一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法与流程

1.本发明涉及肌醇发酵技术领域，更具体地说是涉及一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法。


背景技术：

2.肌醇也称为环己烷醇，是葡糖醛酸的直接前体。肌醇具有与葡萄糖相同的化学式，但具有六碳环。肌醇广泛分布于哺乳动物细胞，高等植物，真菌和一些细菌中作为必需的生长因子。肌醇及其衍生物的代谢已被广泛研究。据报道，肌醇可有效治疗糖尿病，抑郁症，恐慌症，阿尔茨海默病等。
3.目前肌醇的生产方法包括水解法、化学合成法、体外酶转化法及生物合成法。最早出现生产肌醇的方法是加压水解法，先将原料进行酸浸，之后进行中和过滤、洗濯，然后得到肌醇粗品，将肌醇粗品进行褪色处理等一系列步骤，最后得到肌醇精品。但是加压水解法存在很多的缺点，例如设备材质、操作压、粗品精制等等，在成本以及工艺上存在很大劣势，并且对水源污染严重等。
4.对于化学合成法产肌醇，其原料通常都是天然肌醇或非肌醇化合物，主要是通过化学反应来改变其原料的构象与组成。郭会灿等人也有介绍以葡萄糖为原料仿生合成肌醇，虽说整个工艺都是在在常压下进行，但是葡萄糖与肌醇的转化率仅在60%左右，而且最主要的问题是此法不仅在合成工艺上复杂繁琐，所带来的生产成本也会很高，同时所使用的化学试剂对环境来说也是一大灾难，其所带来的价值无法填补造成环境污染的代价。
5.一种由蔗糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖化酶、肌醇1-磷酸合酶和肌醇单磷酸酶构成的热循环级联反应系统可将蔗糖转化为肌醇和果糖，产率为0.98 mol /mol。葡萄糖作为底物合成肌醇在很早之前就有报道。通过体外酶催化法从木糖、纤维素出发均能合成肌醇。体外酶催化法合成肌醇的生产效价和产率均较高，但存在酶不稳定、分离过程复杂等问题。
6.因此，如何提供一种以重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，提高了肌醇的产量和收率。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
9.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，通过建立菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵，过程包括：
10.1）将重组大肠杆菌的种子液接种到发酵罐培养基中，在菌浓度2
×
109~1.2
×
10
10
cfu/ml时，通过调节转速及罐压控制溶氧8-15%。
11.2）发酵30~70h，且菌浓度为1.2
×
10
10
~2
×
10
11
cfu/ml时，控制溶氧为10~25%，开启电导补料反馈调控发酵机制控制流加补料速率，此时，调节流加补料速率为1.92~3.20g/l/
h。
12.3）当菌浓度为2
×
10
11
cfu/ml~3.2
×
10
11
cfu/ml时，控制溶氧为5~14%，补料速率调至2.16~1.6g/l/h，发酵110~120h后，肌醇浓度达到120~140g/l，结束发酵，得到发酵液。
13.优选地，重组大肠杆菌的种子液培养过程包括：
14.将重组大肠杆菌按1%的接种量接种在一级种子培养基中，37℃摇瓶培养，转速为200 rpm/min，生长10-12h，od
600
为3~4时，按1%的接种量接入二级种子液培养基中，控制反应温度30℃，转速为200 rpm/min进行菌种培养。
15.优选地，一级种子培养基的组成为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。
16.优选地，所述二级种子液培养基的组成为：葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l，水定容至1l。
17.优选地，所述重组大肠杆菌的种子液接种到发酵罐培养基中为：二级种子液中的菌种生长至od
600
6~7，接入发酵罐中，接种量为10%，接种后，温度控制在30℃，用17%氨水调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.03-0.035mpa，转速为150rpm/min，发酵至od
600
15~20，一次性无菌加入1
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0.4mol/l iptg进行诱导。
18.优选地，所述发酵罐培养基的制备方法如下。
19.①
称取、灭菌：磷酸氢二铵4g/l、磷酸二氢钾6g/l、氯化钠0.5g/l、玉米浆3g/l和水9l混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min。
20.②
冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃。
21.③
微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
22.优选地，所述补料为添加葡萄糖和甘油的混合物，其中。葡萄糖浓度为400g/l，甘油浓度为200g/l。
23.优选地，若发酵过程中起沫严重，加入聚醚类消泡剂防止喷罐。
24.经由上述技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，基于菌菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵机制，利用重组大肠杆菌发酵生产肌醇；发酵过程中细胞初期的生长主要由培养基中的酵母提取物来提供，初始培养基中的酵母提取物能使菌体在接种后快速生长，这样在补料开始时，菌体就能以一定的细胞密度快速消耗甘油并转化葡萄糖为肌醇。溶氧反映细胞生长状况，发酵前期菌体量少，转速偏大，溶氧下降缓慢，无法观察到菌体生长情况。发酵后期，细胞耗氧加快，较低转速难以维持细胞生长所需的溶氧。建立菌浓与溶氧联控，通过对溶氧的调控使各时期菌体更多偏向产肌醇方向；根据电导趋势的变化，能够快速调节补料的速率，减少发酵液中乙酸的产生以及累积，降低乙酸对大肠杆菌产酶的影响以及提高肌醇的碳收率，最终基础含量达130g/l以上，碳收率大于等于0.7g/g。
具体实施方式
25.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
26.实施例1。
27.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下。
28.(1)30ml一级摇瓶种子制备。
29.配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨0.3g、酵母粉0.15g、氯化钠0.3g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，ph7.0，121℃，灭菌30min。按1％接种量接种重组大肠杆菌，37℃，200rpm，摇床培养10h，得到一级种子液。
30.(2)1l二级摇瓶种子制备。
31.用吸光光度计测定一级种子液的od
600 3时，按1％接种量转接至装有二级培养基(葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l）1l二级摇瓶中控制反应温度30℃，转速为200rpm/min进行菌种培养。
32.(3)上罐前空消准备。
33.在上罐前期，需要仔细清洗发酵罐及其相连管道，必要时可配置一定浓度的氢氧化钠溶液浸泡。清洗完成后，将发酵罐与补料瓶、补碱瓶等连同管路一起空灭。121℃，灭菌30min；冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至室温。
34.(4)15l发酵罐培养。
35.15l发酵罐(使用量为10l)分别称量：磷酸氢二铵40g、磷酸二氢钾60g、氯化钠5g、玉米浆30g用水溶解后加入发酵罐中体积9l，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃。微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
36.(5)二级种子罐菌种生长12h，od
600
=6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为10％，接种后，温度控制在30℃，用氨水(17％)调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.03mpa，转速为150rpm/min。
37.(6)建立菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵机制。
38.发酵初始，菌体进入迟缓期生长缓慢，菌浓度2
×
109cfu/ml时，可通过调节转速及罐压控制溶氧8%，经过30h发酵，菌体进入对数生长期并带动肌醇快速产出，在菌浓度1.2
×
10
10
cfu/ml，控制溶氧在10%，此时电导降低与肌醇含量增长成正比例，肌醇含量每增长1g/l，电导降低约1ms/cm，开始开启电导补料反馈调控发酵机制控制流加补料速率，据电导降低速率调节流加补料速率1.92g/l/h；发酵26h，od
600
17.5，一次性无菌加入灭菌的10ml浓度0.4mol/l的iptg进行诱导。发酵过程中后期，大肠杆菌对数生长期后的稳定期，菌浓度在2.0
×
10
11
cfu/ml后增加缓慢，控制溶氧5%，电导降低速率减缓所以降低补料速率调至1.6 g/l/h；发酵110h，肌醇浓度达到131.61g/l，结束发酵得发酵液，计算碳收率0.72g/g。
39.补料为：葡萄糖1200g和甘油600g用纯水定容至3l，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
40.实施例2。
41.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下。
42.(1)30ml一级摇瓶种子制备。
43.配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨0.3g、酵母粉0.15g、氯化钠
0.3g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，ph7.0，121℃，灭菌30min。按1%接种量接种重组大肠杆菌，37℃，200rpm，摇床培养11h，得到一级种子液。
44.(2)1l二级摇瓶种子制备。
45.用吸光光度计测定一级种子液的od
600
3.5时，按1%接种量转接至装有二级培养基(葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l）1l二级摇瓶中控制反应温度30℃，转速为200rpm/min进行菌种培养。
46.(3)上罐前空消准备。
47.在上罐前期，需要仔细清洗发酵罐及其相连管道，必要时可配置一定浓度的氢氧化钠溶液浸泡。清洗完成后，将发酵罐与补料瓶、补碱瓶等连同管路一起空灭。121℃，灭菌30min；冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至室温。
48.(4)15l发酵罐培养。
49.15l发酵罐(使用量为10l)分别称量：磷酸氢二铵40g、磷酸二氢钾60g、氯化钠5g、玉米浆30g用水溶解后加入发酵罐中体积9l，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃。微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
50.(5)二级种子罐菌种生长12h，od
600
=6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为10%，接种后，温度控制在30℃，用氨水(17%)调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.03-0.035mpa，转速为150rpm/min。
51.(6)建立菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵机制。
52.发酵初始，菌体进入迟缓期生长缓慢，菌浓度1.0
×
10
10
cfu/ml时，可通过调节转速及罐压控制溶氧10%，经过35h发酵，菌体进入对数生长期并带动肌醇快速产出，在菌浓度3.0
×
10
10
cfu/ml，控制溶氧在12%，此时电导降低与肌醇含量增长成正比例，肌醇含量每增长1g/l，电导降低约1ms/cm，开始开启电导补料反馈调控发酵机制控制流加补料速率，根据电导降低速率调节流加补料速率2.56g/l/h。发酵30h，od
600
19.95，一次性无菌加入灭菌的10ml浓度0.4mol/l的iptg进行诱导；发酵过程中后期，大肠杆菌对数生长期后的稳定期，菌浓度在2.5
×
10
11
cfu/ml后增加缓慢，控制溶氧12%，电导降低速率减缓所以降低补料速率调至2.06g/l/h；发酵117h，肌醇浓度达到139g/l，结束发酵得发酵液。计算碳收率0.80g/g。
53.补料为：葡萄糖1200g和甘油600g用纯水定容至3l，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
54.实施例3。
55.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下。
56.(1)30ml一级摇瓶种子制备。
57.配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨0.3g、酵母粉0.15g、氯化钠0.3g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，ph7.0，121℃，灭菌30min。按1%接种量接种重组大肠杆菌，37℃，200rpm，摇床培养10.5h，得到一级种子液。
58.(2)1l二级摇瓶种子制备。
59.用吸光光度计测定一级种子液的od
600
4.1时，按1%接种量转接至装有二级培养基(葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/
l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l）1l二级摇瓶中控制反应温度30℃，转速为200rpm/min进行菌种培养。
60.(3)上罐前空消准备。
61.在上罐前期，需要仔细清洗发酵罐及其相连管道，必要时可配置一定浓度的氢氧化钠溶液浸泡。清洗完成后，将发酵罐与补料瓶、补碱瓶等连同管路一起空灭。121℃，灭菌30min；冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至室温。
62.(4)15l发酵罐培养。
63.15l发酵罐(使用量为10l)分别称量：磷酸氢二铵40g、磷酸二氢钾60g、氯化钠5g、玉米浆30g用水溶解后加入发酵罐中体积9l，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃。微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
64.(5)二级种子罐菌种生长12h，od
600
=6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为10%，接种后，温度控制在30℃，用氨水(17％)调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.03mpa，转速为150rpm/min。
65.(6)建立菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵机制。
66.发酵初始，菌体进入迟缓期生长缓慢，菌浓度1.2
×
10
10
cfu/ml时，可通过调节转速及罐压控制溶氧15%，经过70h发酵，菌体进入对数生长期并带动肌醇快速产出，在菌浓度2.0
×
10
11
cfu/ml，控制溶氧在25%，此时电导降低与肌醇含量增长成正比例，肌醇含量每增长1g/l，电导降低约1ms/cm，开始开启电导补料反馈调控发酵机制控制流加补料速率，根据电导降低速率调节流加补料速率3.2g/l/h。发酵15h，od
600
18.1，一次性无菌加入灭菌的10ml浓度0.4mol/l的iptg进行诱导；发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期，菌浓度在3.2
×
10
11
cfu/ml后增加缓慢，控制溶氧14%，电导降低速率减缓所以降低补料速率调至2.16g/l/h；发酵120h，肌醇浓度达到136.3g/l，结束发酵得发酵液。计算碳收率0.77g/g。
67.补料为：葡萄糖1200g和甘油600g用纯水定容至3l，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
68.对比例1（没有建立菌浓与溶氧联控机制）。
69.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下。
70.(1)30ml一级摇瓶种子制备。
71.配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨0.3g、酵母粉0.15g、氯化钠0.3g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，ph7.0，121℃，灭菌30min。按1%接种量接种重组大肠杆菌，37℃，200rpm，摇床培养12h，得到一级种子液。
72.(2)1l二级摇瓶种子制备。
73.用吸光光度计测定一级种子液的od
600
3.8时，按1%接种量转接至装有二级培养基(葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l）1l二级摇瓶中控制反应温度30℃，转速为200rpm/min进行菌种培养。
74.(3)上罐前空消准备。
75.在上罐前期，需要仔细清洗发酵罐及其相连管道，必要时可配置一定浓度的氢氧化钠溶液浸泡。清洗完成后，将发酵罐与补料瓶、补碱瓶等连同管路一起空灭。115-121℃，
灭菌20-30min；冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至室温。
76.(4)15l发酵罐培养。
77.15l发酵罐(使用量为10l)分别称量：磷酸氢二铵40g、磷酸二氢钾60g、氯化钠5g、玉米浆30g用水溶解后加入发酵罐中体积9l，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃。微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
78.(5)二级种子罐菌种生长12h，od600=6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为10%，接种后，温度控制在30℃，用氨水(17％)调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.035mpa，转速为150rpm/min。
79.(6)建立电导补料反馈调控发酵机制。
80.发酵过程中溶氧控制在5%，经过70h发酵，菌体进入对数生长期并带动肌醇快速产出，此时电导降低与肌醇含量增长成正比例，肌醇含量每增长1g/l，电导降低约1ms/cm，开始开启电导补料反馈调控发酵机制控制流加补料速率，根据电导降低速率调节流加补料速率3.2g/l/h。发酵44h，od
600
19.5，一次性无菌加入灭菌的10ml浓度0.4mol/l的iptg进行诱导；电导降低速率减缓所以降低补料速率调至2.16g/l/h；发酵114h，肌醇浓度达到62.78g/l，结束发酵得发酵液。计算碳收率0.57g/g。
81.补料为：葡萄糖1200g和甘油600g用纯水定容至3l，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
82.对比例2（没有建立菌浓与溶氧联控机制）。
83.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下。
84.(1)30ml一级摇瓶种子制备。
85.配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨0.3g、酵母粉0.15g、氯化钠0.3g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，ph7.0，121℃，灭菌30min。按1%接种量接种重组大肠杆菌，37℃，200rpm，摇床培养11.5h，得到一级种子液。
86.(2)1l二级摇瓶种子制备。
87.用吸光光度计测定一级种子液的od
600
5.3时，按1%接种量转接至装有二级培养基(葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l）1l二级摇瓶中控制反应温度30℃，转速为200rpm/min进行菌种培养。
88.(3)上罐前空消准备。
89.在上罐前期，需要仔细清洗发酵罐及其相连管道，必要时可配置一定浓度的氢氧化钠溶液浸泡。清洗完成后，将发酵罐与补料瓶、补碱瓶等连同管路一起空灭。115-121℃，灭菌20-30min；冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至室温。
90.(4)15l发酵罐培养。
91.15l发酵罐(使用量为10l)分别称量：磷酸氢二铵40g、磷酸二氢钾60g、氯化钠5g、玉米浆30g用水溶解后加入发酵罐中体积9l，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃。微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
92.(5)二级种子罐菌种生长12h，od600=6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量
为10%，接种后，温度控制在30℃，用氨水(17％)调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.035mpa，转速为150rpm/min。
93.(6)建立电导补料反馈调控发酵机制。
94.发酵过程中溶氧控制在20%，经过63h发酵，菌体进入对数生长期并带动肌醇快速产出，此时电导降低与肌醇含量增长成正比例，肌醇含量每增长1g/l，电导降低约1ms/cm，开始开启电导补料反馈调控发酵机制控制流加补料速率，根据电导降低速率调节流加补料速率1.92g/l/h。发酵49h，od
600
18.2，一次性无菌加入灭菌的10ml浓度0.4mol/l的iptg进行诱导；电导降低速率减缓所以降低补料速率调至1.6g/l/h；发酵112h，肌醇浓度达到74.91g/l，结束发酵得发酵液。计算碳收率0.44g/g。
95.补料为：葡萄糖1200g和甘油600g用纯水定容至3l，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
96.对比例3（没有建立电导补料反馈调控发酵机制）。
97.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下。
98.(1)30ml一级摇瓶种子制备。
99.配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨0.3g、酵母粉0.15g、氯化钠0.3g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，ph7.0，121℃，灭菌30min。按1%接种量接种重组大肠杆菌，37℃，200rpm，摇床培养10h，得到一级种子液。
100.(2)1l二级摇瓶种子制备。
101.用吸光光度计测定一级种子液的od
600
4.2时，按1%接种量转接至装有二级培养基(葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l）1l二级摇瓶中控制反应温度30℃，转速为200rpm/min进行菌种培养。
102.(3)上罐前空消准备。
103.在上罐前期，需要仔细清洗发酵罐及其相连管道，必要时可配置一定浓度的氢氧化钠溶液浸泡。清洗完成后，将发酵罐与补料瓶、补碱瓶等连同管路一起空灭。115-121℃，灭菌20-30min；冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至室温。
104.(4)15l发酵罐培养。
105.15l发酵罐(使用量为10l)分别称量：磷酸氢二铵40g、磷酸二氢钾60g、氯化钠5g、玉米浆30g用水溶解后加入发酵罐中体积9l，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃。微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
106.(5)二级种子罐菌种生长12h，od600=6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为10%，接种后，温度控制在30℃，用氨水(17%)调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.03-0.035mpa，转速为150rpm/min。
107.(6)建立菌浓与溶氧联控发酵机制。
108.发酵初始，菌体进入迟缓期生长缓慢，菌浓度1.2
×
10
10
cfu/ml时，可通过调节转速及罐压控制溶氧15%，经过70h发酵，菌体进入对数生长期并带动肌醇快速产出，在菌浓度2.0
×
10
11
cfu/ml，控制溶氧在25%，发酵过程中恒速流加补料，补料速率为3.2g/l/h，发酵35h，od
600
18.9，一次性无菌加入灭菌的10ml浓度0.4mol/l的iptg进行诱导；发酵过程中后
期，大肠杆菌对数生长期后的稳定期，菌浓度在3.2
×
10
11
cfu/ml后增加缓慢，控制溶氧14%；发酵111h，肌醇浓度达到60.11/l，结束发酵得发酵液。计算碳收率0.39g/g。
109.补料为：葡萄糖1200g和甘油600g用纯水定容至3l，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
110.综上所述，本发明建立的菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵机制可以显著提高肌醇浓度，提高碳收率，而不以菌浓与溶氧联控或者不以电导补料反馈调控发酵机制时，肌醇浓度大大降低，碳收率下降。
111.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
112.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，通过建立菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵，过程包括：1）将重组大肠杆菌的种子液接种到发酵罐培养基中，在菌浓度2
×
109~1.2
×
10
10
cfu/ml时，通过调节转速及罐压控制溶氧8-15%；2）发酵30~70h，且菌浓度为1.2
×
10
10
~2
×
10
11
cfu/ml时，控制溶氧为10~25%，开启电导补料反馈调控发酵机制控制流加补料速率，此时，调节流加补料速率为1.92~3.20g/l/h；3）当菌浓度为2
×
10
11
cfu/ml~3.2
×
10
11
cfu/ml时，控制溶氧为5~14%，补料速率调至2.16~1.6g/l/h，发酵110~120h后，肌醇浓度达到120~140g/l，结束发酵，得到发酵液。2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，重组大肠杆菌的种子液培养过程包括：将重组大肠杆菌按1%的接种量接种在一级种子培养基中，37℃摇瓶培养，转速为200 rpm/min，生长10-12h，od
600
为3~4时，按1%的接种量接入二级种子液培养基中，控制反应温度30℃，转速为200 rpm/min进行菌种培养。3.根据权利要求2所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，一级种子培养基的组成为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。4.根据权利要求3所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述二级种子液培养基的组成为：葡萄糖10g/l、甘油3g/l、磷酸氢二钠8g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化铵0.2g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.57g/l、氯化钙0.04g/l，水定容至1l。5.根据权利要求4所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌的种子液接种到发酵罐培养基中为：二级种子液中的菌种生长至od
600
6~7，接入发酵罐中，接种量为10%，接种后，温度控制在30℃，用17%氨水调节控制ph7.0，通风比为0.7vvm，发酵罐罐压0.03-0.035mpa，转速为150rpm/min，发酵至od
600
15~20，一次性无菌加入1
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0.4mol/l iptg进行诱导。6.根据权利要求5所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述发酵罐培养基的制备方法如下：
①
称取、灭菌：磷酸氢二钠17g/l、磷酸二氢钾6g/l、氯化铵0.5g/l、氯化钠0.5g/l、酵母粉3g/l和水9l混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
②
冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至30℃；
③
微量元素20ml、浓度为50mg/ml的卡那霉素10ml单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。7.根据权利要求6所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述补料为添加葡萄糖和甘油的混合物，其中，葡萄糖浓度为400g/l，甘油浓度为200g/l。8.根据权利要求1-7任一所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，若发酵过程中起沫严重，加入聚醚类消泡剂防止喷罐。

技术总结
本发明公开了一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，属于肌醇生产技术领域，通过建立菌浓与溶氧联控、电导补料反馈调控发酵，过程包括：将重组大肠杆菌的种子液接种到发酵罐培养基中，在菌浓度2


技术研发人员：赵伟 刘艳美芳 张以晴 刘晓文 方建 张金祥 曹乐梅
受保护的技术使用者：山东福洋生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.09.04
技术公布日：2023/10/20