的方法选自如上文所述的测序文库构建方法。
33.在一个具体的实施方案中，其中所述单分子长读长测序平台选自基于单分子实时测序技术的pacific biosciences公司smrt测序平台和oxford nanopore公司纳米孔单分子测序平台。
34.在一个实施方案中，本发明所述设备的数据分析流程包括：1）三代测序下机数据经样本拆分后，比对人基因组参考序列；2）保留唯一比对的序列，筛选目标区域；3）统计目标重复区序列数目、捕获效率及覆盖深度。
35.在一个实施方案中，所述str基因位点重复次数的检测方法为：1）根据目标区域的序列，分析重复区，计算重复次数和支持序列数目，由数据库收录的信息判定致病性；2）根据目标重复区5’侧翼区及3’侧翼区的特异性序列比对，剪切重复区序列，分析重复单元次数和分型聚类，得到每个等位基因的重复结构，统计每个等位基因的重复次数和支持该等位基因的序列数目。
36.在一个具体的实施方案中，若上述方法所检测str基因位点的两个等位基因重复次数相同，则根据重复区两侧翼区的snvs定相，拆分单体型；对两个重复结构相同的等位基因，则分别统计重复次数和支持序列数目。
37.在一个具体的实施方案中，若上述方法所检测str基因位点阳性高重复中断，则对单侧重复序列比对重复区侧翼，定位重复区上游或下游，剪切过滤、计算重复单元数目，补充致病性判定。
38.在一个具体的实施方案中，所述str基因位点重复次数的检测方法中，等位基因重复次数的输出值可在以下统计量中选择：平均值、第三四分位值、中位数、众数或由核密度估计法返回的峰值，优选中位数。
39.在一个实施方案中，所述vntr基因位点重复次数的检测方法为：1）由于vntr重复单元存在大量多态，因此vntr基因位点重复区域检测需根据已有样本集对每一个vntr基因构建重复类型列表；2）根据目标重复区5’侧翼区及3’侧翼区的特异性序列比对，剪切重复区序列，从内置的vntr基因重复类型列表中识别重复单元，同类型多态合并计算重复次数；3）与str重复类似，分型聚类，统计每个等位基因的重复次数和支持序列数目。
40.在一个具体的实施方案中，所述vntr基因位点重复次数的检测方法中，等位基因重复次数的输出值可在以下统计量中选择：平均值、第三四分位值、中位数、众数或由核密度估计法返回的峰值，优选中位数。
41.本发明所述动态突变str和vntr基因位点重复次数检测方法不仅可报出已知致病重复单元的重复次数，还可同时报出重复区内其它重复单元的重复次数。这些其它重复单元来自对数据库和已发表文章的全面检索，可提示已报道但数据库尚未收录或致病关系尚未明确的重复单元与疾病的关系，有助于全面探索可能导致疾病的重复突变。
42.在第四个方面，本发明提供一种可检测动态突变str和vntr基因位点重复次数的方法，包括以下步骤：1）对dna样本进行随机片段化、末端修复和预文库接头连接，获得预文库；2）在不存在封闭序列的情况下，使用上述探针组与预文库杂交，并使用磁珠捕获杂交产物，清洗后进行pcr扩增，得到捕获文库；3）构建三代测序文库，进行三代测序并分析测序数据，获得目标序列信息。
43.在一个实施方案中，本发明方法用于构建预文库、捕获文库及三代测序文库的方法选自如上文所述的构建单分子长读长测序文库的方法。
44.在一个实施方案中，本发明方法用于分析测序数据的方法选自如上文所述的数据分析方法。
45.在第五个方面，本发明提供一种可检测动态突变str和vntr基因位点的试剂盒，包含以下组分：1）本发明所述探针组；2）用于构建预文库的试剂；3）用于杂交捕获的试剂，不包括封闭序列；4）用于pcr扩增的试剂；5）用于构建三代测序文库的试剂。
46.在一个实施方案中，所述用于构建预文库的试剂包括修复酶、修复缓冲液、连接酶、连接缓冲液和预文库接头。在一个具体的实施方案中，所述预文库接头呈y型结构，可为悬t接头或平端接头。
47.在一个实施方案中，所述杂交捕获试剂包括杂交缓冲液、增强液、人cot-1 dna、本发明所述探针组、磁珠及清洗试剂，但不包括封闭序列。
48.在一个实施方案中，所述磁珠用于捕获杂交产物，优选链霉亲和素磁珠。
49.在一个实施方案中，所述pcr扩增试剂包括扩增酶、扩增缓冲液、pcr添加剂和扩增引物。其中所述扩增酶具有高保真性和优良扩增性，适用于扩增长片段和高gc/at含量等复杂模板；所述pcr添加剂可以降低二级结构、增强酶稳定性或抑制非特异性扩增，选自二甲基亚砜、甜菜碱、牛血清白蛋白、甲酰胺中的至少一种；所述扩增引物终浓度范围0.1-1 μm，带有磷酸化修饰，适配预文库接头。
50.在一个实施方案中，所述构建三代测序文库的试剂包括修复酶、连接酶、外切酶和配套缓冲液，以及三代测序接头。
51.在第六个方面，本发明还提供了所述探针组或所述单分子长读长测序文库构建方法或所述str和vntr基因位点重复次数的检测设备或所述str和vntr基因位点重复次数检
测方法在制备用于检测动态突变str和vntr基因位点的试剂盒中的应用。
52.在一个实施方案中，所述str和vntr基因位点试剂盒适用于检测以下基因位点中的一种或多种：1）str基因位点（69个）：atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、atxn8os/atxn8、atxn10、ppp2r2b、tbp、bean1/tk2、nop56、dab1、atn1、fxn、gls、rfc1、ar、dmpk、cnbp、lrp12、gipc1、nutm2b-as1/loc642361、pabpn1、c9orf72、nipa1、taf1、dmd、vwa1、spast、cstb、samd12、stard7、marchf6、yeats2、tnrc6a、rapgef2、notch2nlc、fmr1、aff2、aff3、znf713、c11orf80、dip2b、cbl、htt、jph3、prdm12、prnp、sox3、arx、zic2、hoxd13、eif4a3、runx2、hoxa13、foxl2、zic3、tbx1、xylt1、comp、tcf4、phox2b、fgf14、rilpl1、thap11、polg；2）vntr基因位点（4个）：cacna1c、plin4、abca7、wdr7。
53.在一个实施方案中，本发明所述探针组或所述str和vntr基因位点重复次数的检测设备或所述动态突变str和vntr基因位点的检测试剂盒可用于检测以下疾病中的一种或多种：脊髓小脑性共济失调1型(sca1)、脊髓小脑性共济失调2型(sca2)、脊髓小脑性共济失调3型(sca3)、脊髓小脑性共济失调6型(sca6)、脊髓小脑性共济失调7型(sca7)、脊髓小脑性共济失调8型(sca8)、脊髓小脑共济失调12型(sca12)、脊髓小脑性共济失调17型(sca17)、脊髓小脑共济失调36型(sca36)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(drpla)、肯尼迪病(sbma)、强直性肌营养不良1型(dm1)、亨廷顿舞蹈病(hd)、亨廷顿样疾病-2(hdl2)、眼咽肌营养不良(opmd)、脊髓小脑共济失调37型(sca37)、弗里德里希共济失调(frda)、全身性发育迟缓,进行性共济失调,谷氨酰胺升高(gdpag)、脆性x相关震颤/共济失调综合征(fxtas)、脆性x综合征(fxs)、脆性x相关的卵巢功能不全(fxpoi)、脆性x相关精神障碍(fxand)、脆性xe综合征(fraxe)、kinsship综合征(fra2a)、智力迟钝fra11a型(fra11a)、智力迟钝fra12a型(fra12a)、jacobsen综合征(fra11b)、家族性成人肌阵挛性癫痫1型(fame1)、家族性成人肌阵挛性癫痫6型(fame6)、家族性成人肌阵挛性癫痫7型(fame7)、早期婴儿癫痫性脑病1型(elee1)/帕廷顿智力低下综合征(prts)/伴或不伴癫痫发作的x相关智力障(mrxarx)、强直性肌营养不良2型(dm2)、神经元核内包涵体疾病(niid)、遗传性特发性震颤6型(etm6)、眼咽肌病3型(opdm3)、眼咽肌病1型(opdm1)、眼咽肌病2型(opdm2)、伴脑白质病的眼咽病(opml1)、肌萎缩侧索硬化症1(als1)、杜氏肌营养不良(dmd)、遗传性运动神经病(hmn)、遗传性感觉和自主神经病变第8型(hsan8)、痉挛性截瘫4(spg4)、richieri-costa-pereira综合征(rcps)、克雅氏病(cjd)、fuchs内皮角膜营养不良3型(fecd3)、并多指畸形1型、短指和锁颅发育不全(ccd)、手-脚-生殖综合征(hfgs)、小睑裂综合征(bpes)、全前脑畸形5型(hpe5)、单一性长激素缺乏症伴精神发育迟滞(mrgh)、x连锁垂体功能低下(phpx)、先天性中枢性通气不足综合征(cchs)、先天性联合畸形(vacterl)、眼-耳-脊椎畸形(ovas)、法洛四联症(tof)、骨骺发育不良1型(edm1)、假软骨发育不全(psach)、眼咽肌病4型(opdm4)、迟发性脊髓小脑共济失调-27b(sca27b)、baratela-scott综合症(bss)、阿尔茨海默病(ad)、精神分裂症和双相情感障碍(bd/scz)、伴泛素阳性自噬镶边空泡性肌病(mrupav)、x-连锁肌张力障碍帕金森症(xdp)、肌萎缩侧索硬化症3(als3)、脊髓小脑共济失调10型(sca10)、脊髓小脑共济失调31型(sca31)、伴神经病变和前庭反射消失的小脑性共济失调综合征(canvas)、孤独症谱系障碍(fra7a)、进行性肌阵挛性癫痫1型(epm1)、家族性成人肌阵挛性癫痫2型(fame2)、家族性成人肌阵挛性癫痫3型(fame3)、家族性成人肌阵挛
性癫痫4型(fame4)、额颞叶痴呆/肌萎缩侧索硬化症(c9orf72-ftd/als)、脊髓小脑性共济失调、弗里德里希共济失调(frda)。
54.本发明公开了检测动态突变str和vntr基因位点的探针组、检测设备及试剂盒，基于靶向捕获长片段和长读长测序技术，本发明可实现单样本一次性检出所有靶向基因位点的目标重复区序列信息，克服传统检测技术的单病单检、无目标重复区序列信息、可检测范围少且鉴别诊断所需时间长的缺点。
附图说明
55.图1：测序文库下机数据。
56.图2：测序文库构建流程图。
57.图3：测序文库片段分析，lower指lower marker。
58.图4：样本31中plin4基因的目标重复区信息。
59.图5：样本32中plin4基因的目标重复区信息。
60.图6：样本33中plin4基因的目标重复区信息。
实施方式
61.通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为本发明保护的范围。下述实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。
62.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
63.本发明提供了检测动态突变str和vntr基因位点的探针组、检测设备及试剂盒，通过靶向捕获长片段和长读长测序技术，实现了单样本一次性检出73个str及vntr基因位点，涉及79种疾病，有助于临床进行快速、准确、全面的分子诊断。73个动态突变基因位点与所涉及79种疾病的对应关系如表1所示。
64.表1：73个动态突变基因位点与所涉及79种疾病的对应关系
[0065][0066]
实施例1：构建三代测序文库，测试不同dna起始量对文库主带的影响三代测序文库构建流程如图2所示，具体构建方法如下文所示：1. 基因组dna片段化使用g-tube(covaris，货号520079)进行基因组dna片段化。使用同一样本dna，起始量分别为2
ꢀµ
g、3
ꢀµ
g和4
ꢀµ
g，完成片段化反应后，经ampure pb磁珠纯化得到片段化dna。
[0067]
2. 末端修复使用末端修复试剂(enzymatics，货号y9140-hc-l)制备如表2所示的反应体系，完成末端修复反应。反应程序：25 ℃ 30分钟；75 ℃ 20分钟；然后保持在4 ℃。
[0068]
表2：末端修复体系
[0069]
3. 预文库接头连接使用连接酶试剂(enzymatics，货号l6030-hc-l)制备如表3所示的反应体系，完成连接反应。反应程序：20 ℃ 30分钟；然后保持在4 ℃。连接反应结束后，使用ampure pb磁珠进行纯化。
[0070]
表3：连接体系
[0071]
4. 预文库杂交在上述纯化产物中加入如表4所示的杂交试剂(idt，货号1072281)，充分混匀后于室温孵育10分钟。孵育结束后，取上清液转移至新的低吸附0.2 ml离心管中，并加入4
ꢀµ
l本发明所提供的动态突变探针组。充分混匀后瞬时离心，并于pcr仪上运行如下程序：95 ℃ 5分钟；47℃ 17小时；然后保持在47 ℃。
[0072]
表4：杂交体系
[0073]
5. 磁珠捕获和清洗使用链霉亲和素磁珠捕获杂交产物，并对杂交产物进行热洗和室温清洗(idt，货号1072281)，清洗完毕后，使用无酶水重悬磁珠。
[0074]
6. pcr扩增在上述产物中加入如表5所示的反应体系(toyobo，货号kfx-201)，充分混匀后瞬时离心，并运行如表6所示程序。pcr反应结束后，使用ampure pb磁珠进行纯化。
[0075]
表5：pcr反应体系
[0076]
表6：pcr反应程序
[0077]
7. 三代测序文库构建使用试剂盒构建三代测序文库(pacbio，货号102-088-900)，试剂包括修复酶、连接酶、外切酶和配套缓冲液，以及三代测序接头，最终得到测序文库。
[0078]
8. 文库qc和结果展示使用agilent 4200 tapestation系统和基因组dna试剂（agilent，5067-5365、5067-5366）对文库进行片段分析，结果表明2-4
ꢀµ
gdna起始量均可以构建文库，且文库主带均约8 kb，如表7和图3所示。
[0079]
表7：文库片段分析结果
[0080]
实施例2：构建三代测序文库，验证str基因位点检测性能参照实施例1的建库方法，使用27例临床样本及3例coriell人类基因组标准样本分别构建测序文库，统计不同重复单元的重复次数中位数，并与rp-pcr或dmwes检出结果或coriell参考结果进行对比。结果如表8所示，本发明方法所检出重复次数中位数与rp-pcr或dmwes检出结果或coriell参考结果均一致。
[0081]
本发明方法不仅可报出已知致病重复单元的重复次数，还可同时报出重复区内其它重复单元的重复次数。这些其它重复单元来自对数据库和已发表文章的全面检索，可提示已报道但数据库尚未收录或致病关系尚未明确的重复单元与疾病的关系，有助于全面探索可能导致疾病的重复突变。
[0082]
表8：str基因位点检测结果。本发明方法检测的样本1中，“atxn1|cag,cat 27_1;60_1”表示常染色体上atxn1一个等位基因有27次cag单元和1次cat单元，另一个等位基因有60次cag单元和1次cat单元；rp-pcr检测的重复次数可能包含其它中断序列，如样本1中的“atxn1|cag,cat 28;61”表示常染色体上atxn1一个等位基因有28次cag单元（含cat单
元），另一个等位基因有61次cag单元（含cat单元）；下同，“/”表示未检测。
[0083][0084]
注：未超过rp-pcr或dmwes检测上限时，重复单元的重复次数偏差
±
2以内视为结果一致，超过检测上限时，理论致病性判定一致即可；样本28-30分别为coriell标准样本na07537（fmr1|cgg 28-29；》200）、na07862（fmr1|cgg 501-550）及na09237（fmr1|cgg 931-940），理论致病性判定一致即视为结果一致。
[0085]
实施例3：构建三代测序文库，验证vntr基因位点检测性能
[0086]
参照实施例1的建库方法，使用3例医院已知长片段pcr结果的临床样本分别构建测序文库，检测vntr基因位点plin4的目标重复区信息，并与长片段pcr扩增结果进行对比。结果如表9和图 4-6所示，本发明方法所检出重复区长度与长片段pcr扩增结果一致，样本32-33均有异常重复扩增的条带。
[0087]
表9：plin4基因位点检测结果
[0088]
注：目标重复区长度与pcr产物大小接近视为结果一致。

技术特征：
1.一种用于检测动态突变str和vntr基因位点的探针组，靶向以下位点：1）str基因位点（69个）：atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、atxn8os/atxn8、atxn10、ppp2r2b、tbp、bean1/tk2、nop56、dab1、atn1、fxn、gls、rfc1、ar、dmpk、cnbp、lrp12、gipc1、nutm2b-as1/loc642361、pabpn1、c9orf72、nipa1、taf1、dmd、vwa1、spast、cstb、samd12、stard7、marchf6、yeats2、tnrc6a、rapgef2、notch2nlc、fmr1、aff2、aff3、znf713、c11orf80、dip2b、cbl、htt、jph3、prdm12、prnp、sox3、arx、zic2、hoxd13、eif4a3、runx2、hoxa13、foxl2、zic3、tbx1、xylt1、comp、tcf4、phox2b、fgf14、rilpl1、thap11、polg；2）vntr基因位点（4个）：cacna1c、plin4、abca7、wdr7。2.根据权利要求1所述探针组，其满足以下要求：1）覆盖权利要求1所述str和vntr基因位点的5’侧翼区及3’侧翼区各2 kb区域，主体采用1
×
平铺覆盖的方式设计探针；对于不适宜设计探针的区域，如序列特异性差则不设计探针；探针覆盖区域少时，根据以下原则提高探针密度：如果两侧翼区各2 kb区域探针覆盖的碱基在700
ꢀ‑ꢀ
1000 bp，采用2
×
平铺覆盖的方式设计探针；如果两侧翼区各2 kb区域探针覆盖的碱基在500
ꢀ‑ꢀ
700 bp，采用3
×
平铺覆盖的方式设计探针；如果两侧翼区各2 kb区域探针覆盖的碱基 < 500 bp，采用4
×
平铺覆盖的方式设计探针；2）探针长度为80
ꢀ–ꢀ
120 bp，gc含量优选40%
ꢀ‑ꢀ
60%。3.根据权利要求1或2所述探针组，对于所述str基因位点，采用4
×
平铺覆盖的方式设计探针时，若该基因位点的目标重复区可以设计探针，优先采用1
×
平铺覆盖的方式设计探针；或在其基因位点的5’侧翼区及3’侧翼区各第2-3 kb区域采用1
×
平铺覆盖的方式设计探针。4.根据权利要求1或2所述探针组，对于所述vntr基因位点，若该基因位点的目标重复区可以设计探针，优先采用1
×
平铺覆盖的方式设计探针；或在其基因位点的5’侧翼区及3’侧翼区各第2-3 kb区域采用1
×
平铺覆盖的方式设计探针。5.根据权利要求1-4任一项所述探针组，其包括以下2230条序列中的全部或至少一种：1）1
×
平铺探针设计区域包括以下基因位点：str基因位点：atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、atxn8os/atxn8、atxn10、ppp2r2b、tbp、bean1/tk2、nop56、dab1、atn1、fxn、gls、rfc1、ar、dmpk、cnbp、lrp12、gipc1、pabpn1、c9orf72、nipa1、taf1、dmd、vwa1、cstb、samd12、marchf6、yeats2、tnrc6a、rapgef2、notch2nlc、fmr1、aff2、aff3、znf713、c11orf80、dip2b、cbl、htt、jph3、prdm12、prnp、sox3、arx、zic2、hoxd13、eif4a3、runx2、hoxa13、foxl2、zic3、tbx1、xylt1、comp、tcf4、phox2b、fgf14、rilpl1、thap11、polg；vntr基因位点：cacna1c、plin4、abca7、wdr7；1
×
平铺探针具体探针序列（共计1867条）：chr1:1433798-1433918;chr1:1433915-1434035;chr1:1434033-1434153;chr1:1434150-1434270;chr1:1434271-1434391;chr1:1434388-1434508;chr1:1434505-1434625;chr1:1434622-1434742;chr1:1434743-1434863;chr1:1434860-1434980;chr1:1434978-1435098;chr1:1435095-1435215;chr1:1435216-1435336;chr1:1435333-1435453;chr1:1435451-1435571;chr1:1435568-1435688;chr1:1435689-1435809;chr1:
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×
平铺探针设计区域包括以下基因位点：str基因位点：atxn3、stard7、dip2b；vntr基因位点：plin4；3
×
平铺探针具体序列为（共计109条）：chr12:50502921-50503041;chr12:50502961-50503081;chr12:50503001-50503121;chr12:50503041-50503161;chr12:50503081-50503201;chr12:50503761-50503881;chr12:50503801-50503921;chr12:50503841-50503961;chr12:50503881-50504001;chr12:50504521-50504641;chr12:50504561-50504681;chr12:50504601-50504721;chr12:50504641-50504761;chr12:50504681-50504801;chr12:50504721-50504841;chr12:50504761-50504881;chr12:50504801-50504921;chr12:50504841-50504961;chr12:50504881-50505001;chr12:50504921-50505041;chr12:50504961-50505081;chr14:92068930-92069050;chr14:92068970-92069090;chr14:92069010-92069130;
chr14:92070050-92070170;chr14:92070090-92070210;chr14:92070130-92070250;chr14:92070170-92070290;chr14:92070210-92070330;chr14:92070570-92070690;chr14:92070610-92070730;chr14:92070730-92070850;chr14:92070770-92070890;chr14:92070810-92070930;chr14:92070850-92070970;chr14:92070890-92071010;chr14:92070930-92071050;chr14:92070970-92071090;chr19:4508527-4508647;chr19:4508567-4508687;chr19:4508607-4508727;chr19:4508647-4508767;chr19:4508687-4508807;chr19:4508727-4508847;chr19:4508767-4508887;chr19:4508807-4508927;chr19:4508847-4508967;chr19:4508887-4509007;chr19:4508927-4509047;chr19:4508967-4509087;chr19:4510327-4510447;chr19:4510367-4510487;chr19:4510407-4510527;chr19:4510447-4510567;chr19:4513501-4513621;chr19:4513541-4513661;chr19:4513581-4513701;chr19:4513621-4513741;chr19:4513661-4513781;chr19:4513701-4513821;chr19:4513741-4513861;chr19:4513781-4513901;chr19:4513821-4513941;chr19:4513861-4513981;chr19:4513901-4514021;chr19:4513941-4514061;chr19:4513981-4514101;chr19:4514021-4514141;chr19:4514061-4514181;chr19:4514101-4514221;chr19:4515541-4515661;chr2:96194975-96195095;chr2:96195015-96195135;chr2:96195055-96195175;chr2:96195095-96195215;chr2:96195135-96195255;chr2:96195175-96195295;chr2:96195215-96195335;chr2:96195255-96195375;chr2:96195295-96195415;chr2:96195335-96195455;chr2:96195375-96195495;chr2:96195415-96195535;chr2:96195455-96195575;chr2:96195495-96195615;chr2:96195535-96195655;chr2:96195575-96195695;chr2:96195615-96195735;chr2:96195655-96195775;chr2:96195695-96195815;chr2:96195735-96195855;chr2:96197415-96197535;chr2:96197455-96197575;chr2:96197495-96197615;chr2:96197535-96197655;chr2:96197575-96197695;chr2:96197935-96198055;chr2:96197975-96198095;chr2:96198375-96198495;chr2:96198415-96198535;chr2:96198455-96198575;chr2:96198495-96198615;chr2:96198775-96198895;chr2:96198815-96198935;chr2:96198855-96198975;chr2:96198895-96199015;chr2:96198935-96199055;chr2:96199055-96199175;chr2:96199095-96199215;4）4
×
平铺探针设计区域包括以下基因位点：str基因位点：atxn10、znf713；4
×
平铺探针具体序列为（共计37条）：chr22:45795329-45795449;chr22:45796769-45796889;chr22:45796799-45796919;chr22:45796829-45796949;chr22:45796859-45796979;chr22:45796889-45797009;chr22:45796919-45797039;chr22:45796949-45797069;chr22:45796979-45797099;chr22:45797009-45797129;chr22:45797039-45797159;chr22:45797069-45797189;chr22:45797099-45797219;chr22:45797129-45797249;chr22:45797159-45797279;chr22:45797189-45797309;chr22:45797219-45797339;chr7:55887874-55887994;chr7:55887904-55888024;chr7:55887934-55888054;chr7:55887964-55888084;chr7:55887994-55888114;chr7:55888024-55888144;chr7:55888054-55888174;chr7:
55888084-55888204;chr7:55888114-55888234;chr7:55888204-55888324;chr7:55888234-55888354;chr7:55888264-55888384;chr7:55888294-55888414;chr7:55889434-55889554;chr7:55889464-55889584;chr7:55889494-55889614;chr7:55889524-55889644;chr7:55889554-55889674;chr7:55889584-55889704;chr7:55889614-55889734。6.根据权利要求1-5任一项所述探针组，其中所述探针组中的每条探针为dna双链、dna单链或rna单链中的至少一种；其中所述dna双链探针的正向序列与反向互补序列均可用于捕获动态突变str和vntr基因位点。7.根据权利要求1-6任一项所述探针组，其中所述探针组中的每条探针均带有标记物。8.根据权利要求1-7任一项所述探针组，其中所述标记物选自以下组中的一种或多种：生物素、亲和素、抗生物素蛋白、抗体或化学偶联剂；优选生物素。9.一种构建单分子长读长测序文库的方法，包括以下步骤：1）对dna样本进行随机片段化；2）对片段化dna进行末端修复和预文库接头连接，得到预文库；3）在不存在封闭序列的情况下，使预文库与探针组进行杂交，得到杂交产物；4）使用磁珠捕获杂交产物并清洗后，进行pcr扩增，得到捕获文库；5）构建三代测序文库。10.根据权利要求9所述方法，其中步骤1）中所述dna随机片段化方法包括超声处理、机械打断或通过酶切实现。11.根据权利要求9所述方法，其中步骤1）中所述随机片段化dna长度范围为5
ꢀ–ꢀ
15 kb。12.根据权利要求11所述方法，其中步骤1）中所述随机片段化dna长度优选范围为7
ꢀ–ꢀ
10 kb。13.根据权利要求9所述方法，其中步骤2）中所述预文库接头呈y型结构，可为悬t接头或平端接头。14.根据权利要求13所述方法，其中所述预文库接头包括不完全互补的两条dna单链，dna单链长度可为30-70 bp，经退火反应后制备成工作接头。15.根据权利要求9所述方法，其中步骤2）中无需进行捕获前pcr扩增即可获得预文库。16.根据权利要求9所述方法，其中步骤3）中所述探针组为权利要求1-8任一项所述的探针组。17.根据权利要求9所述方法，其中步骤3）中所述杂交体系包括杂交缓冲液、增强液、人cot-1 dna和权利要求1-8任一项所述的探针组，但不包括封闭序列。18.根据权利要求9所述方法，其中步骤3）中所述封闭序列指设计为与接头序列反向互补的序列。19.根据权利要求9所述方法，其中步骤4）中所述扩增体系包括扩增酶、扩增缓冲液、pcr添加剂、扩增引物和磁珠捕获后产物。20.根据权利要求19所述方法，其中所述扩增酶具有高保真性和优良扩增性，适用于扩增长片段和高gc/at含量等复杂模板。21.根据权利要求19所述方法，其中所述pcr添加剂可以降低二级结构、增强酶稳定性
或抑制非特异性扩增；所述pcr添加剂选自二甲基亚砜、甜菜碱、牛血清白蛋白、甲酰胺中的至少一种。22.根据权利要求19所述方法，其中所述扩增引物终浓度范围为0.1-1 μm，带有磷酸化修饰，适配预文库接头；扩增程序包括：94℃ 2-4min；98℃ 10-15sec，tm℃ 30sec，68℃ 5-10min，15-25 cycles；68℃ 5-10min。23.根据权利要求9所述方法，其中步骤5）中所述三代测序文库的主带约8 kb。24.一种str和vntr基因位点重复次数的检测设备，包括：1）捕获模块：用于构建捕获文库；2）文库构建模块：用于构建单分子长读长测序文库；3）测序及分析模块：对测序文库进行三代测序，并进行数据分析，获得目标重复区序列信息。25.根据权利要求24所述设备，其中所述用于构建捕获文库的探针组为权利要求1-8任一项所述探针组。26.根据权利要求24所述设备，其中所述构建捕获文库及单分子长读长测序文库的方法为权利要求9-23任一项所述方法。27.根据权利要求24所述设备，其中所述单分子长读长测序平台选自基于单分子实时测序技术的pacific biosciences公司smrt测序平台和oxford nanopore公司纳米孔单分子测序平台。28.根据权利要求24所述设备，其中所述数据分析流程包括：1）三代测序下机数据经样本拆分后，比对人基因组参考序列；2）保留唯一比对的序列，筛选目标区域；3）统计目标重复区序列数目、捕获效率及覆盖深度。29.根据权利要求28所述流程，其中str基因位点重复次数的检测方法为：1）根据目标区域的序列，分析重复区，计算重复次数和支持序列数目，由数据库收录的信息判定致病性；2）根据目标重复区5’侧翼区及3’侧翼区的特异性序列比对，剪切重复区序列，分析重复单元次数和分型聚类，得到每个等位基因的重复结构，统计每个等位基因的重复次数和支持该等位基因的序列数目。30.根据权利要求29所述方法，其中所述str基因位点的重复次数检测方法还包括，当str基因位点的两个等位基因重复次数相同时，则根据重复区两侧翼区的snvs定相，拆分单体型；对两个重复结构相同的等位基因，则分别统计重复次数和支持序列数目。31.根据权利要求29或30任一项所述方法，其中所述str基因位点的重复次数检测方法还包括，当str基因位点阳性高重复中断时，则对单侧重复序列比对重复区侧翼，定位重复区上游或下游，剪切过滤、计算重复单元数目，补充致病性判定。32.根据权利要求28所述流程，其中vntr基因位点重复次数的检测方法为：1）根据已有样本集对每一个vntr基因构建重复类型列表；2）根据目标重复区5’侧翼区及3’侧翼区的特异性序列比对，剪切重复区序列，从内置的vntr基因重复类型列表中识别重复单元，同类型多态合并计算重复次数；3）分型聚类，统计每个等位基因的重复次数和支持序列数目。
33.一种检测动态突变str和vntr基因位点重复次数的方法，包括以下步骤：1）对dna样本进行随机片段化、末端修复和预文库接头连接，获得预文库；2）在不存在封闭序列的情况下，使权利要求1-8任一项所述探针组与预文库杂交，并使用磁珠捕获杂交产物，清洗后进行pcr扩增，得到捕获文库；3）构建三代测序文库，进行三代测序并分析测序数据，获得目标序列信息。34.根据权利要求33所述方法，其中所述构建预文库、捕获文库及三代测序文库的方法为权利要求9-23任一项所述方法。35.根据权利要求33所述方法，其中所述测序数据分析方法为权利要求28-32任一项所述方法。36.一种可检测动态突变str和vntr基因位点的试剂盒，其包括：1）权利要求1-8任一项所述探针组；2）用于构建预文库的试剂；3）用于杂交捕获的试剂，不包括封闭序列；4）用于pcr扩增的试剂；5）用于构建三代测序文库的试剂。37.根据权利要求36所述试剂盒，其中所述用于构建预文库的试剂包括修复酶、修复缓冲液、连接酶、连接缓冲液和预文库接头。38.根据权利要求37所述试剂盒，其中所述预文库接头呈y型结构，可为悬t接头或平端接头。39.根据权利要求36所述试剂盒，其中所述杂交捕获试剂包括杂交缓冲液、增强液、人cot-1 dna、权利要求1-8任一项所述的探针组、磁珠及清洗试剂，但不包括封闭序列。40.根据权利要求39所述试剂盒，其中所述封闭序列指设计为与接头序列反向互补的序列。41.根据权利要求36所述试剂盒，其中所述pcr扩增试剂包括扩增酶、扩增缓冲液、pcr添加剂和扩增引物。42.根据权利要求41所述试剂盒，其中所述扩增酶具有高保真性和优良扩增性，适用于扩增长片段和高gc/at含量等复杂模板。43.根据权利要求41所述试剂盒，其中所述pcr添加剂可以降低二级结构、增强酶稳定性或抑制非特异性扩增，所述pcr添加剂选自二甲基亚砜、甜菜碱、牛血清白蛋白、甲酰胺中的至少一种。44.根据权利要求41所述试剂盒，其中所述扩增引物终浓度范围为0.1-1 μm，带有磷酸化修饰，适配预文库接头。45.根据权利要求36所述试剂盒，其中所述构建三代测序文库的试剂包括修复酶、连接酶、外切酶和配套缓冲液，以及三代测序接头。46.权利要求1-8任一项所述探针组或权利要求9-23任一项所述单分子长读长测序文库构建方法或权利要求24-32任一项所述设备或权利要求33-35任一项所述方法在制备用于检测动态突变str和vntr基因位点的试剂盒中的应用。47.根据权利要求46所述应用，其所述str和vntr基因位点包括：1）str基因位点（69个）：atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、atxn8os/atxn8、atxn10、
ppp2r2b、tbp、bean1/tk2、nop56、dab1、atn1、fxn、gls、rfc1、ar、dmpk、cnbp、lrp12、gipc1、nutm2b-as1/loc642361、pabpn1、c9orf72、nipa1、taf1、dmd、vwa1、spast、cstb、samd12、stard7、marchf6、yeats2、tnrc6a、rapgef2、notch2nlc、fmr1、aff2、aff3、znf713、c11orf80、dip2b、cbl、htt、jph3、prdm12、prnp、sox3、arx、zic2、hoxd13、eif4a3、runx2、hoxa13、foxl2、zic3、tbx1、xylt1、comp、tcf4、phox2b、fgf14、rilpl1、thap11、polg；2）vntr基因位点（4个）：cacna1c、plin4、abca7、wdr7。

技术总结
本发明公开了一种动态突变STR和VNTR基因位点的检测探针组、试剂盒及方法，检测范围包括73个基因位点，涉及79种疾病。本发明使用靶向捕获长片段和长读长测序技术，实现单样本一次性检出所有靶向基因位点的目标重复区序列信息，克服传统检测技术的单病单检、无目标重复区序列信息、可检测范围少且鉴别诊断所需时间长的缺点。间长的缺点。


技术研发人员：李玉婷 张晓杰 李淑娟 高扬 陈迪 张秀娟 于倩 张丽
受保护的技术使用者：北京贝瑞和康生物技术有限公司
技术研发日：2023.09.08
技术公布日：2023/10/20