一种产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法和应用

1.本发明涉及代谢工程和食品发酵技术领域，特别是涉及一种产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.食用菌含有香气、鲜味等成分，是很好的调味品，其香气能够使人们在感官和心理上得到愉快享受，促进消化液的分泌，有利于人体对营养成分的消化吸收。食用菌具有特殊的香味，而不同种类的食用菌往往会呈现出不同的风味。灰树花食之味如鸡丝，香气诱人。食用菌中挥发性风味成分主要包括八碳挥发性化合物、含硫化合物和一些酸、酮、醛、酯类化合物等。近年来研究表明，在110多种挥发性化合物中，八碳挥发性化合物是食用菌香气的主要贡献者，甚至作为信号分子氧脂素和群体感应分子具有影响真菌生长发育和行为等多种功能。目前，1-辛烯-3-醇(即“蘑菇醇”)是食用菌中最重要的挥发性化合物，几乎存在于所有的食用菌种类中，并且含量较为丰富。此外，1-辛烯-3-醇还作为信号分子氧脂蛋白和群体感应分子影响着真菌、植物和昆虫的生长、发育和行为。特别是，1-辛烯-3-醇被认为是蘑菇原基形成的自抑制剂，它导致了“过度拥挤”效应，从而限制了孢子在密集浓度下的萌发。1-辛烯-3-醇的嗅觉阈值非常低，因此，它被美国食品和药物管理局授权用作食品添加剂(asp 1154，regnum 172.515)，且可用于日化和配制蘑菇和泥土味等型食用香精，以及配制人造精油、重组精油或制成酯类香料，还可以作为化学合成原料，应用于制药领域；作为蚊虫引诱剂，应用于杀蚊制品，有较高的经济价值。这些挥发性化合物是蘑菇特有的“新鲜绿色”气味的主要来源。例如，它们被广泛用作食物的口味，以恢复消毒过程后食物的新鲜度。由于这些化合物在自然界中含量低，且需求量大，因此有必要大规模合成它们。脂氧合酶、氢过氧化物裂解酶和醇氧化还原酶是生产“天然”食品口味的合适的生物催化剂。
3.一般认为，食用菌中挥发性化合物1-辛烯-3-醇合成过程，可能涉及以下主要步骤：(1)通过脂氧合酶(lipoxygenase,lox)将底物亚油酸立体加氧合成为氢过氧化物10-hpod；(2)一种相对稳定的氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,hpl)和醇氧化还原酶(alcohol oxidoreductase,aor)共同催化多不饱和脂肪酸氢过氧化物10-hpod中c-c键的裂解并形成具有挥发性的1-辛烯-3-醇和10-氧代-反式-8-癸烯酸。其中催化裂解低氢过氧化物异构体10-hpod合成具有挥发性产物1-辛烯-3-醇的反应过程为：ch3(ch2)4chchch2choohchch(ch2)6cooh
→
chochch(ch2)6cooh+ch2＝chch(oh)ch2ch2ch2ch2ch3+hochch(ch2)5ch3。由于所形成的过氧化氢脂肪酸中间体对人体有很高的危险性，准确阐明关键酶系的催化特性及在食用菌香气的贡献作用是理解1-辛烯-3-醇合成的关键步骤。
4.目前，多不饱和脂肪酸氢过氧化物10-hpod积累问题是从亚油酸可持续生物合成1-辛烯-3-醇的主要瓶颈。用于1-辛烯-3-醇生产的脂氧合酶、氢过氧化物裂解酶和醇氧化还原酶的活性不足，极易积累毒性10-hpod，损坏细胞的生长。并且关于灰树花中氢过氧化物10-hpod被氢过氧化物裂解酶裂解的机理仍不清楚，且尚未发现有通过重组菌来发酵生
产1-辛烯-3-醇的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该重组谷氨酸棒杆菌实现了微生物法大量生产1-辛烯-3-醇的目的，为安全高效生产芳香辛素提供行之有效的解决策略和途径。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌通过向谷氨酸棒杆菌中导入脂氧合酶基因、氢过氧化物裂解酶基因、醇氧化还原酶基因以及三联启动子构建而成，其中，所述三联启动子(p
tac-p
tuf-p
gro
)的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述脂氧合酶(lox)基因的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述氢过氧化物裂解酶(hpl)如seq id no：3所示，所述醇氧化还原酶(aor)如seq id no：4所示。
8.本发明还提供一种所述的产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：
9.将脂氧合酶基因、氢过氧化物裂解酶基因、醇氧化还原酶基因以及三联启动子的核苷酸序列导入质粒载体中，构建重组质粒；
10.将所述重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到重组工程菌。
11.优选的是，扩增所述氢过氧化物裂解酶的引物为：
12.gfhpl-f：5
’‑
ttgtatgaatggcgtccgcactcagaga-3’，seq id no：6；
13.gfhpl-r：5
’‑
atcccttgatcatgcacgctgacgcgga-3’，seq id no：7；
14.扩增所述醇氧化还原酶基因的引物为：
15.gfaor-f：5
’‑
gtgcatgatcaagggattatcacagccctgaac-3’，seq id no：8；
16.gfaor-r：5
’‑
caaaacagccaagctgatgtggatgattgtgcccatcg-3’，seq id no：9；
17.扩增所述脂氧合酶基因的引物为：
18.lox-f：5
’‑
ttcaagtaaa tggctccctt caagggg-3’，seq id no：10；
19.lox-r：5
’‑
ggacgccatt catacaaggt ttaatgagag aaggtcaatgt-3’，seq id no：11；
20.扩增所述三联启动子的引物为：
21.p
tac-p
tuf-p
gro-f：5
’‑
gtatcccact accgagatat gcctatcttc aagaagacgc tca-3’，seq id no：12；
22.p
tac-p
tuf-p
gro-r：5
’‑
caaaacagcc aagctgttac ttgaagatcg ttaccttctt acgtgtacc-3’，seq id no：13。
23.优选的是，所述电转条件为：所述重组质粒与所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞的体积比为1:50，电转电压为2.5kv。
24.本发明还提供利用所述的重组谷氨酸棒杆菌生产1-辛烯-3-醇的方法，包括通过发酵培养所述重组谷氨酸棒杆菌获取发酵液，并对所述发酵液进行分离纯化，获取1-辛烯-3-醇的步骤。
25.优选的是，所述发酵培养的发酵培养基包括以下组分：豆粉10g，大豆油2.5g，磷酸
二铵0.2g，kh2po
4 0.068g，玉米浆8.0ml，柠檬酸盐缓冲液2.941g，矿物溶液100ml，定容至1l；
26.所述发酵培养的条件为：接种量1％-10％，转速200r/min，培养时间为24～48h。
27.优选的是，所述分离纯化为：将所述发酵液离心后取上清液i，并向所述上清液i加入磷酸钠缓冲液和亚油酸，混合均匀，孵育；
28.孵育结束后，调整混合物的ph值并离心取上清液ii，再用乙醚提取所述上清液ii，收集乙醚部分，挥发乙醚，得到1-辛烯-3-醇。
29.优选的是，所述磷酸钠缓冲液的浓度为0.1m，ph值为6.5；所述亚油酸的浓度为130μm；
30.所述孵育的条件为：25℃下孵育60min。
31.优选的是，调整所述混合物的ph值为9.0。
32.本发明还提供所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产1-辛烯-3-醇中的应用。
33.本发明公开了以下技术效果：
34.本发明在食品级安全菌株谷氨酸棒杆菌内引入1-辛烯-3-醇合成途径相关基因，成功实现了1-辛烯-3-醇的异源生物合成，谷氨酸棒杆菌作为重要的工业发酵工程菌，培养成本相对较低，生产强度大。相比其他1-辛烯-3-醇合成的菌种，其产物完全满足食品安全要求，具有巨大的应用优势。同时，本发明还引入三联启动子，相比于普通单启动子对照组，有效提高相关基因的转录效率，1-辛烯-3-醇产量提高了364％，达到22mg/l，远高于其他种属相关基因工程菌的发酵水平，具有良好的产业化应用前景。
35.本发明将有助于从分子水平理解食用菌中挥发性化合物1-辛烯-3-醇的合成机制，生物技术工艺的开发是为高效发酵生产品质稳定的1-辛烯-3-醇产品提供重要的技术支持和参考。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.图1为谷氨酸棒杆菌中构建从头合成1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)的途径图；
38.图2为ecorⅰ和ecor
ⅴ
双酶切质粒pxmj19的琼脂糖凝胶电泳图；1，代表质粒pxmj19样品；m，代表标准dna分子；
39.图3为质粒px
lox-hpl-aor
的图谱；
40.图4为1-辛烯-3-醇标准品gc/ms图谱；
41.图5为重组谷氨酸棒杆菌发酵生产1-辛烯-3-醇产量结果。
具体实施方式
42.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
43.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发
明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
44.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
45.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
46.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
47.本发明提供了一种通过在谷氨酸棒杆菌表达系统中整合三联启动子高效表达食用菌灰树花中脂氧合酶基因lox、氢过氧化物裂解酶基因hpl和醇氧化还原酶基因aor的技术方案(具体构建途径见图1)。多数谷氨酸棒杆菌无致病性，美国食品和药物管理局(fda)已经将谷氨酸棒杆菌列为原则上认为安全的微生物(gras)，被认为是生物制造的理想微生物底盘，本发明具体构建成高效合成挥发性化合物1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌以及生产1-辛烯-3-醇的方法，为安全高效生产芳香辛素提供行之有效的解决策略和途径。所构建的谷氨酸棒杆菌能以亚油酸等为底物合成1-辛烯-3-醇。下面以具体实施例对上述技术构思进一步说明。
48.实施例1导入1-辛烯-3-醇生物合成相关基因构建重组谷氨酸棒杆菌cg/px
lox-hpl-aor
49.1、表达质粒px
lox-hpl-aor
的构建，包括以下步骤：
50.(1)以灰树花grifola frondosa strain gf9801基因组dna为模板，分别利用引物gfhpl-f、gfhpl-r和gfaor-f、gfaor-r pcr扩增hpl基因(seq id no.3)和aor基因(seq id no.4)片段，回收纯化；
51.引物序列如下：
52.gfhpl-f：5
’‑
ttgtatgaatggcgtccgcactcagaga-3’；
53.gfhpl-r：5
’‑
atcccttgatcatgcacgctgacgcgga-3’；
54.gfaor-f：5
’‑
gtgcatgatcaagggattatcacagccctgaac-3’；
55.gfaor-r：5
’‑
caaaacagccaagctgatgtggatgattgtgcccatcg-3’。
56.pcr反应体系为：
57.表1
58.试剂用量引物f1μl引物r1μl10
×
buffer5μl
dna5μlextag0.25μldntp4μlddh2o33.75μl
59.pcr反应条件为：
60.表2
61.温度时间98℃30s98℃10s55℃30s72℃2min32cycles
62.(2)ecorⅰ和ecor
ⅴ
双酶切质粒pxmj19，回收纯化5.3kb片段。见图2。
63.双酶切反应体系：
64.表3
65.试剂用量质粒pxmj195μlecorⅰ,ecor
ⅴ
1μl+1μlbuffer3μlddh2o20μl
66.双酶切条件为37℃，酶切4h。
67.(3)合成hr1-p
tac-p
tuf-p
gro-lox-hr2基因元件(seq id no：5)，包括20bp的pxmj19末端同源序列，三联密码子序列p
tac-p
tuf-p
gro
(seq id no：1)，lox基因序列及hpl末端同源序列。基因序列委托江苏金斯瑞生物科技有限公司合成。
68.(4)通过gibson assembly将步骤(1)中纯化回收的hpl，aor基因片段与步骤(3)中合成的核苷酸片段连接到步骤(2)双酶切回收的质粒载体pxmj19，即获得重组质粒px
lox-hpl-aor
(质粒图谱见图3)。
69.gibson assembly体系为hpl基因与aor基因片段各1.5μl，p
tac-p
tuf-p
gro-lox片段1μl，酶切线性化的质粒载体pxmj19 1μl，2
×
gibson assembly mix 5μl，反应条件为50℃1h，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，氯霉素12.5μg/ml筛选，挑取单菌落接种，提取质粒，ecorⅰ酶单酶切验证，阳性重组子测序验证。
70.2、将质粒px
lox-hpl-aor
电转入谷氨酸棒杆菌感受态细胞，氯霉素5μg/ml筛选，得到重组谷氨酸棒杆菌cg/px
lox-hpl-aor
。
71.谷氨酸棒杆菌的电转感受态细胞的制备方法为：
72.(1)将-80℃冰箱保存的谷氨酸棒杆菌cicc 10186甘油菌取20μl涂空lb平板，30℃下培养过夜。挑取平板上单菌于lb液体培养基，30℃、200r/min培养16h得到谷氨酸棒杆菌种子液。
73.(2)按10％接种比例将过夜培养的种子液接到含有3％甘氨酸和0.1％吐温的lb培养基中，30℃、200r/min培养，至od
600
为1-1.2。
74.(3)将预培养的菌液转入50ml离心管冰浴30min，4℃，5000g离心10min，去上清。
75.(4)用预冷的无菌水重悬菌体，4℃，5000g离心10min，去上清。
76.(5)重复步骤(4)2次。
77.(6)用预冷的10％甘油重悬菌体，4℃，5000g离心10min，去上清。
78.(7)重复步骤(6)2次。
79.(8)用预冷的10％甘油重悬菌体，按照每管100μl分装到预冷的1.5ml离心管，在液氮中迅速冷却5-10min，于-80℃冰箱保存。
80.电转化的具体操作为：
81.向分装在离心管的100μl电转谷氨酸棒杆菌接入2μl质粒，并转移到预冷的2mm电转杯，冰浴5min，调节电穿孔仪电压为2.5kv，用纸巾吸干样品槽的外表面，将电转杯装入电转仪，按下电击键。电击结束后，立即向电转杯接入1ml复苏培养基(lb培养基添加0.5m山梨醇，0.38m甘露醇)，重悬菌体，并一同转入1.5ml离心管，37℃，200r/min复苏3h。
82.对照例构建重组谷氨酸棒杆菌cg/pxmj19-lox
83.1、表达质粒pxmj19-lox的构建，包括以下步骤：
84.(1)以实施例1中合成的hr1-p
tac-p
tuf-p
gro-lox-hr2为模板，利用引物lox-f，lox-r扩增lox基因片段，回收纯化。上述引物序列如下：
85.lox-f：5
’‑
ttcaagtaaa tggctccctt caagggg-3’；
86.lox-r：5
’‑
ggacgccatt catacaaggt ttaatgagag aaggtcaatgt-3’87.pcr反应体系为：
88.表4
89.试剂体积引物f1μl引物r1μl10
×
buffer5μlhr1-p
tac-p
tuf-p
gro-lox-hr22μlextag0.25μldntp4μlddh2o36.75μl
90.pcr反应条件为：
91.表5
92.温度时间98℃30s98℃10s55℃30s72℃2min32cycles
93.(2)ecorⅰ和ecor
ⅴ
双酶切质粒pxmj19，回收纯化5.3kb片段。
94.双酶切体系为：
95.试剂用量质粒pxmj195μlecorⅰ，bamhⅰ1μl+1μlbuffer3μlddh2o20μl
96.双酶切条件为37℃，酶切4h。
97.(3)通过gibson assembly将步骤(1)中纯化回收的lox基因片段与实施例1中纯化回收的hpl与aor片段连接到步骤(2)双酶切回收的质粒载体pxmj19，即获得重组质粒pxmj19-lox。
98.gibson assembly体系为lox，hpl，aor基因片段各2μl，酶切线性化的质粒载体1μl，2
×
gibson assembly mix 7μl，反应条件为50℃1h，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，氯霉素12.5μg/ml筛选，挑取单菌落接种，提质粒，ecorⅰ单酶切验证，阳性重组子测序验证，得到重组谷氨酸棒杆菌cg/pxmj19-lox。
99.实施例2应用重组谷氨酸棒杆菌cg/px
lox-hpl-aor
表达食用菌中挥发性化合物1-辛烯-3-醇
100.1、重组谷氨酸棒杆菌发酵
101.(1)将实施例1的重组谷氨酸棒杆菌cg/px
lox-hpl-aor
和对照例的重组谷氨酸棒杆菌cg/pxmj19-lox分别接入lb液体培养基中培养，得到预培养的工程菌菌液。
102.(2)按10％的体积比将上述预培养菌液接入发酵培养基，30℃，200r/min 48h，得到含有1-辛烯-3-醇的发酵液。发酵培养基组成(1000ml，ph 5.0)：豆粉10g，大豆油2.5g，磷酸二铵0.2g，kh2po
4 0.068g，玉米浆8.0ml，柠檬酸盐缓冲液2.941g，矿物溶液100ml，定容至1l。
103.2、分离发酵液中的1-辛烯-3-醇
104.发酵液中1-辛烯-3-醇的分离方法为：
105.(1)取发酵液分装于离心杯，12000rpm离心10min，取上清，加入0.1m磷酸钠缓冲液(ph 6.5)及130μm亚油酸，充分混匀；
106.(2)25℃下孵育60min后，将反应混合物调节至ph 9.0(稀naoh)，100000g离心20min，取上清；
107.(3)为充分分离1-辛烯-3-醇，上清液用100ml乙醚提取两次。
108.3、检测发酵液中的1-辛烯-3-醇含量
109.发酵液中1-辛烯-3-醇含量的检测方法为：
110.(1)乙醚提取结束，取样品于离心管中，5000g离心8min，小心收集上清；
111.(2)取离心后的上清液于通风橱内蒸发，直到体积浓缩至1ml；
112.(3)通过使用hs-spme(50/30μm dvb/car/pdms spme,supelco,bellefonte,pa,usa)富集挥发物，并使用与isq-mass(thermo scientific,fair lawn,nj,usa)联用的gc trace1300气相色谱仪进行挥发性分析；
113.(4)挥发物富集后，将spme组件从瓶中抽出，并插入gc进样口，220℃下保持20min，进行挥发性解析；
114.(5)分离在db-5ms(30m
×
0.25mm
×
0.25mm)柱子内完成，载气是高纯度氦气，流速
为1.0ml/min，分割模式为2:1，注射器温度为250℃(烘箱温度程序范围为50-280℃)，升温速度为10℃/min。质谱数据由在20-500amu范围内全扫描运行的质量检测器接收。检测用的标准品1-辛烯-3-醇，gc/ms图谱见图4。
115.图5为基因重组工程菌cg/px
lox-hpl-aor
与cg/pxmj19-lox发酵培养时的1-辛烯-3-醇产量比较图。从图中可以看出，实施例1中的重组谷氨酸棒杆菌cg/px
lox-hpl-aor
能成功发酵合成产量较高的挥发性化合物。
116.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌通过向谷氨酸棒杆菌中导入脂氧合酶基因、氢过氧化物裂解酶基因、醇氧化还原酶基因以及三联启动子构建而成，其中，所述三联启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述脂氧合酶基因的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述氢过氧化物裂解酶如seq id no：3所示，所述醇氧化还原酶如seq id no：4所示。2.一种权利要求1所述的产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将脂氧合酶基因、氢过氧化物裂解酶基因、醇氧化还原酶基因以及三联启动子的核苷酸序列导入质粒载体中，构建重组质粒；将所述重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到重组工程菌。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，扩增所述氢过氧化物裂解酶的引物为：gfhpl-f：5
’‑
ttgtatgaatggcgtccgcactcagaga-3’；gfhpl-r：5
’‑
atcccttgatcatgcacgctgacgcgga-3’；扩增所述醇氧化还原酶基因的引物为：gfaor-f：5
’‑
gtgcatgatcaagggattatcacagccctgaac-3’；gfaor-r：5
’‑
caaaacagccaagctgatgtggatgattgtgcccatcg-3’；扩增所述脂氧合酶基因的引物为：lox-f：5
’‑
ttcaagtaaa tggctccctt caagggg-3’；lox-r：5
’‑
ggacgccatt catacaaggt ttaatgagag aaggtcaatgt-3’；扩增所述三联启动子的引物为：p
tac-p
tuf-p
gro-f：5
’‑
gtatcccact accgagatat gcctatcttc aagaagacgc tca-3’；p
tac-p
tuf-p
gro-r：5
’‑
caaaacagcc aagctgttac ttgaagatcg ttaccttctt acgtgtacc-3’。4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述电转条件为：所述重组质粒与所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞的体积比为1:50，电转电压为2.5kv。5.利用权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌生产1-辛烯-3-醇的方法，其特征在于，包括通过发酵培养所述重组谷氨酸棒杆菌获取发酵液，并对所述发酵液进行分离纯化，获取1-辛烯-3-醇的步骤。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的发酵培养基包括以下组分：豆粉10g，大豆油2.5g，磷酸二铵0.2g，kh2po
4 0.068g，玉米浆8.0ml，柠檬酸盐缓冲液2.941g，矿物溶液100ml，定容至1l；所述发酵培养的条件为：接种量1％-10％，转速200r/min，培养时间为24～48h。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离纯化为：将所述发酵液离心后取上清液i，并向所述上清液i加入磷酸钠缓冲液和亚油酸，混合均匀，孵育；孵育结束后，调整混合物的ph值并离心取上清液ii，再用乙醚提取所述上清液ii，收集乙醚部分，挥发乙醚，得到1-辛烯-3-醇。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磷酸钠缓冲液的浓度为0.1m，ph值为6.5；所述亚油酸的浓度为130μm；所述孵育的条件为：25℃下孵育60min。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，调整所述混合物的ph值为9.0。10.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产1-辛烯-3-醇中的应用。

技术总结
本发明公开了一种产1-辛烯-3-醇的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法和应用，属于代谢工程和食品发酵技术领域。所述重组谷氨酸棒杆菌通过向谷氨酸棒杆菌中导入脂氧合酶基因、氢过氧化物裂解酶基因、醇氧化还原酶基因以及三联启动子构建而成，其中，所述三联启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述脂氧合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述氢过氧化物裂解酶如SEQ ID NO：3所示，所述醇氧化还原酶如SEQ ID NO：4所示。该重组谷氨酸棒杆菌生产1-辛烯-3-醇产量，相比普通重组菌提高了364％，达到22mg/L，远高于其他种属相关基因工程菌的发酵水平，具有良好的产业化应用前景。具有良好的产业化应用前景。具有良好的产业化应用前景。


技术研发人员：崔凤杰 杨雨蒙 昝新艺 孙雷 孙文敬 孟利娟
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2023.08.30
技术公布日：2023/10/20