用于预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的生物标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物标志物技术领域，具体涉及单核苷酸多态性(snp)标志物及其应用，更具体地，涉及用于预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.急性胰腺炎(acute pancreatitis，ap)是消化系统常见急症，其中有10％～30％为复发性急性胰腺炎(recurrent acute pancreatitis，rap)，高脂血症是急性胰腺炎复发的高危因素。而随着人们生活节奏的不断加快和饮食结构的变化，临床中高脂血症型急性胰腺炎(hlap)越发普遍。在我国，高甘油三酯血症(htg)已成为急性胰腺炎发病的第二大主要原因。高脂血症型急性胰腺炎约占全部急性胰腺炎的10％-15％，在妊娠期急性胰腺炎中占比高达50％，常具有进展迅速、重症率高、尤其是易反复及预后差的特点，给患者的身心造成反复持续的伤害。因此，对高脂血症型急性胰腺炎患者的发生和复发情况进行准确预测将有助于积极的个体化治疗措施的开展，对患者生存质量的提高具有重大意义。
3.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的dna序列多态性，在人群中的频率需》1％。snps是双等位基因标记，通过检测受检者snp位点的基因型可预测个体发生某种疾病的风险。
4.综上，本领域亟需寻找并检测一组与高脂血症型急性胰腺炎的发生及复发频率相关的snp位点，有助于高脂血症型急性胰腺炎患者的早日筛查、诊断，以及了解其疾病复发的风险。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于预测高脂血症型急性胰腺炎易感风险和/或复发风险的生物标志物及其应用，本发明标志物能够方便地运用于临床并快速有效地预测高甘油三酯血症个体发生高脂血症型急性胰腺炎的风险，以及高脂血症型急性胰腺炎患者的疾病复发风险，可针对高危患者提前采取保护措施，制定个性化的治疗方案，利于患者的治疗并提高患者的生存质量。
6.为解决上述问题，本发明首先提供了一种用于预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的生物标志物，所述标志物包括以下snp位点中的任意一个或多个的组合：
7.sra1基因的chr 5.140552044位点；apoa5基因的chr 11.116790676位点；aifm2基因的chr 10.70115028位点。
8.本发明另一方面还提供了前面所述的生物标志物在制备预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的产品中的应用。
9.优选地，通过检测受试者所述snp位点中的至少一个位点的基因型，从而判断是否
为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体；若所述snp位点中的至少一个位点发生突变具有危险等位基因，则判断受试者为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体，若所述snp位点的基因型未发生突变，则判断受试者为高脂血症型急性胰腺炎的耐受个体；其中，所述受试者具有高甘油三酯血症。
10.优选地，通过检测受试者所述snp位点中的至少一个位点的基因型，从而判断高脂血症型急性胰腺炎的复发风险；若所述snp位点中的至少一个位点发生突变具有危险等位基因，则判断受试者为复发高危个体，若所述snp位点的基因型未发生突变，则判断受试者为复发低危个体。
11.优选地，所述sra1基因的chr 5.140552044位点的危险等位基因为g；所述apoa5基因的chr 11.116790676位点的危险等位基因为a；所述aifm2基因的chr 10.70115028位点的危险等位基因为t。
12.本发明另一方面还提供了一种预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测受试者样本中如前面所述的snp位点的基因型的试剂。
13.优选地，检测试剂包括：特异性扩增包含权利要求1所述的snp位点的核苷酸的引物。
14.优选地，所述引物包括以下引物组合中的至少一组：
15.(1)用于扩增sra1基因的chr5.140552044位点的引物对，其序列为seq id no：1至2；
16.(2))用于扩增apoa5基因的chr11.116790676位点的引物对，其序列为seq id no：3至4；
17.(3)用于扩增aifm2基因的chr10.70115028位点的引物对，其序列为seq id no：5至6。
18.优选地，采用所述引物对所述snp位点进行扩增的pcr反应条件为：95℃3min；25-30cycles：95℃15s，62℃15
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25s，72℃30-60s；72℃5min。
19.优选地，所述受试者样本包括组织样本、血液样本。
20.相对于现有技术，本发明的有益效果至少包括：
21.(1)本发明发现了sra1基因的chr 5.140552044多态性位点、apoa5基因的chr 11.116790676多态性位点以及aifm2基因的chr 10.70115028多态性位点与高脂血症型急性胰腺炎患者的复发显著相关，携带前述3个snp位点中的至少一个snp突变的个体具有高频率复发的风险。该snp位点突变可用于预测高脂血症型急性胰腺炎患者的复发风险，有利于提供个性化治疗方案，改善预后，提高生存质量。
22.(2)本发明发现了sra1基因的chr 5.140552044多态性位点、apoa5基因的chr 11.116790676多态性位点以及aifm2基因的chr 10.70115028多态性位点与高甘油三酯血症患者是否为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体显著相关，携带前述3个snp位点中的至少一个snp突变的个体为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体，有利于对高危患者提前采取保护措施，提高生存质量。
具体实施方式
23.以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
24.如前所述，鉴于现有技术的不足，本发明申请人经过大量研究和实验：首先本发明基于复发性高脂血症型急性胰腺炎(htgrap)和高甘油三酯血症(htg)两组人群的发现队列和验证队列，采用全外显子测序、一代测序以及一系列生物信息学分析，最终筛选到具有显著差异分析的3个snp位点：sra1基因snp位点chr 5.140552044、apoa5基因snp位点chr11.116790676和aifm2基因snp位点chr 10.70115028，该3个snp位点有助于判断htg患者是否为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体；随后，还根据这3个snp位点有无突变，将htgrap患者分为突变组及非突变组，用中位数统计htgrap复发频率，结果发现突变组htgrap患者的复发频率显著高于非突变组患者。
25.换言之，本技术发现sra1基因snp位点chr 5.140552044、apoa5基因snp位点chr 11.116790676和aifm2基因snp位点chr 10.70115028与高脂血症型急性胰腺炎的发生和复发显著相关。其中，sra1基因chr5.140552044的g等位基因、apoa5基因chr 11.116790676的a等位基因和aifm2基因chr 10.70115028的t等位基因与复发呈正相关。本发明将等位基因g、a和t定义为危险等位基因。sra1基因chr 5.140552044位点可能的基因型为cc、cg和gg，apoa5基因chr 11.116790676位点可能的基因型为cc、ca和aa，aifm2基因chr 10.70115028位点可能的基因型为cc、ct和tt。本发明将3个位点均为cc基因型的htg患者定义为高脂血症型急性胰腺炎耐受个体；其余患者(即3个位点任一基因座出现危险等位基因的患者)为高脂血症型急性胰腺炎易感个体。将3个位点均为cc基因型的高脂血症型急性胰腺炎患者定义为复发低危个体；其余患者(即3个位点任一基因座出现危险等位基因的患者)分为复发高危个体，复发高危个体的复发风险及频率会显著高于复发低危个体。
26.接下来结合实验数据详细描述本发明研究的过程及结果：
27.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
28.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
29.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.本技术涉及的材料和实验方法：
31.1、研究对象
32.本发明纳入2022至2023年间在上海市第一人民医院、复旦大学附属华东医院及上海市松江区中心医院就诊的60名htgrap患者与54名htg患者，临床病理资料和随访信息通过电子病历系统检索获得。研究经上海交通大学附属医学院伦理审查委员会批准，每个项目个体均签署知情同意书，研究方案按照批准准则进行。其中：
33.本发明“rap”被定义为至少有两次充分记录的ap发作，每次发作之间症状缓解超过三个月，并且没有cp4的形态学标准。
34.ap的诊断至少需要以下三个特征中的两个：1)急性发作持续的、严重的上腹部疼痛，经常辐射到背部；2)血清淀粉酶或脂肪酶活性至少是正常实验室水平上限的三倍；3)根据修订后分类的ap影像学证据。
35.htgrap被确定为rap患者，且其入院时血清甘油三酯水平高于1000mg/dl(11.3mmol/l)或高于500mg/dl，并伴有脂浆，无其他明显的胰腺炎原因。
36.ap的严重程度分为：1)轻度急性胰腺炎(map)，定义为无局部并发症或器官衰竭的ap；2)中重度急性胰腺炎(msap)，其特征是短暂性器官衰竭(＜48小时)和/或局部并发症和/或合并症的恶化；3)重症急性胰腺炎(sap)，其定义为持续性器官功能衰竭(≥48小时)，最常见的是呼吸系统衰竭，伴有或不伴有局部并发症。
37.这项研究包括被诊断为htg和htgrap的患者。如果htg患者的病因是酒精、甲状腺功能减退、肾脏疾病(蛋白尿、尿毒症或肾小球肾炎)、妊娠、副蛋白血症、系统性红斑狼疮或药物(如皮质类固醇、口服雌激素、他莫昔芬和噻嗪)，则将其排除在外。
38.2、数据收集
39.收集人口统计学和临床特征，包括性别、首次发作年龄、ap发作次数、疾病持续时间和体重指数(bmi)。合并症包括糖尿病、高血压和脂肪肝。收集实验室检查和ct图像。计算急性生理和慢性健康评估(apache ii)、ranson评分、急性胰腺炎床边严重程度指数(bisap)和胰腺炎活动评分系统(pass)。记录了局部并发症(急性胰周液收集、急性坏死收集、壁状坏死、胰腺假性囊肿和感染性坏死)、全身炎症反应综合征(sirs)和胰腺外并发症(器官衰竭、败血症、腹内高压、腹腔隔室综合征和胰性脑病)。收集住院时间和icu入院人数。
40.3、全外显子组测序
41.根据制造商的说明，外显子组捕获和文库使用安捷伦sureselect v6试剂盒构建。最初使用qubit 2.0对文库进行定量，并稀释至1ng/μl。使用安捷伦2100检查文库的插入物大小。在插入物大小达到预期后，使用q-pcr准确定量文库的有效浓度(》2nm)以确保质量。在illumina hiseq平台(illumina，san diego，ca，usa)上对文库进行测序。
42.将从高通量测序获得的原始图像数据文件转换为原始序列(sequenced reads)。cutadapt进行质量控制，包括基础质量分布、gc含量分布和测序数据过滤。使用bwa软件将片段与参考基因组进行比较，并使用picard软件去除由pcr重复产生的序列。本研究中使用的参考基因组是hg19。
43.4、生物信息学分析
44.选择影响氨基酸序列的变体(非同义)进行下游基因分析。单核苷酸多态性(snp)使用基因组分析工具包(gatk)进行鉴定，并通过annovar进行注释。htgrap组和htg组之间具有不同等位基因频率的snps(p《0.05)使用spss的“fisher exact”函数(25.0版，纽约州armonk，ibm corp)进行鉴定。通过cadd、polyphen 2和sift进一步过滤snp以鉴定致病性。接下来，通过1000g2014oct_eas和exaceas将snp过滤到稀有(全局等位基因频率《0.01)。从每个生物信息学策略中选择最重要的snp，得到候选snp。
45.5、基因分型检测及分析
46.验证队列中的snps基因分型分析通过pcr扩增和sanger测序完成。所有引物均由enzyartisan(中国上海)合成，并在表1中提供。根据制造商的说明，通过g5高保真dna聚合酶试剂盒(g302，enzyartisan，中国上海)进行pcr扩增。最终反应体系如下：10μl diamond pcr缓冲液、0.8μl正向引物(10μm)、0.8μl反向引物(10μm)、0.4μl g5高保真dna聚合酶(0.1u/μl)、100ng dna和无dna酶的h2o，系统总体积为20μl。反应条件如下：在95℃下初始
变性3分钟，95℃15秒循环25-35次、62℃持续15-25秒，72℃持续30-60秒，在72℃下最终延伸5分钟。通过sanger测序鉴定pcr产物，然后使用snapgene viewer进行分析。
47.表1扩增snp位点的引物对
[0048][0049]
6、统计
[0050]
具有正态分布的连续数据变量表示为平均值和标准差(sd)，并使用student t检验进行分析。遵循非正态分布的数据表示为中位数和四分位间距(iqr)，并使用mann-whitney u检验进行分析。单因素方差分析(anova)用于比较来自三个或更多组的数据。数据以分类变量的数字和百分比表示，并通过卡方检验进行评估。所有统计分析均在ibm spss statistics软件中进行。p《0.05表明差异具有统计学意义。
[0051]
(二)实验过程及结果
[0052]
1、候选snp的筛选及验证
[0053]
本发明研究包括两个阶段：探索队列和验证队列。
[0054]
纳入10名htgrap患者及10名htg患者，形成探索队列。探索队列两组患者的外周血dna抽提并质检均合格后：(1)采用gatk4过滤；(2)经卡方检验对两组等位基因突变频率进行检测后，选择p《0.05的snp共计141个；(3)采用cadd、polyphen2及sift软件对snp性质进行预测，去除20个预测为良性突变的snp，保留预测为有害突变的snp共计121个；(4)进一步经1000g2014oct_eas及exac_eas数据库排除高频突变(《0.01)，最终形成39个候选snp队列。
[0055]
基于前述研究，纳入另外50名htgrap和44名htg患者形成验证队列。验证队列两组患者的外周血dna抽提并质检合格后，经pcr扩增后送sanger一代测序，经卡方检验对两组等位基因突变频率进行检测后，选择p《0.05的snp，结果如表2所示，共计3个snp位点。具体位点信息如下：
[0056]
(1)sra1 chr5:140552044c》g
[0057]
enst00000336283:exon3:c.328g》c:p.v110l；
[0058]
(2)apoa5 chr11:116790676c》a
[0059]
enst00000227665:exon3:c.553g》t:p.g185c，；
[0060]
enst00000542499:exon4:c.553g》t:p.g185c。
[0061]
(3)aifm2 chr10:70115028c》t
[0062]
enst00000373248:exon7:c.862g》a:p.d288n；
[0063]
enst00000307864:exon8:c.862g》a:p.d288n；
[0064]
enst00000613322:exon8:c.862g》a:p.d288n。
[0065]
表2htgrap患者的遗传危险因素
[0066][0067]
表2列出的3个snp位点在htgrap患者与htg患者中具有显著差异，有助于判断htg患者是否为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体。
[0068]
2、3个snp位点与htgrap复发频率的关系
[0069]
基于前述研究，分别根据3个snp位点有无突变，将htgrap患者分为突变组(mutation group)及非突变组(mutation-free group)，具体地，当患者sra1基因的chr 5.140552044位点的基因型为cc时为非突变组，其余患者(该位点基因型为cg或gg)均为突变组；当患者apoa5基因的chr11.116790676位点的基因型为cc时为非突变组，其余患者(该位点基因型为ac或aa)均为突变组；当患者aifm2基因的chr 10.70115028位点的基因型为cc时为非突变组，其余患者(该位点基因型为ct或tt)均为突变组。用中位数统计htgrap复发频率，并计算两组p值。
[0070]
结果如表3所示，当sra1基因的chr 5.140552044位点或apoa5基因的chr 11.116790676位点或aifm2基因的chr 10.70115028位点发生突变时，htgrap患者的复发频率显著高于该位点非突变患者，且p值具有统计学意义。
[0071]
表3 sra1、apoa5及aifm2的snp位点突变或非突变的htgrap患者的复发频率对比
[0072][0073]
3、3个snp位点与ap发作的临床表型的关系
[0074]
我们还分别评估了这3个snp与ap发作的临床表型的相关性。结果如表4至表6所示。
[0075]
表4显示了具有或不具有sra1基因snp位点突变的ap患者的临床表型比较。sra1突变组的ranson和pass评分均高于无突变组(p《0.05)。与无突变组相比，突变组的局部并发症发生率更高，包括急性胰周液收集、急性坏死收集、壁坏死、胰腺假性囊肿和感染性坏死(p《0.05)，sirs的发生率在突变组中显著增加。然而，胰腺外并发症如器官衰竭、败血症、腹腔内高血压、腹腔隔室综合征和胰腺性脑病的发生率没有显著差异(p》0.05)。此外，sra1突变组的中性粒细胞计数和中性粒细胞百分比显著增加，淋巴细胞百分比下降(p《0.05)。
[0076]
表5显示了具有或不具有apoa5基因snp位点突变的ap患者的比较。与apoa5无突变组相比，apoa5突变组的局部并发症和sirs的发生率显著较高(p《0.05)。apoa5突变组的中性粒细胞百分比和中性粒细胞与淋巴细胞的比率增加，而淋巴细胞百分比降低(p《0.05)。
[0077]
表6显示了具有或不具有aifm2基因snp位点突变的ap患者的比较。与aifm2无突变组相比，aifm2突变组的apache ii评分、白细胞计数和中性粒细胞计数显著增加(p《0.05)。
[0078]
以上结果表明，本技术提供的sra1、apoa5或aifm2基因snp与ap发作期间的局部和全身炎症条件以及疾病严重程度显著相关。
[0079]
表4具有或不具有sra1基因snp位点突变的ap患者的临床表型比较
[0080][0081][0082]
表5具有或不具有apoa5基因snp位点突变的ap患者的临床表型比较
[0083][0084]
表6具有或不具有aifm2基因snp位点突变的ap患者的临床表型比较
[0085][0086]
实施例1
[0087]
一种用于预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的试剂盒，包括：(1)用于扩增sra1基因的chr5.140552044位点的引物对，其序列为seq id no：1至2；(2)用于扩增apoa5基因的chr11.116790676位点的引物对，其序列为seq id no：3至4；(3)用于扩增aifm2基因的chr10.70115028位点的引物对，其序列为seq id no：5至6。试剂盒还包含其他常规用于pcr扩增的试剂，例如dntps、聚合酶、缓冲液等。
[0088]
综上所述，本发明提供的3个snp位点(sra1基因的chr 5.140552044、apoa5基因的chr 11.116790676和aifm2基因的chr 10.70115028)与高脂血症型急性胰腺炎患者的易感性和/或复发显著相关，可用于预测高脂血症型急性胰腺炎患者的易感性风险和/或复发风险。
[0089]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的
描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种用于预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的生物标志物，其特征在于，所述标志物包括以下snp位点中的任意一个或多个的组合：sra1基因的chr 5.140552044位点；apoa5基因的chr 11.116790676位点；aifm2基因的chr 10.70115028位点。2.权利要求1所述的生物标志物在制备预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的产品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过检测受试者所述snp位点中的至少一个位点的基因型，从而判断是否为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体；若所述snp位点中的至少一个位点发生突变具有危险等位基因，则判断受试者为高脂血症型急性胰腺炎的易感个体，若所述snp位点的基因型未发生突变，则判断受试者为高脂血症型急性胰腺炎的耐受个体；其中，所述受试者具有高甘油三酯血症。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过检测受试者所述snp位点中的至少一个位点的基因型，从而判断高脂血症型急性胰腺炎的复发风险；若所述snp位点中的至少一个位点发生突变具有危险等位基因，则判断受试者为复发高危个体，若所述snp位点的基因型未发生突变，则判断受试者为复发低危个体。5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述sra1基因的chr5.140552044位点的危险等位基因为g；所述apoa5基因的chr11.116790676位点的危险等位基因为a；所述aifm2基因的chr10.70115028位点的危险等位基因为t。6.一种预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测受试者样本中如权利要求1所述的snp位点的基因型的试剂。7.如权利要求6所述的预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的试剂盒，其特征在于，检测试剂包括：特异性扩增包含权利要求1所述的snp位点的核苷酸的引物。8.如权利要求7所述的预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的试剂盒，其特征在于，所述引物包括以下引物组合中的至少一组：(1)用于扩增sra1基因的chr5.140552044位点的引物对，其序列为seqid no：1至2；(2))用于扩增apoa5基因的chr11.116790676位点的引物对，其序列为seq id no：3至4；(3)用于扩增aifm2基因的chr10.70115028位点的引物对，其序列为seq id no：5至6。9.如权利要求8所述的预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的试剂盒，其特征在于，采用所述引物对所述snp位点进行扩增的pcr反应条件为：95℃3min；25-30cycles：95℃15s，62℃15-25s，72℃30-60s；72℃5min。10.如权利要求6所述的预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的试剂盒，其特征在于，所述受试者样本包括组织样本、血液样本。

技术总结
本发明公开了一种用于预测高脂血症型急性胰腺炎易感性风险和/或复发风险的生物标志物及其应用。所述标志物包括以下SNP位点中的任意一个或多个的组合：SRA1基因Chr 5.140552044位点；APOA5基因Chr11.116790676位点；AIFM2基因Chr 10.70115028位点。通过检测受试者所述SNP位点中的至少一个位点的基因型，从而判断高脂血症型急性胰腺炎的易感性风险和/或复发风险，若所述SNP位点中的至少一个位点发生突变具有危险等位基因，则判断受试者为易感个体或复发高危个体；若所述SNP位点的基因型未发生突变，则判断受试者为耐受个体或复发低危个体。复发低危个体。


技术研发人员：曾悦 黄春兰 黄则华 范俊杰 梅启享 殷诺铭 伏扬 许缤强 黄慧珍 秦文飞 肖炜
受保护的技术使用者：上海市第一人民医院
技术研发日：2023.08.31
技术公布日：2023/10/20