黑果枸杞LrANT1基因及其编码蛋白的应用

黑果枸杞lrant1基因及其编码蛋白的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种黑果枸杞lrant1基因及其编码蛋白lrant1在提高植物花青素含量中的应用。


背景技术：

2.黑果枸杞作为一种多年生灌木，其成熟果实是藏药重要来源。黑果枸杞中富含花青素，以矮牵牛类花青素为主。在多年生的黑果枸杞成熟果实中，矮牵牛色素类衍生物含量达到了总花青素含量的85％以上。黑果枸杞成熟果实中的花青素，具有明显的清除自由基和抗氧化活性，可以广泛用做食品天然着色剂，具有重大的经济价值。然而，黑果枸杞中花青素的合成转录调控机制仍不清晰。
3.myb是一类庞大的转录因子家族，而r2r3-myb亚家族成员被报道与植物花青素的转录调控直接相关。通过深入分析黑果枸杞的基因组信息，挖掘更多的调控果实花青素积累的r2r3-myb转录因子，利用生物工程的手段可以实现花青素的大量合成。这对黑果枸杞野生资源功能基因的挖掘和开发利用大有益处。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于提供一种黑果枸杞lrant1基因及其编码蛋白在提高植物花青素含量中的应用。
5.实现上述发明目的的技术方案包括如下。
6.本发明的第一方面，提供了一种黑果枸杞lrant1基因在提高植物花青素含量中的应用，所述黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或所述黑果枸杞lrant1基因编码氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白。
7.本发明的第二方面，提供了一种黑果枸杞lrant1蛋白在提高植物花青素含量中的应用，所述黑果枸杞lrant1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
8.本发明的第三方面，提供了一种过表达黑果枸杞lrant1基因的重组表达载体在提高植物花青素含量中的应用。
9.本发明的第四方面，提供了一种转化有上述重组表达载体的重组菌在提高植物花青素含量中的应用。
10.本发明的第五方面，提供了一种过表达黑果枸杞lrant1基因的愈伤组织在提高植物花青素含量中的应用。
11.本发明的第六方面，提供了一种提高黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或黑果枸杞植株花青素含量的生物制剂，所述生物制剂的活性成分包括过表达黑果枸杞lrant1基因的重组表达载体。
12.本发明的第七方面，提供了一种提高黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或黑果枸杞植株花青素含量的方法，所述方法包括：在黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或植株中提高黑果枸杞lrant1基因或黑果枸杞lrant1蛋白的表达。
13.在本发明中，通过克隆黑果枸杞lrant1基因进行功能研究发现，过表达黑果枸杞lrant1基因的转基因愈伤组织中花青素含量显著升高，诱导出的完整植株也表现出花青素积累的特征；经hplc分析，转基因愈伤组织中花青素的主要成分与成熟黑果枸杞果实的主要成分一致，说明在黑果枸杞愈伤组织中就实现了花青素的高效合成；转基因愈伤组织中花青素合成关键结构基因lrchs和lrf3
’5’
h的相对表达量明显上调。上述结果表明黑果枸杞lrant1基因能够显著提高黑果枸杞花青素的含量，从而可用于培育高产黑果枸杞花青素的植物品种、愈伤组织、悬浮细胞和毛状根，在医药和食品添加剂等领域具有广阔的应用前景，提高了黑果枸杞的药用价值和经济价值。
附图说明
14.图1为本发明实施例2中转基因愈伤组织的pcr鉴定结果。
15.图2为本发明实施例2中过表达lrant1基因的转基因黑果枸杞愈伤组织及植株的表型特征。
16.图3为本发明实施例3中过表达lrant1基因的转基因黑果枸杞愈伤组织与黑果枸杞成熟果实中花青素的含量分析。
17.图4为本发明实施例3中过表达lrant1基因的转基因黑果枸杞愈伤组织与黑果枸杞成熟果实中花青素的hplc分析结果。
18.图5为本发明实施例4中过表达lrant1基因的转基因黑果枸杞愈伤组织中花青素结构基因的表达量。
具体实施方式
19.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
20.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
21.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如green和sambrook等人，分子克隆实验指南(molecular cloning:a laboratory manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
22.在本发明的其中一些实施例中，公开了一种黑果枸杞lrant1基因在提高植物花青素含量中的应用，所述黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或所述黑果枸杞lrant1基因编码氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白。
23.在本发明的另一些实施例中，公开了一种黑果枸杞lrant1蛋白在提高植物花青素含量中的应用，所述黑果枸杞lrant1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
24.seq id no.1
25.atgaacagtactactcctatctgtacgccgttgggagtagtgaggaagggttcatggactgaagatgaagattttcttttgagaaaatgcattcaaaagtacggtgaaggaaagtggcatcttgttcctgctagatctggtctgaatagatgtaggaagagttgcagactaaggtggctgaattatctaaggccacatataaagagaggcgatttctcttctgatgaaacagatctcttgttgaggcttcataagcttctaggcaacagatggtcacttattgctggtagacttccaggaagaacagcaaacgatgtcaagaactactggaacactcacttccaaaagaagttaaatacttttgctcctcttcctcatcgaaagatacacaataacggtagagtctttacgaaaaatgaaattataaaacctcaacctcggaacttctcaagtgctaagaagaatgtcccttatttgttcaccaacaaaagtatcacaaacattgtagacaaagatgaaggcaaaaaagaaataataaggactagtactagtgatcatcagaagcaaacttcagaagcatcgacagataacggatataaatggtgggcaaatttactggaaaattgcaatgaaatcgaggaagcagtagctgatgatacaacaccgacaatttttttgcgcgaggaaaaaacaccaccgttgaatggtggagccaactgtatgctaaaaggacaaagtgatggttgggatgacttttctgttgatattgacatatggagtctacttaat
26.seq id no.2
27.attaagtagactccatatgtcaatatcaacagaaaagtcatcccaaccatcactttgtccttttagcatacagttggctccaccattcaacggtggtgttttttcctcgcgcaaaaaaattgtcggtgttgtatcatcagctactgcttcctcgatttcattgcaattttccagtaaatttgcccaccatttatatccgttatctgtcgatgcttctgaagtttgcttctgatgatcactagtactagtccttattatttcttttttgccttcatctttgtctacaatgtttgtgatacttttgttggtgaacaaataagggacattcttcttagcacttgagaagttccgaggttgaggttttataatttcatttttcgtaaagactctaccgttattgtgtatctttcgatgaggaagaggagcaaaagtatttaacttcttttggaagtgagtgttccagtagttcttgacatcgtttgctgttcttcctggaagtctaccagcaataagtgaccatctgttgcctagaagcttatgaagcctcaacaagagatctgtttcatcagaagagaaatcgcctctctttatatgtggccttagataattcagccaccttagtctgcaactcttcctacatctattcagaccagatctagcaggaacaagatgccactttccttcaccgtacttttgaatgcattttctcaaaagaaaatcttcatcttcagtccatgaacccttcctcactactcccaacggcgtacagataggagtagtactgttcat
28.seq id no.3
29.mnsttpictplgvvrkgswtededfllrkciqkygegkwhlvparsglnrcrkscrlrwlnylrphikrgdfssdetdlllrlhkllgnrwsliagrlpgrtandvknywnthfqkklntfaplphrkihnngrvftkneiikpqprnfssakknvpylftnksitnivdkdegkkeiirtstsdhqkqtseastdngykwwanllencneieeavaddttptiflreektpplnggancmlkgqsdgwddfsvdidiwslln*(*表示终止)
30.应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述cdna阅读框的碱基序列进行修改，也属于本发明的保护范围；在不影响所述黑果枸杞lrant1蛋白结构和活性的前提下，对上述黑果枸杞lrant1蛋白的氨基酸序列进行各种取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，也属于本发明的保护范围。
31.在本发明的另一些实施例中，公开了一种过表达黑果枸杞lrant1基因的重组表达载体在提高植物花青素含量中的应用。
32.在其中一些实施例中，所述重组表达载体为psuper-lrant1-gfp(带有gfp标记)。
33.在本发明的另一些实施例中，公开了一种转化有上述重组表达载体的重组菌在提高植物花青素含量中的应用。所述重组菌为转化有上述重组表达载体的根瘤农杆菌eha105或gv3101。
34.在本发明的另一些实施例中，公开了一种过表达黑果枸杞lrant1基因的愈伤组织
在提高植物花青素含量中的应用。
35.在本发明的另一些实施例中，公开了一种提高黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或黑果枸杞植株花青素含量的生物制剂，所述生物制剂的活性成分包括过表达黑果枸杞lrant1基因的重组表达载体。
36.在本发明的另一些实施例中，公开了一种提高黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或黑果枸杞植株花青素含量的方法，所述方法包括：在黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或植株中提高黑果枸杞lrant1基因或黑果枸杞lrant1蛋白的表达。
37.以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
38.实施例1获取黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框
39.以申请人实验室的黑果枸杞为材料，提取其rna，反转录为cdna，根据已有的黑果枸杞lrant1基因序列设计引物(包括如seq id no.4所示的上游引物和seq id no.5所示的下游引物)，利用dna高保真酶(high-fidelity dna polymerase)进行pcr扩增，pcr反应体系(50μl)为：cdna模板：2μl；上游引物(f)：10um；下游引物(r)：10um；primestar mix：25μl；ddh2o：19μl。反应条件：94℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步33个循环。
40.将50μlpcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。取目标条带进行测序，所得lrant1基因的cds序列如seq id no.1所示(其反向互补序列为seq id no.2所示)，其所编码的蛋白序列如sed id no.3所示。
41.上游引物f(seq id no.4)：
42.tcccccgggatgaacagtactactcctatctgtacg
43.下游引物r(seq id no.5)：
44.cggggtaccattaagtagactccatatgtcaatatcaac
45.实施例2过表达黑果枸杞lrant1基因的转基因愈伤组织的诱导
46.包括以下步骤：
47.1、利用实施例1所述方法获得lrant1基因的cds，然后将所述cds连接到psuper-gfp表达载体(中国农业大学杨淑华教授惠赠)中，获得重组表达载体psuper-gfp-lrant1。使用cacl2介导的化学转化法将重组表达载体psuper-gfp-lrant1导入发根农杆菌eha105中。筛选抗利福平和卡那霉素的农杆菌，进行菌液pcr，pcr使用的引物为：psuper1300-f(seq id no.6)：ggataaatagccttgcttcctat；psuper1300-rf(seq id no.7)：aactttattgccaaatgtttgaac。
48.反应体系为：模板：1μl；psuper1300-f：0.5μl(10um)；psuper1300-r：0.5μl(10um)；t5mix:5μl；ddh2o：3μl；总反应体系10μl。反应条件：94℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步35个循环。挑选阳性菌落摇菌，扩大培养，至菌液od值达到约0.6。
49.2、浸染黑果枸杞外植体
50.(1)、器械准备：将遗传转化过程中涉及到的手术刀、镊子、剪刀和玻璃培养皿高压蒸汽灭菌；
51.(2)、菌液准备：将携带有双元表达载体psuper-lrant1-gfp的eha105农杆菌划线培养，挑选单克隆摇菌扩繁至od
600
＝0.6，离心富集，用浸染液(10mm mgcl2、10mm 2-(n-吗
啉代)乙磺酸(ph5.6)、100um乙酰丁香酮)重悬；
52.(3)、外植体准备：外植体选择无菌的黑果枸杞扦插苗，继代生长45d的健壮植株叶片。在超净台打开黑果枸杞组培植株，用剪刀剪取生长旺盛、肥厚的叶片。
53.(4)、把无菌叶片外植体置于灭菌的玻璃培养皿中，用柳叶刀去除上下两端，在叶片上划出伤口，用镊子将处理后的外植体浸入菌液中，处理20min。
54.(5)、平铺无菌滤纸，将上述浸染过的外植体置于滤纸上，使其表面水分被吹干为宜。
55.(6)、将表面干燥的外植体倒置于共培养基(ms+1.0mg/l 6-ba+1.0mg/l iba)中，黑暗培养48h。将黑暗培养的外植体从共培养培养基中取出，置于无菌水中清洗3～6次，将其置于滤纸上，使其表面水分被吹干为宜。
56.(7)、将表面干燥的外植体倒置于筛选培养基(ms+1.0mg/l 6-ba+1.0mg/l iba+5mg/l hygb)中，正常光照培养，每两周更换一次筛选培养基。
57.(8)、待外植体开始出现明显的再生芽点时，移至含有同样筛选培养基的培养瓶中，直至再生苗1.5-2cm，将再生苗切下，扦插进生根培养基(ms)，14d即可观察到明显的根系生成。
58.(9)、将根系健壮，植株生长正常的再生苗移栽至植物房进行炼苗，需要小心将根系附着的培养基清洗干净，以免滋生细菌腐蚀根系。
59.(10)、将恢复生长的13株转基因材料提取基因组dna进行pcr鉴定，结果如图1所示。从图1可知，13株转基因材料均出现786bp大小的目的条带，确定为转基因阳性植株(标记为oe-lrant1)，作为后续研究材料。
60.将lrant1转基因愈伤组织在ms培养基中生长一个月，lrant1基因表达显著上调的转基因愈伤组织，分别记为oe-lrant1-gfp-line1和oe-lrant1-gfp-line2，其表现出花青素积累的特性(图2中的左图)，其转基因阳性植株也表现出花青素积累的特征(图2中的右图)。
61.实施例3过表达lrant1基因的转基因愈伤组织中的花青素含量测定及hplc检测
62.一、花青素含量测定
63.提取和检测转基因愈伤组织oe-lrant1中黑果枸杞花青素，包括以下步骤：
64.1、液氮冻存转基因愈伤组织oe-lrant1，使用研磨仪将样品低温研磨；
65.2、称取0.2g转基因愈伤组织，加入2ml提取液(含有3％浓盐酸的甲醇溶液)，4℃摇床提取2～3小时；
66.3、4℃条件下，12000g离心5分钟，吸取上清液，将灭菌水、上清液以及氯仿等比例混合，短暂离心；
67.4、提取短暂离心后的上清液，使用分光光度计检测样品在535nm和650nm波长下的od值，记录分析，每个实验重复3遍。
68.结果如图3所示，与oe-gfp(阴性对照，标注为nc)相比，oe-lrant1中黑果枸杞花青素含量显著升高，说明过表达lrant1基因能够显著提高黑果枸杞转基因愈伤组织中花青素的含量，在黑果枸杞愈伤组织中实现了花青素的高效合成。
69.二、hplc检测
70.冷冻干燥后，高效液相色谱法测定花青素成分(色谱柱为
c18column(4.6
×
250mm，5μm，shimadzu公司))。a相为0.1％甲酸-水、b相为乙腈，柱温保持在40℃，进样量为10μl，流速为1ml/min。梯度洗脱程序为：0-3分钟10％的b相；3-16分钟10-80％的b相；16-17分钟80-95％的b相。
71.结果如图4所示，结果表明：与oe-gfp(阴性对照，标记为nc)相比，oe-lrant1(标记为oe-lrant1)中花青素的主要成分与黑果枸杞的成熟果实(阳性对照，标记为pc)的主要成分一致。
72.以上实验结果表明，在黑果枸杞中过表达lrant1基因，能够显著提高黑果枸杞中花青素的含量。因此，lrant1基因将可以应用于培育高品质的黑果枸杞品种，提高黑果枸杞的药用价值和经济价值。
73.实施例4过表达lrant1基因的转基因愈伤组织中结构基因表达量的测定
74.将实施例2的过表达lrant1基因的转基因愈伤组织(标记为oe-lrant1)在ms培养基中生长一个月后，测定转基因愈伤组织中lrchs和lrf3
’5’
h的相对表达量，具体步骤如下：
75.分别提取野生型(wt)、gfp过表达(nc)和过表达lrant1基因的愈伤组织(oe-lrant1)的rna，并反转录成cdna作为模板，采用rt-pcr方法进行扩增(使用rnase free water稀释至50ng/μl的cdna，按照monamp
tm
chemohs qpcr mix试剂盒方法配制反应体系，使用roche light cycler 480
ꢀⅱ
仪器进行检测。使用2
‑△△
ct
计算基因相对表达量)。
76.qpcr反应体系如下：
77.monamp
tm
chemohs qpcr mix5μlforward primer(10μm)0.2μlreverse primer(10μm)0.2μlcdna1μlrnase free water3.6μl 10μl
78.qpcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃扩增30s，循环数40个；60℃冷却15s。
79.所用引物为：
80.lrchsq-rt-f(seq id no.8)：cgtatcactgatagcgagcac
81.lrchsq-rt-r(seq id no.9)：tgcctctttgccaagtttag
82.lrf3
’5’
hq-rt-f(seq id no.10)：gaaagagggatgaaacgattgc
83.lrf3
’5’
hq-rt-r(seq id no.11)：ttggtccatttcttgttgtgct
84.结果如图5所示，结果表明：与oe-gfp(阴性对照nc)相比，oe-lrant1中花青素合成关键结构基因lrchs和lrf3
’5’
h的相对表达量也明显上调。
85.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
86.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种黑果枸杞lrant1基因在提高植物花青素含量中的应用，其特征在于，所述黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或所述黑果枸杞lrant1基因编码氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为黑果枸杞。3.一种黑果枸杞lrant1蛋白在提高植物花青素含量中的应用，其特征在于，所述黑果枸杞lrant1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。4.一种过表达黑果枸杞lrant1基因的重组表达载体在提高植物花青素含量中的应用，其特征在于，所述黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或所述黑果枸杞lrant1基因编码氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体为psuper-lrant1-gfp。6.一种转化有权利要求4或5所述的重组表达载体的重组菌在提高植物花青素含量中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组菌为转化有权利要求4或5所述的重组表达载体的根瘤农杆菌eha105或gv3101。8.一种过表达黑果枸杞lrant1基因的愈伤组织在提高植物花青素含量中的应用，其特征在于，所述黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或所述黑果枸杞lrant1基因编码氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白。9.一种提高黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或黑果枸杞植株花青素含量的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的活性成分包括过表达黑果枸杞lrant1基因的重组表达载体，所述黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或所述黑果枸杞lrant1基因编码氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白。10.一种提高黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或黑果枸杞植株花青素含量的方法，其特征在于，所述方法包括：在黑果枸杞愈伤组织、悬浮细胞、毛状根或植株中提高黑果枸杞lrant1基因或黑果枸杞lrant1蛋白的表达；所述黑果枸杞lrant1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或所述黑果枸杞lrant1基因编码氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白。

技术总结
本发明公开了一种黑果枸杞LrANT1基因及其编码蛋白在提高植物花青素含量中的应用，所述黑果枸杞LrANT1基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或所述黑果枸杞LrANT1基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白。本发明发现黑果枸杞LrANT1基因能够显著提高黑果枸杞花青素的含量，从而可用于培育高产黑果枸杞花青素的植物品种、愈伤组织、悬浮细胞和毛状根，在医药和食品添加剂等领域具有广阔的应用前景，提高了黑果枸杞的药用价值和经济价值。药用价值和经济价值。药用价值和经济价值。


技术研发人员：曾少华 王瑛 艾培炎 阿彪 杨超
受保护的技术使用者：中国科学院华南植物园
技术研发日：2023.08.31
技术公布日：2023/10/20