一种山羊20号染色体上与繁殖性状相关的SNP分子标记及应用

一种山羊20号染色体上与繁殖性状相关的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种山羊20号染色体上与繁殖性状相关的snp分子标记及应用。


背景技术：

2.山羊作为我国古代最早驯化的家畜之一，为人们的生活提供了肉、奶、毛等多种畜产品。我国是羊肉消费大国，羊肉消费量也呈逐年上升的态势。鉴于我国人口众多，对羊肉的需求量极大，进行肉羊遗传改良，提高肉羊产业技术水平是目前育种工作刻不容缓的重大任务。
3.湖北黑头羊是湖北省农业科学院畜牧兽医研究所历经十余年育种，以波尔山羊为父本、麻城黑山羊为母本，进行横交固定及多世代群体继代选育而形成的黑头白身肉用型山羊新品种。具有体型大、繁殖速度快、肉质鲜美，膻味轻等特性。繁殖决定养殖效益的决定性性状之一，在羊这类少胎动物中，母羊繁殖效益在总效益中占比更大。但是，繁殖性状遗传力低、周期长、选育进展慢、且与繁殖性状之间的复杂关系是制约肉羊产业经济效益的主要因素。因此，借助现代选择育种技术，通过将具有显著效应的分子标记加入到分子标记辅助选择(marker associated selection,mas)、基因组选择(genomic selection,gs)中，能显著提高山羊繁殖性状的遗传改良进展，进而提高后代山羊产产羔数，有助于我国山羊产业的高效发展。
4.山羊繁殖性状是由多基因控制的复杂性状，采用常规的遗传手段难以精确的鉴定其主效基因，而基于snp芯片或测序的全基因组关联分析(genome-wide association studies,gwas)为筛选出与目的性状有显著相关性的分子标记提供了有效方法。尽管gwas技术已经取得显著进展，但仍然存在一些挑战，例如数据标准化质量不高，大群体测序时成本高等问题，都需要在gwas研究中得到解决。在现代畜牧育种中，由于畜禽群体一般较大，如使用高深度测序进行碱基信息获取的话会产生较高的成本，从而降低经济效益，而低深度测序数据质量有待考察。因此，为了满足大群体测序的要求，为gwas分析提供低成本、高质量的snp位点信息是提高snp筛选效率的重要因素。
5.目前已经报道的与山羊繁殖性状相关的snp位点包括山羊bmp6基因的编码区序列的第951bp(以编码区序列的第一位碱基为+1位计算)处的t》c突变，以及山羊26号染色体的第36491960位碱基，位于rbp4基因的5’调控区，碱基为g》c突变。筛选新的与山羊繁殖性状相关的snp位点，为山羊的分子标记辅助选择提供了新分子标记资源，加快种羊育种改良的进程。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于筛选出一种与山羊繁殖性状相关联的分子标记，利用该分子标记在山羊繁殖性状检测或山羊育种中的应用。
7.本发明的技术方案如下：
8.本发明的目的在于，提供一种与山羊繁殖性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记为山羊参考基因组(caprahircusars1.2)20号染色体上第49792220个核苷酸位点，该位点的碱基是t或c。该snp位点上下游50bp的核苷酸序列如下所示(seq id no:1)：
9.gattcatgatctccaaagatttagcttcgggaccatggaccagcct tgatn(t/c)actcaagagcttttgtgttgcagagttttattaaagtatga aaagggaca。
10.上述序列的第51位碱基处的n为一个t51-c51的等位基因突变，该突变使seq id no:1序列产生了核苷酸多态性。该分子标记可以作为检测与山羊繁殖性状相关的分子标记，且当seq id no:1所示序列上的第51位核苷酸为t时，有利于山羊拥有较高的平均经产产羔数。
11.本发明的山羊品种优选为黑头羊。
12.本发明的另一个目的在于，提供一种检测上述snp分子标记的物质，包括扩增所述snp分子标记在内的基因组dna片段的pcr引物或含有所述引物的试剂盒。本领域技术人员可根据引物设计原则设计可扩增seq id no:1所示序列的引物，以检测本发明与山羊繁殖性状相关的snp标记基因型，从而预测山羊繁殖性状，尤其是平均经产产羔数。
13.本发明的上述snp分子标记或物质能够用于在山羊繁殖性状检测或山羊育种中的应用。所述山羊繁殖性状为山羊平均经产产羔数。
14.本发明还提供了上述山羊snp位点的单核苷酸多态性或用于检测山羊snp位点单核苷酸多态性的物质在检测或辅助检测繁殖性状或山羊育种中的应用，所述山羊snp位点位于山羊参考基因组20号染色体上第49792220个核苷酸位点，该位点的碱基是t或c。
15.本发明的另一个目的在于，提供一种检测山羊繁殖性状的方法，检测山羊的上述seq id no:1序列中，n标记的单核苷酸是t还是c。所述山羊繁殖性状为山羊平均经产产羔数。tt型的山羊经产产羔数优于cc型山羊。
16.作为一种实施方式，利用扩增seq id no:1所示序列的引物对待测山羊的材料进行基因分型。优选的，用上述试剂或试剂盒进行检测。
17.本发明的另一个目的在于，还提供了一种筛选上述snp分子标记的方法，包括以下步骤：
18.①
提取山羊基因组dna，进行全基因组低深度和高深度重测序，得到原始测序数据；
19.②
对原始测序数据质控，比对到山羊参考基因组，采用sentieon+beagle策略对样本的所有常染色体进行遗传变异检测和基因型填充，获得高质量snp位点数据；
20.③
通过rmvp软件使用farmcpu模型将snp位点与山羊平均经产产羔数进行gwas分析，得到所述山羊繁殖性状相关的snp分子标记。
21.作为一种实施方式，所述低深度为1-2
×
，所述高深度为15-20
×
；优选低深度数量要高于高深度，以较少的高深度测序结果对较多的低深度测序结果进行基因型填充，降低测序成本。
22.本发明的另一个目的在于，提供一种提高山羊繁殖性状的遗传育种方法，确定山羊核心群中种羊的上述snp分子标记，并根据山羊snp分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育挑选snp标记中第51位碱基为tt型和/或ct型的个体，淘汰cc型个体，以逐代提高该
位点基因t的频率，从而提高后代山羊的平均经产产羔数性能。
23.本发明的有益效果：
24.本发明通过低深度重测序与基因型填充结合，并利用gwas分析策略筛选到了影响山羊繁殖性状的显著snp分子标记，将其用于分子标记辅助选择和基因组选择中，选择对提高山羊繁殖性状有利的基因型进行留种，从而逐代提高优势等位基因的基因频率，则能加快种羊育种改良的进程，为山羊养殖带来巨大经济效益。
25.本发明验证了该snp分子标记对山羊平均经产产羔数的影响效应，可将其应用于种羊提高平均经产产羔数的遗传改良中，从而提高后代平均经产产羔数，进而增加养殖企业市场竞争力。
附图说明
26.图1：山羊繁殖性状(平均经产产羔数)的曼哈顿图，黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于山羊第20号染色体上。
具体实施方式
27.本发明的实施例通过对500头东宝黑头羊进行全基因组重测序，其中，466头测序深度为低深度1
×
，34头测序深度为高深度15
×
，目的在于以高深度测序结果(较少)对低深度测序结果(较多)进行基因型填充，以提高低深度测序结果的准确性，达到低成本、提高准确性的目的。然后，将重测序数据比对到山羊参考基因组(基因组版本ars1.2)上，使用sentieon+beagle策略对500个样本的所有常染色体进行遗传变异检测和基因型填充，获得snp位点数据开展山羊平均经产产羔数相关的gwas研究，最终筛选到与山羊平均经产产羔数相关的snp(nc_030827.1：g.49792220t》c)。参阅ensembl，得到该snp位点上下游50bp的核苷酸序列，该片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，其中第51位碱基处的t是等位基因突变后的核苷酸，具体核苷酸序列为：
28.gattcatgatctccaaagatttagcttcgggaccatggaccagcct tgatn(t/c)actcaagagcttttgtgttgcagagttttattaaagtatga aaagggaca，
29.上述序列的第51位碱基处的n为一个t51-c51的等位基因突变，该突变使seq id no:1序列产生了核苷酸多态性。gwas分析结果显示nc_030827.1：g.49792220t》c与山羊繁殖性状(平均经产产羔数)显著相关，基因型为tt或ct的个体的平均经产产羔数显著高于cc个体，说明t是有利于繁殖性状提高的等位基因。该分子标记可以作为检测与山羊繁殖性状相关的分子标记，且当seq id no:1所示序列上的第51位核苷酸为t时，有利于山羊拥有较高的平均经产产羔数，对山羊育种繁育有重要意义。
30.本发明筛选的分子标记可应用于对山羊繁殖性状相关基因的基因型或山羊繁殖性状相关的关联分析中，为山羊繁殖性状的分子标记辅助选择提供了新的分子标记资源。
31.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
32.实施例1
33.全基因组重测序
34.1、血样采集及白细胞分离
35.使用兽用采血针从山羊颈静脉采集5ml血样于edta抗凝管中，将抗凝管置于放有大量冰袋的冰盒中带回实验室，将这些样本储存于4℃的冰箱里，进行白细胞提取，具体步骤如下：
36.(1)取2～3ml血样于10ml ep管内。
37.(2)往ep内加入超纯水使液体总容积为9ml。
38.(3)将ep管缓慢上下颠倒20次，静置10min。
39.(4)将ep管放入离心机内，5000rpm离心10min。
40.(5)缓慢倒出ep管上清液。
41.(6)再次加入超纯水使液体总容积为9ml。
42.(7)重复(3)、(4)、(5)步操作。
43.(8)将分离完成的白细胞进行编号后放入-80℃冰箱。
44.2、基因组dna提取及全基因组重测序
45.使用天漠生物的基因组dna小量提取试剂盒(货号：d3024)进行白细胞的dna提取，具体方法见说明书。将质检合格的基因组dna送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行二次质检并建库，利用华大基因的mgiseq-200平台进行全基因组重测序。34个样本进行高深度全基因组重测序，平均测序深度约为19.72
×
，总数据量大小为1.4t；466个样本进行低深度全基因组重测序，平均测序深度约为1.65
×
，总数据量大小为1.6t。
46.实施例2
47.基因组比对、遗传变异检测及基因型填充
48.1、原始测序数据分析及基因组比对
49.高深度测序数据与低深度测序数据使用同样的流程进行质量控制。
50.(1)使用fastp软件对原始数据进行过滤，过滤标准如下：剔除碱基质量值低于20比例超过30％的reads；n碱基大于5％的reads。经上述步骤质控后获得cleanreads。
51.(2)使用bwa软件将cleanreads比对到山羊参考基因组(capra_hircus.ars1.2)。
52.(3)使用samtools软件对比对后的bam文件进行排序。
53.(4)使用picard标记重复reads。
54.(5)samtools软件构建引索。
55.2、变异位点检测及基因型填充
56.(1)gatkhaploytypecaller按常染色体编号对每个样本分别生成gvcf文件。
57.(2)gatkcombinegvcfs合并单条染色体各样本gvcf文件。
58.(3)gatkgenotypegvcfs按染色体进行群体snpcalling。
59.(4)gatkmergevcfs合并常染色体群体vcf文件。
60.(5)gatkselectvariants筛选群体vcf文件snp。
61.(6)gatkvariantfiltration标记假阳性snp位点。
62.(7)grep命令过滤被标记snp位点
63.(8)plink软件对snp位点进行过滤(geno0.1
‑‑
maf0.05
‑‑
hwe1e-06)。
64.(9)beagle软件对缺失位点进行填充。
65.(10)使用sentieon haplotyper和gvcftyper模块进行群体基因组遗传变异检测和分型。
66.(11)使用beagle进行基因型填充，最终获得26131221个高质量snp。
67.实施例3
68.nc_030827.1：g.49792220t》c分子标记分型方法在山羊繁殖性状关联分析中的应用
69.nc_030827.1：g.49792220t》c分子标记与山羊繁殖性状(平均经产产羔数)关联分析：
70.(1)用于基因型与繁殖性状关联分析的表型由专业技术人员严格按照测量规范进行测量，统计平均经产产羔数，共计408个样本。
71.(2)通过rmvp软件使用farmcpu模型将snp位点与平均经产产羔数进行gwas分析。farmcpu模型使用固定效应模型和随机效应模型进行迭代。固定效应分析模型如下：
72.y＝xb+z
tut
+s
idi
+e
73.式中，y是性状的观测者向量；b是个体固定效应向量，包括snp前三列主成分、出生季节、出生胎次和初生重；u
t
是t个伪数量性状核苷酸基因型矩阵作为固定效应；x和z
t
分别是b和u
t
的关联矩阵；si是第i个snp标记，di是相应的效应值；e是随即残差效应向量，符合正态分布e～n(0,iσ
e2
)。
74.gwas分析结果显示nc_030827.1：g.49792220t》c与山羊繁殖性状(平均经产产羔数)显著相关，该标记不同基因型对山羊繁殖性状的影响见表1，群体内三种基因型个体的平均经产产羔数差异分析见表2。
75.表1nc_030827.1：g.49792220t》c不同基因型对山羊繁殖性状的影响
[0076][0077]
注：当标记的p值《0.05/26131221≈1.91e-09(bonferroni校正)时为显著标记。
[0078]
表2nc_030827.1：g.49792220t》c不同基因型山羊的平均经产产羔数差异分析
[0079][0080][0081]
注：*p《0.05，***p《0.001。
[0082]
由表1和2可知，对于山羊平均经产产羔数性状，基因型为tt或ct的个体的平均经产产羔数显著高于cc个体，说明t是有利于繁殖性状提高的等位基因。
[0083]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种与山羊繁殖性状相关的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示，该序列中的n为t或c的等位基因突变。2.一种检测权利要求1所述snp分子标记的物质，其特征在于，包括扩增所述snp分子标记在内的基因组dna片段的pcr引物或含有所述引物的试剂盒。3.权利要求1所述snp分子标记或权利要求2所述物质在山羊繁殖性状检测或山羊育种中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其特征在于，所述山羊繁殖性状为平均经产产羔数。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述山羊为黑头羊。6.一种检测山羊繁殖性状的方法，其特征在于，检测山羊的seq id no:1所示序列中，n标记的单核苷酸是t还是c。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用扩增序列seq id no:1的引物对待测山羊的材料进行基因分型，tt型的山羊经产产羔数优于cc型山羊。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，用权利要求2所述的物质进行检测。9.山羊snp位点的单核苷酸多态性或用于检测山羊snp位点单核苷酸多态性的物质在检测或辅助检测繁殖性状或山羊育种中的应用，其特征在于，所述山羊snp位点位于山羊参考基因组20号染色体上第49792220个核苷酸位点，该位点的碱基是t或c。10.一种提高山羊繁殖性状的遗传育种方法，其特征在于，确定山羊核心群中种羊的权利要求1中所述的snp分子标记，并根据山羊snp分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育挑选snp标记中第51位碱基为tt型和/或ct型的个体，淘汰cc型个体，以逐代提高该位点基因t的频率，从而提高后代山羊的平均经产产羔数性能。

技术总结
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种山羊20号染色体上与繁殖性状相关的SNP分子标记及应用。所述的山羊SNP分子标记位点如SEQ ID NO.1所示，位于该序列片段的第51位碱基位点处存在一个T/C的碱基突变。本发明通过优选该SNP分子标记的优势等位基因型，能够提高山羊后代平均经产产羔数，加快山羊遗传改良进展从而有效提高山羊育种的经济效益。从而有效提高山羊育种的经济效益。从而有效提高山羊育种的经济效益。


技术研发人员：陶虎 熊琪 邓钊 陈明新 张年 张凤 上官爱哨 李晓锋 索效军 杨前平 杨娟 赵华 帅艺
受保护的技术使用者：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.09.04
技术公布日：2023/10/20