大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用的制作方法

1.本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用。


背景技术：

2.肉制品是我国居民饮食结构中的重要组成部分，深受消费者的喜爱。近些年受疫情及非洲猪瘟等的影响，原料肉的价格上下浮动较大，一些不法商家为了降低成本，使用大量植物蛋白替代畜禽肉成分，最为常用的植物蛋白为大豆蛋白，但在配料表中却不按事实标注，虽然蛋白总量符合要求，但动物蛋白较低，使得产品价格低于市场价格，致合规性肉类制品企业的产品在市场上受阻，竞争力不足，长此以往影响企业的生存及发展。此外，加入大豆蛋白还会存在过敏现象，部分消费者食用后，会出现腹泻以及腹胀等胃肠道反应。
3.然而，目前部分标准及文献中报道了大豆蛋白定性检测的方法，但没有测定肉制品中大豆蛋白真实含量的相关报道。因此，为顺应市场需求、规范行业标识、维护市场公平提供强有力的技术支持，亟需发明一种肉制品中大豆蛋白含量的测定方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用，具有检测准确度高的特点。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用，所述大豆特异性定量多肽包括spqlqnlr、nileasydtk或eqqqeqqqeeqplevr中的一种。
7.本发明还提供了一种肉制品大豆蛋白含量的检测方法，包括：配置不同浓度的大豆蛋白标准溶液，使用液相色谱串联质谱检测，绘制权利要求1所述大豆特异性定量多肽的标准工作曲线；提取肉制样品中的蛋白质，经还原及烷基化、酶解、除盐后，得到待测液，使用液相色谱串联质谱检测，根据标准工作曲线，得到肉制样品中大豆蛋白的含量；所述大豆特异性定量多肽包括spqlqnlr、nileasydtk或eqqqeqqqeeqplevr中的一种。
8.优选的，所述提取肉制样品中的蛋白质用提取液进行提取，所述提取液包括如下浓度的组分：0.05mol/l tris-hcl、7mol/l尿素和2mol/l硫脲；所述提取液的ph值为8.0。
9.优选的，所述还原的试剂为浓度0.05mol/l的二硫苏糖醇溶液；所述烷基化的试剂为浓度0.1mol/l的碘乙酰胺溶液。
10.优选的，所述酶解的酶为胰蛋白酶，温度为37℃，ph值为8.0。
11.优选的，所述除盐采用固相萃取柱除盐。
12.优选的，所述液相色谱的条件为：色谱柱为hypersil gold c
18
，流速为0.2ml/min；柱温40℃，进样量20μl；流动相中a相为体积百分含量为0.1％的fa/h2o，b相为体积百分含量为0.1％的fa/acn；所述液相色谱的色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％b；0.2～16min，10％～40％b；16～17min，40％～80％b；17.5～18.5min，80％～3％b。
13.优选的，所述质谱的条件为：喷雾电压为3500v；鞘气为38arb；辅气为15arb；离子传输管温度为275℃；离子源雾化温度为380℃；传输线温度为275℃；离子源温度为380℃；采集周期为0.3s；碰撞气为1.5mtorr；q1分辨率为0.7，q3分辨率为0.7。
14.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.本发明提供了大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用，所述大豆特异性定量多肽包括spqlqnlr、nileasydtk或eqqqeqqqeeqplevr中的一种；所述检测方法为：配置不同浓度的大豆蛋白标准溶液，绘制大豆特异性定量多肽的标准工作曲线；将肉制样品预处理后，得到待测液，使用液相色谱串联质谱检测，根据标准工作曲线，得到肉制样品中大豆蛋白的含量。
16.实验结果表明，本发明利用大豆特异性定量多肽检测肉制品中的大豆蛋白，回收率达到87.52％～94.19％，而采用alvqvvncnger多肽，回收率仅为48.91％，可见，采用本发明大豆特异性定量多肽检测肉制品中的大豆蛋白含量，具有特异性强、准确率高的优势，为顺应市场需求、规范行业标识、维护市场公平提供强有力的技术支持。
附图说明
17.图1为实施例3肉丸样品三种大豆特异性定量多肽的mrm质谱图；
18.图2为为纯大豆蛋白的样品(左)与肉丸样品(右)的总离子流图。
具体实施方式
19.本发明提供了大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用，所述大豆特异性定量多肽包括spqlqnlr、nileasydtk或eqqqeqqqeeqplevr中的一种。
20.本发明所述spqlqnlr的氨基酸序列为丝氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮氨酸-精氨酸(如seq id no.1所示)serpro gln leu gln asn len arg，来源于蛋白alpha subunit ofbeta conglycinin，分子量为954.5241，质谱中带2个电荷，母离子为478.2。所述nileasydtk的氨基酸序列为天冬酰胺-异亮氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸(如seq id no.2所示)，来源于蛋白beta-conglycinin alpha'subunit，分子量为1152.5657，质谱中带2个电荷，母离子为577.2。所述eqqqeqqqeeqplevr的氨基酸序列为谷氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-谷氨酰胺-谷氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-谷氨酰胺-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酸-缬氨酸-精氨酸(如seq id no.3所示)，来源于蛋白alpha subunit ofbeta conglycinin，分子量为2024.9394，质谱中带3个电荷，母离子为675.9。
21.本发明利用蛋白质组学软件分析纯大豆样品的高分辨质谱图，通过搜索uniprot蛋白数据库，从中筛选出大豆特异性多肽。经skyline软件分析，得到筛选特异性多肽的离子对信息，并经过lc-ms/ms进行验证。后续通过标准曲线的绘制以及回收率情况，进一步筛选出大豆定量多肽，并得到相应的大豆蛋白的含量。
22.本发明分别将上述大豆特异性定量多肽和alvqvvncnger多肽用于检测肉制品大豆蛋白含量，实验结果表明，本发明检测方法，回收率可达到87.52％～94.19％，而采用alvqvvncnger多肽，回收率仅为48.91％，可见，采用本发明大豆特异性定量多肽检测肉制品中的大豆蛋白含量，具有特异性强、准确率高的优势。
23.本发明还提供了一种肉制品大豆蛋白含量的检测方法，包括：配置不同浓度的大豆蛋白标准溶液，使用液相色谱串联质谱检测，绘制权利要求1所述大豆特异性定量多肽的标准工作曲线；提取肉制样品中的蛋白质，经还原及烷基化、酶解、除盐后，得到待测液，使用液相色谱串联质谱检测，根据标准工作曲线，得到肉制样品中大豆蛋白的含量。
24.本发明所述提取肉制样品中的蛋白质用提取液进行提取，所述提取液优选包括如下浓度的组分：0.05mol/ltris-hcl，7mol/l尿素，2mol/l硫脲；所述提取液的ph值优选为8.0。所述蛋白质提取步骤优选包括：将肉制样品与所述提取液混合，于4℃条件下12000r/min离心20min；所述肉制样品与所述提取液的质量体积比优选为2:20g/ml；所述肉制品在进行检测前优选经过打样器处理，使肉制品完全均匀搅碎。离心后所得上清液为样品蛋白提取液。
25.本发明将所述样品蛋白提取液进行还原。所述还原的试剂优选为浓度0.05mol/l的二硫苏糖醇溶液；所述还原优选包括将所述离心后的上清液与二硫苏糖醇溶液于60℃条件下反应45min，得到混合液；所述上清液与二硫苏糖醇溶液的体积比优选为200:30。本发明所述还原步骤的目的是还原蛋白质多肽链之间的二硫键，打开蛋白质的三维结构，裸露酶切位点，便于后续酶解反应。
26.本发明将还原后的样品蛋白提取液进行烷基化。所述烷基化的试剂优选为浓度0.1mol/l的碘乙酰胺溶液。所述烷基化反应优选包括：将所述还原后的样品蛋白提取液与所述碘乙酰胺溶液混合，暗处反应30min；所述二硫苏糖醇溶液与所述碘乙酰胺溶液的体积比优选为2:2。本发明所述烷基化步骤的目的是使打开的二硫键基团发生乙酰化反应，避免二硫键再次形成。
27.本发明将烷基化的样品蛋白提取液进行酶解。所述酶解的酶优选为胰蛋白酶，温度优选为37℃，ph值优选为8.0，酶解反应优选过夜。本发明所述酶解的目的是为了使蛋白按照一定的规律进行断裂，成为短链多肽。
28.本发明所述除盐优选采用固相萃取柱除盐；所述除盐步骤优选包括：将所述酶解得到的酶解液经hlb固相萃取柱洗脱，过滤，即得到所述待测液；所述洗脱优选包括：依次用体积百分含量为0.1％的三氟乙酸、体积百分含量为0.5％的乙酸和乙腈乙酸混合液进行洗脱；所述乙腈乙酸混合液中乙腈的体积百分含量优选为60％，乙酸的体积百分含量优选为0.5％。
29.本发明所述液相色谱的条件优选为：色谱柱为hypersil gold c
18
，流速为0.2ml/min；柱温40℃，进样量20μl；流动相中a相为体积百分含量为0.1％的fa/h2o，b相为体积百分含量为0.1％的fa/acn；所述液相色谱的色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％b；0.2～16min，10％～40％b；16～17min，40％～80％b；17.5～18.5min，80％～3％b；fa为阿魏酸，acn为乙腈。
30.本发明所述质谱的条件优选为：喷雾电压3500v；鞘气38arb；辅气15arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；传输线温度275℃；离子源温度380℃；采集周期为0.3s；碰撞气为1.5mtorr；q1和q3分辨率均为0.7。
31.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
32.实施例1
33.样品前处理
34.1、称取肉制品样品2g，加入20ml提取液(tris-hcl 0.05mol/l，尿素7mol/l，硫脲2mol/l，ph 8.0)，冰水浴均质，于4℃、12000r/min离心20min；
35.2、吸取200μl上清，加入30μl 0.05mol/l dtt溶液(二硫苏糖醇溶液)，60℃下振荡反应45min；
36.3、取出并恢复室温，加入30μl 0.1mol/l iaa溶液(碘乙酰胺溶液)，暗处反应30min；
37.4、取出并恢复室温，先加入1.5ml缓冲溶液(25mm tris-hcl，ph＝8.0)，再加入30μl2.0 mg/ml胰蛋白酶溶液置于37℃反应过夜，取出放置室温，用0.5％三氟乙酸调节ph《2以终止反应；
38.5、依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％三氟乙酸活化hlb固相萃取柱，上样，依次用0.1％三氟乙酸、0.5％乙酸洗脱，最后用2ml 60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，过0.22μm滤膜，得到待测液。
39.实施例2
40.标准曲线的制备
41.1、称取大豆分离蛋白0.1g，加入20ml提取液(tris-hcl 0.05mol/l，尿素7mol/l，硫脲2mol/l，ph 8.0)，涡旋，超声30min，12000r/min离心20min，分别取上清液10μl、20μl、50μl、100μl、200μl至5个离心管，后续处理步骤同实施例1，即得含不同浓度梯度大豆多肽样品标准品工作溶液。
42.2、液相色谱串联质谱的检测条件
43.色谱条件：色谱柱hypersil gold c
18
，规格2.1mm
×
100mm，1.9μm；流速0.2ml/min；柱温40℃，进样量20μl；流动相：a相0.1％fa/h2o，b相0.1％fa/acn，色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％b；0.2～16min，10％～40％b；16～17min，40％～80％b；17.5～18.5min，80％～3％b；
44.质谱条件：喷雾电压3500v；鞘气38arb；辅气15arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；传输线温度275℃；离子源温度380℃；采集周期为0.3s；碰撞气为1.5mtorr；q1和q3分辨率均为0.7，正模式。
45.3、标准工作曲线数据分析：
46.根据标准曲线制备方法以及前处理过程，标准曲线的浓度，用estd方法评估校准曲线的线性，具体结果如表1所示。
47.表1三种大豆特异性定量多肽5点校准曲线的线性回归方程
[0048][0049]
注：y为大豆定量多肽的峰面积，x为大豆分离蛋白质量浓度。
[0050]
由表1可知，三种大豆特异性定量多肽线性回归方程5点校准曲线的r2均大于
0.99，说明线性回归方程线性良好。
[0051]
实施例3
[0052]
按照肉丸的生产工艺，制备含有特定大豆蛋白含量的模拟样品，其中大豆蛋白的含量为3.8g/100g。
[0053]
按照实施例1步骤对肉丸进行预处理，得到肉丸待测液。按照实施例2液相色谱串联质谱方法对待测液检测，进行定性和定量分析。
[0054]
1、定性分析
[0055]
选择大豆的3条特异多肽(spqlqnlr、nileasydtk或eqqqeqqqeeqplevr)，1个母离子，3个子离子，在相同实验条件下，肉丸样品中待测多肽与标准样品保留时间比相对偏差在
±
2.5％；多肽的3个子离子的保留时间一致，则可判定为存在大豆蛋白。肉丸样品的大豆蛋白的mrm质谱图如图1所示，总离子流图如图2所示。
[0056]
由图1和图2可知，每条多肽所筛选的3个子离子碎片均有较强的相应强度，并且保留时间在
±
2.5％范围内，与纯大豆分离蛋白所测定的色谱图的保留时间完全一致，由此认定样品中含有大豆蛋白。
[0057]
2、定量分析
[0058]
采用液相色谱串联质谱检测肉丸待测液，将得到的特征多肽的峰面积代入标准曲线的线性回归方程(表2)中，计算得到样品中的大豆蛋白的质量浓度c，根据公式：
[0059]
x＝(c
×v×
f)/(m
×
1000)
×
100％
[0060]
其中，c-由标准曲线得到的多肽样品对应的大豆分离蛋白质量浓度，mg/ml；
[0061]
v-待测样品溶液的上机体积，ml；本实施例中为2ml；
[0062]
f-样品稀释倍数；本实施例中为(20ml
×
1000μl/ml)/(200μl)；
[0063]
m-待测肉制品的称样量，g；本实施例中为0.1g；
[0064]
计算得到待测肉丸中大豆蛋白的含量x，g/100g，结果如表2所示。
[0065]
表2肉丸中大豆蛋白含量
[0066][0067]
由表2可知，采用本发明检测方法的回收率为87.52％～94.19％，可见，本发明检测方法准确度高。
[0068]
对比例1
[0069]
将大豆特异性定量多肽替换为alvqvvncnger，氨基酸序列为丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-精氨酸(如seq id no.4所示)，来源蛋白为glycinin g2，分子量为1300.6552，质谱中带2个电荷，母离子为679.8。
[0070]
采用实施例1-3相同的方法，得到alvqvvncnger的回归方程，将模拟肉丸样品(与实施例3肉丸相同)采用实施例1的处理方式，按照实施例2液相色谱串联质谱方法对待测液检测，根据alvqvvncnger的回归方程，得到实施例3模拟肉丸样品的大豆蛋白含量。
[0071]
模拟肉丸样品的大豆蛋白含量为1.86g/100g，回收率为48.91％，测定样品的结果为0.114g/100g，整体测定的结果偏低。可见，本发明三种大豆特异性定量多肽相对于alvqvvncnger，用于检测肉制品大豆蛋白具有特异性，且具有更高的准确度。
[0072]
实施例4
[0073]
现有技术cn106248751a公开了一种检测鸡肉中大豆蛋白的方法，采用电子鼻的方式，通过对添加不同比例的大豆蛋白的鸡肉糜进行建模，从而测定鸡肉中大豆蛋白的比例。
[0074]
cn106248751a与本发明有本质上的区别，首先本发明是准确的测定肉制品中大豆蛋白真实含量，是一种在定性基础之上进行含量测定的技术，而非仅仅测定其中的比例。其次，本发明利用大豆蛋白的特异性多肽对肉制品大豆蛋白含量进行检测，其不受其他基质的影响。而cn106248751a基于模型的基础之上进行测定，并不具有特异性，其结果的准确性与模型数量大小以及模型样品的代表性紧密相关，并且其采用的模型是鸡肉糜与大豆蛋白的混合，与肉制品相比，基质简单，并不适用于复杂肉制品的测定。
[0075]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用，其特征在于，所述大豆特异性定量多肽包括spqlqnlr、nileasydtk或eqqqeqqqeeqplevr中的一种。2.一种肉制品大豆蛋白含量的检测方法，其特征在于，包括：配置不同浓度的大豆蛋白标准溶液，使用液相色谱串联质谱检测，绘制权利要求1所述大豆特异性定量多肽的标准工作曲线；提取肉制样品中的蛋白质，经还原及烷基化、酶解、除盐后，得到待测液，使用液相色谱串联质谱检测，根据标准工作曲线，得到肉制样品中大豆蛋白的含量；所述大豆特异性定量多肽包括spqlqnlr、nileasydtk或eqqqeqqqeeqplevr中的一种。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述提取肉制样品中的蛋白质用提取液进行提取，所述提取液包括如下浓度的组分：0.05mol/ltris-hcl、7mol/l尿素和2mol/l硫脲；所述提取液的ph值为8.0。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述还原的试剂为浓度0.05mol/l的二硫苏糖醇溶液；所述烷基化的试剂为浓度0.1mol/l的碘乙酰胺溶液。5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述酶解的酶为胰蛋白酶，温度为37℃，ph值为8.0。6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述除盐采用固相萃取柱除盐。7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的条件为：色谱柱为hypersilgoldc
18
，流速为0.2ml/min；柱温40℃，进样量20μl；流动相中a相为体积百分含量为0.1％的fa/h2o，b相为体积百分含量为0.1％的fa/acn；所述液相色谱的色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％b；0.2～16min，10％～40％b；16～17min，40％～80％b；17.5～18.5min，80％～3％b。8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述质谱的条件为：喷雾电压为3500v；鞘气为38arb；辅气为15arb；离子传输管温度为275℃；离子源雾化温度为380℃；传输线温度为275℃；离子源温度为380℃；采集周期为0.3s；碰撞气为1.5mtorr；q1分辨率为0.7，q3分辨率为0.7。

技术总结
本发明提供了大豆特异性定量多肽在检测肉制品大豆蛋白含量中的应用，涉及食品检测技术领域。本发明提供了大豆特异性定量多肽，包括SPQLQNLR、NILEASYDTK或EQQQEQQQEEQPLEVR中的一种，并且利用所述大豆特异性定量多肽用于检测肉制品大豆蛋白含量。实验结果表明，本发明利用大豆特异性定量多肽检测肉制品中的大豆蛋白，回收率达到87.52％～94.19％，而采用ALVQVVNCNGER多肽，回收率仅为48.91％，可见，采用本发明大豆特异性定量多肽检测肉制品中大豆蛋白含量的方法，具有特异性强、准确率高的优势，为顺应市场需求、规范行业标识、维护市场公平提供强有力的技术支持。场公平提供强有力的技术支持。场公平提供强有力的技术支持。


技术研发人员：王守伟 张颖颖 李莹莹 张明悦 康超娣 赵文涛 郭文萍
受保护的技术使用者：中国肉类食品综合研究中心
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/10/20