烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用的制作方法

1.本发明涉及体表愈合创面技术领域，尤其是涉及烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用。


背景技术：

2.体表创面愈合一个高度协调的过程，由止血、炎症、增殖和重塑四个重叠而连续的阶段构成。
3.正常机体发生组织损伤时，作为早期反应者的皮肤驻留肥大细胞会通过脱颗粒释放趋化因子以招募中性粒细胞，从而启动急性炎症反应，这对于加速创面愈合具有积极作用。然而，在糖尿病足、老年褥疮等体表慢性难愈性创面的愈合过程中，由于机体的生理、病理变化削弱了组织发生急性炎症反应以对抗损伤的能力，导致急性免疫反应不足，从而阻碍了伤口的正常愈合，长期慢性炎症、持续细菌感染、缺氧、胶原代谢异常、细胞迁移能力弱等特征，慢性难愈合创面的临床治疗伴随着高复发率、高截肢率和高死亡率，至今仍属于世界性难题，如何缩短受损创面愈合时间，加快受损创面愈合是伤口治疗的难题。
4.针对上述问题，一些科学家们大胆尝试利用诱导急性炎症的方法来解决慢性炎症问题，例如：用外源性神经肽处理糖尿病创面，可使创面促炎细胞因子(如mcp-1和il-6)表达增加，促进白细胞招募，从而加速了糖尿病db/db小鼠和兔子的伤口愈合动力学；用负载趋化因子il-8的明胶水凝胶处理糖尿病db/db小鼠伤口，趋化因子的释放可吸引中性粒细胞富集，从而加速创面愈合。此外，一项临床前概念性验证表明，将肥大细胞稳定剂负载于敷料时，可使创面处肥大细胞的脱颗粒能力恢复，将这种创面敷料预防性应用于糖尿病创面，能够增强损伤导致的急性免疫反应，最终减少慢性炎症，加速创面愈合。这种诱导急性免疫反应的方法虽然与传统的抑炎思路相悖，但以上这些研究证明了诱导急性炎症可以加速慢性创面的愈合。
5.然而，创面愈合各阶段具有显著不同的病理性微环境，人为诱导急性免疫反应可能会导致炎症风暴的出现，其用量控制不慎还有可能引起更为严重的持续性炎症甚至感染及脓毒症等不良反应。例如，趋化因子在损伤早期的促炎特性对创面愈合具有积极作用，而在炎症后期则严重阻碍了创面进入增殖期。
6.因此，需要提供一种安全有效的能够诱导适度炎症以启动机体经典的创面愈合程序，加快慢性难愈合创面愈合的材料应用及方法。
7.现有技术中，发明人的专利202210201086.9披露了烟草花叶病毒可以进一步激活适应性免疫系统对肿瘤细胞进行杀伤，发明人在经过多年的研究偶然发现，烟草花叶病毒可以应用在促进体表创面愈合中。


技术实现要素：

8.本发明为了解决如何安全、有效诱导适度炎症、加快慢性难愈合创面愈合的技术问题，本发明提供烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用。
9.烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用。
10.发明人经过多年研究发现：烟草花叶病毒内部的rna链，或者衣壳蛋白的组装体(不含rna的部分，又称为“病毒样纳米颗粒”)，即天然提取的烟草花叶病毒、自然突变的烟草花叶病毒、经基因工程改性、化学修饰的烟草花叶病毒、仅包含衣壳蛋白不包含rna链的烟草花叶病毒样纳米组装体均可通过与巨噬细胞表面的模式识别受体(prrs)作用去刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞，即将其用于刺激免疫细胞，尤其是巨噬细胞，可以产生促炎极化行为；并且，烟草花叶病毒只能感染烟草及其他茄科植物，生物安全性高，将其用于体表难愈性创面修复，可以产生促炎极化行为，有望在慢性创面愈合前期诱导适度炎症产生，从而启动经典创伤修复程序，加快伤口愈合。
11.进一步地，所述烟草花叶病毒包括天然提取的烟草花叶病毒、自然突变的烟草花叶病毒、经基因工程改性的烟草花叶病毒、化学修饰的烟草花叶病毒、仅包含衣壳蛋白不包含rna链的烟草花叶病毒样纳米组装体中的任意一种。
12.进一步地，所述创面为巨噬细胞功能被破坏的创面或炎症期m1型巨噬细胞缺乏的创面。
13.具体地，所述创面为大面积烧烫伤创面、压疮创面、褥疮创面、糖尿病创面、下肢静脉溃疡创面、严重感染开放创面中的一种或多种。
14.具体地，所述烟草花叶病毒的使用方法，包括以下步骤：
15.s1、将烟草花叶病毒分散在水、生理盐水或pbs中，制备蛋白浓度为5-500μg/ml的烟草花叶病毒溶液；
16.s2、将步骤s1中的烟草花叶病毒溶液滴加至填充创面；具体地，所述创面具体为：炎症期至肉芽组织填充阶段的创面。
17.s2.1、在s2中被烟草花叶病毒溶液完全填充的创面上用无菌纱布、凡士林油砂或其他基础创面敷料填充并固定，将限制所述烟草花叶病毒溶液在创面内，避免所述烟草花叶病毒溶液的浪费，且提升体表创面愈合的速度。
18.s3、间隔1h～48h，往所述创面中滴加所述s1中的烟草花叶病毒溶液至填充创面；直至创面发展至肉芽组织填充阶段结束滴加。
19.本发明相对于现有技术，有以下优点：
20.本发明提供烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，烟草花叶病毒与lps等经典m1巨噬细胞诱导物相比，烟草花叶病毒只能感染烟草及其他茄科植物，生物安全性高；能有效极化巨噬细胞为m1表型，在慢性创面愈合前期诱导适度炎症产生，从而启动经典创伤修复程序，促进体表创面愈合。
附图说明
21.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
22.图1是本发明实施例1中的db/db小鼠愈合创面过程对照图；
23.图2是本发明实施例1中的创面面积变化统计结果对照图；
24.图3本发明实施例2中第7天创面组织的he染色结果对照图；
25.图4本发明实施例3中第7天创面组织中tnf-α分布对照图；
26.图5本发明实施例4中第7天组创面组织中il-6、il-1β含量对照图；
27.图6本发明实施例5中第7天创面组织中f4/80与m1巨噬细胞标志cd86标记结果对照图；
28.图7本发明实施例6中第7天、31天的创面组织中cd31分布标记对照图；
29.图8本发明实施例7中第31天的创面组织的he染色结果对照图；
30.图9本发明实施例8中第31天的创面组织的masson染色结果对照图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例1-8说明本发明的具体技术方案：
32.先将所述烟草花叶病毒分散在水、生理盐水或pbs中制成蛋白浓度为100μg/ml的烟草花叶病毒溶液。
33.实施例1：
34.s1.1、随机选取12只db/db小鼠，使用异氟烷对选取的db/db小鼠进行麻醉；使用电动剃毛刀对db/db小鼠背部进行剃毛后，使用镊子和剪刀在db/db小鼠背部体表皮肤制造一个直径约为25mm的，不免伤及肌肉组织的圆形伤口；
35.s1.2、将经步骤s1处理过的db/db小鼠进行随机分为对照组和实验组(即烟草花叶病毒tmv组)，每组为6只；
36.s2、对照组和实验组的db/db小鼠伤口上分别滴加滴加100μl的生理盐水以及100μl浓度为100μg/ml的烟草花叶病毒溶液；填充3m透明透气敷料，放回笼中继续饲养。
37.s2.1、在s2中被烟草花叶病毒溶液完全填充的创面用3m透明透气敷料、无菌纱布或凡士林油纱或其他基础创面敷料覆盖并固定，放回笼中继续饲养；
38.s3、间隔1h～48h，观察至所述创面上的烟草花叶病毒溶液未完全填充创面时(即被吸收后)，掀开所述基础创面敷料，往所述创面中滴加所述s1中的烟草花叶病毒溶液，直至创面发展至肉芽组织填充阶段。
39.s4、连续30天观察db/db小鼠伤口并在第0、7、13、21、30天对所述db/db小鼠伤口拍照记录，统计结果如图1所示；
40.s5、统计伤后0、7、13、21、30的创面面积，通过图像处理软件计算不同时间点所占初始伤口面积的百分比，统计结果如图2所示。
41.由图1-2中可以看出，实验组与对照组相比，实验组的db/db小鼠创面愈合速率更快；相同大小的创面面积修复过程中，实验组的第7、13、21、30天的创面面积相比于对照组更小，原因在于烟草花叶病毒刺激了巨噬细胞，极化巨噬细胞为m1表型，在慢性创面愈合前期诱导适度炎症产生，启动经典创伤修复程序，因此加快伤口愈合。
42.实施例2：
43.采用he染色法校验所述烟草花叶病毒在体表创面中的应用效果。
44.选取6只实施例1中的db/db小鼠伤后7天处死，分为实验组和对照组，每组各3只，分别对创面组织进行取材、固定，切片成3mm厚的组织切片样本；对所述组织切片样本按顺序进行以下操作；
45.s1、70％、80％、95％、100％乙醇梯度脱水各30分钟；
46.s2、1l二甲苯处理各20分钟，石蜡浸蜡两缸各12分钟后包埋，切片4μm，烤片。
47.s3、1.5l二甲苯分三次脱蜡，每次8分钟；
48.s4、500ml的1l无水乙醇处理两次，每次8分钟；
49.s5、90％、80％、60％乙醇各处理8分钟。
50.s6、苏木精染色4分钟，流水清洗；
51.s7、盐酸乙醇分化2-3秒，流水清洗；
52.s8、0.5％氨水处理20秒，流水清洗。
53.s9、0.5％伊红染色1分钟；
54.s10、80％、90％乙醇各分化3-5秒；
55.s11、95％乙醇处理5分钟；1.5l无水乙醇分三次处理，每次5分钟；
56.s12、1l二甲苯处理两次，每次5分钟；
57.s13、中性树脂胶封固，光学显微镜下观察创面肉芽组织、成纤维细胞等结构的生长情况。
58.结果如图3所示，he染色结果显示，实验组(即图3中的tmv组)比对照组(即图3中的control组)有更为明显的炎性细胞浸润。
59.实施例3：.
60.实施例2中的组织切片样本用pbs洗涤，室温下用山羊血清封闭，随后用abp0127-tnf-α多克隆抗体孵育3小时后，用pbs洗涤组织切片样本，并用相应的荧光二抗对新生血管进行标记，同时用含有dapi的封片剂封片。通过激光共聚焦显微镜获取图像，分别标记细胞核与tnf-α。
61.结果如图4所示。实验组(即图4中的tmv组)的标记数量多高于对照组(即图4中的control组)，说明实验组的创面中有更丰富的炎症因子表达。
62.实施例4：.
63.选取部分实施例2中的db/db小鼠组织切片样本制作组织匀浆，通过酶联免疫吸附试剂盒测定组织匀浆中单位蛋白质量中炎症因子il-6、炎症因子il-1β的浓度，制图。
64.结果如图5所示，实验组(即图5中的control组)与对照组(即图5中的tmv组)相比，实验组的炎症因子il-6与炎症因子il-1β显著高于对照组，说明烟草花叶病毒浸润过的的创面，有更丰富的炎症因子表达，烟草花叶病毒能够诱导适度炎症产生。
65.实施例5：
66.选取部分实施例3中的组织切片样本，分为对照组和实验组，用pbs缓冲液洗涤，室温下用山羊血清封闭，随后用纯化的抗db/db小鼠f4/80抗体、大鼠抗cd86单克隆抗体孵育3小时后，用pbs缓冲液洗涤切片，并用相应的荧光二抗对新生血管进行标记，同时用含有dapi的封片剂封片。通过激光共聚焦显微镜获取图像，分别标记细胞核、成熟db/db小鼠巨噬细胞标志物f4/80以及m1型巨噬细胞标志物cd86。
67.结果如图6所示，实验组(即图6中的tmv组)与对照组(即图6中的control组)相比，实验组中m1型巨噬细胞标志物cd86有更为丰富的表达，含量更多，说明烟草花叶病毒在创面组织中能够通过刺激m1型巨噬细胞产生而促进慢性创面愈合。
68.实施例6：
69.创面制作后的第31天，选取6只实施例1中db/db小鼠处死，，按照实施例2中的方法获得组织切片样本b。与实施例2中组织切片样本一同用pbs溶液洗涤，室温下用山羊血清封
闭，随后用兔cd31多克隆抗体孵育3小时后，用pbs溶液洗涤切片，并用相应的荧光二抗分别标记细胞核、新生血管，同时用含有dapi的染色封片剂封片，通过激光共聚焦显微镜获取图像。
70.结果如图7所示，实验组(即图7中的tmv组)与对照组(即图7中的control组)相比，实验组cd31表达丰富，说明烟草花叶病毒对慢性创面的血管生成有促进作用。
71.实施例7：
72.将实施例5中的组织切片样本b部分按照实施例2中的方法进行he染色。
73.结果如图8所示，实验组(即图8中的tmv组)与对照组(即图8中的control组)相比，对照组仍有大量炎性细胞浸润，而实验组的新生血管丰富，几乎观察不到炎性细胞存在。
74.实施例8：
75.将实施例5中的石蜡切片脱蜡至水后，依次用自来水和蒸馏水洗涤后，作如下处理：
76.s1、用regaud氏苏木精染色液或weigert苏木精液将细胞核染色5-10分钟
77.s2、使用蒸馏水充分清洗洗涤；
78.s3、使用masson丽春红酸性复红液溶解5-10分钟；
79.s4、2％冰醋酸水溶液浸泡，1％磷钼酸水溶液分化3-5分钟；
80.s5、用苯胺蓝或浅绿色溶液染色5分钟后，用0.2％冰醋酸水溶液浸泡；
81.s6、95％酒精，无水酒精，透明二甲苯处理后，用中性胶密封，获得的masson染色组织切片。
82.结果如图9所示，实验组(即图9中的tmv组)与对照组(即图9中的control组)相比，实验组胶原沉积更丰富，创面愈合更好。
83.综合实施例1-8可以得知，烟草花叶病毒能有效地促进db/db小鼠的体表伤口愈合，在炎症期能够促进炎性细胞浸润伤口，丰富炎症因子与cd86的表达；至肉芽组织填充阶段能够促进创面血管新生，丰富胶原沉积促进体表创面愈合；并且烟草花叶病毒促进体表创面愈合的应用简单快捷，能够快速有效地促进体表创面愈合。
84.以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用。2.根据权利要求1所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于：所述烟草花叶病毒包括天然提取的烟草花叶病毒、自然突变的烟草花叶病毒、经基因工程改性、化学修饰的烟草花叶病毒、仅包含衣壳蛋白不包含rna链的烟草花叶病毒样纳米组装体中的任意一种。3.根据权利要求1所述烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于：所述创面为巨噬细胞功能被破坏的创面或炎症期m1型巨噬细胞缺乏的创面。4.根据权利要求1所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于：所述创面为大面积烧烫伤创面、压疮创面、褥疮创面、糖尿病创面、下肢静脉溃疡创面、严重感染开放创面中的任意一种。5.根据权利要求1所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于，所述烟草花叶病毒的使用方法，包括以下步骤：s1、将烟草花叶病毒分散在溶剂中，制备烟草花叶病毒溶液；s2、将步骤s1中的烟草花叶病毒溶液滴加或填充于创面。6.根据权利要求5所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于：所述步骤s2中，所述创面具体为：炎症期至肉芽组织填充阶段的创面。7.根据权利要求5所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于：所述步骤s1中，所述溶剂为水、生理盐水或pbs中的任意一种。8.根据权利要求5所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于：所述步骤s1中，所述烟草花叶病毒溶液的蛋白浓度为5-500μg/ml。9.根据权利要求5所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于，还包括：步骤s2.1、在s2中被烟草花叶病毒溶液完全填充的创面上用基础创面敷料覆盖并固定。10.根据权利要求5所述的烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，其特征在于，还包括步骤s3、间隔1h～48h，往所述创面中滴加所述s1中的烟草花叶病毒溶液至填充创面；直至创面发展至肉芽组织填充阶段，结束滴加。

技术总结
本发明提供烟草花叶病毒在促进体表创面愈合中的应用，烟草花叶病毒只能感染烟草及其他茄科植物，生物安全性高，且能有效极化巨噬细胞为M1表型，为巨噬细胞功能受损、巨噬细胞表型失衡、早期炎症反应不足的慢性创面提供适度的炎症微环境，从而启动经典创伤修复程序，促进体表创面愈合。促进体表创面愈合。促进体表创面愈合。


技术研发人员：朱萌 田野 廖碧雁
受保护的技术使用者：国科瑞诺（中山）生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.29
技术公布日：2023/10/20