一种sgRNA文库细胞池构建及覆盖度检测方法与流程

一种sgrna文库细胞池构建及覆盖度检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种sgrna文库细胞池构建及覆盖度检测方法。


背景技术：

2.crispr cas9基因编辑技术是继zfn(锌指核酸酶)、talens(转录激活因子样效应物核酸酶)等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术。crispr-cas9技术以其设计简单、效率高、成本低、易操作等优势，成为目前最主流的基因编辑系统。crispr cas9基因编辑系统由crrna、tracrrna(反式激活crrna)和cas9蛋白三部分组成，其中crrna有一段20nt的基因导向序列，用于定位基因的编辑位点。crrna与tracrrna互补结合后被激活并与cas9蛋白结合形成编辑复合体，在crrna的小的基因导向序列引领下，编辑复合体靶定至目的基因dna序列，cas9蛋白与该基因dna序列结合并进行相应的基因编辑。为方便应用，将crrna与tracrrna序列通过基因工程的方法融合在一起且具备二者功能，工程化后的序列被称为sgrna(single-guide rna)。
3.sgrna同样具有一段20nt的基因导向序列，将若干基因的sgrna序列重组连接至目的载体上的集合被称为sgrna文库。将sgrna文库转入若干细胞或组织可以实现多基因的同时编辑，主要应用于基因功能探究、药物靶点筛选等基础研究或医疗靶向研究。sgrna文库是基于crispr cas9基因编辑技术下高通量筛选的工具，实现sgrna文库应用的第一步即将sgrna文库转入目的细胞，成功转入sgrna文库的细胞群被称为sgrna文库细胞池。
4.sgrna文库细胞池最主要的质量指标是sgrna序列覆盖度，覆盖度越高，后续辅助研究结果越可靠。sgrna序列覆盖度的高低取决于sgrna文库细胞池的构建和检测方法。虽然目前已有部分文章报道了有关sgrna文库细胞池构建及检测方法，但目前为止，并没有一套通用的流程操作适用于任何哺乳动物细胞池构建及检测，这导致大多数构建的细胞池覆盖度在1％-50％之间。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种sgrna文库细胞池构建及覆盖度检测方法，采用sgrna文库细胞池构建方法和sgrna序列覆盖度检测方法结合下文库细胞池sgrna序列覆盖度能够稳定在85％-98％之间，且操作简单高效，重现性好，适用于任何哺乳动物细胞为目的细胞的sgrna文库细胞池的构建及检测。
6.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种sgrna文库细胞池构建方法，具体包括如下步骤：
8.步骤1：将sgrna文库质粒进行慢病毒包装，获得sgrna文库慢病毒；
9.步骤2：将步骤1获得的sgrna文库慢病毒感染目的细胞24h，然后更换新鲜的无病毒培养基继续培养感染目的细胞30-60h，至文库慢病毒携带的sgrna及cas9蛋白表达；
10.步骤3：将步骤2获得的细胞置于抗性培养皿上筛选培养5-10天，存活下来的细胞
集合即为sgrna文库细胞池。
11.为提高构建效率，细胞培养及筛选的过程在15cm培养皿上展开；获得的sgrna文库细胞池在抗性培养基上继续进行不超过5天的培养，不影响细胞池sgrna序列覆盖度。
12.优选地，步骤2中sgrna文库慢病毒按照moi为0.2-0.5感染目的细胞，保证病毒感染效率的同时确保一个病毒感染一个细胞；更优选地，moi设置为0.3-0.5。
13.优选地，步骤2中更换新鲜的无病毒培养基继续培养目的细胞的培养最优时间点为48h。
14.优选地，sgrna文库慢病毒滴度大于等于1
×
108tu/ml。
15.第二方面，本发明提供一种sgrna序列覆盖度检测方法，所述检测方法包括：利用第一方面所述的构建方法构建sgrna文库细胞池，并进行sgrna序列覆盖度检测。
16.优选地，所述检测方法包括：基因组dna提取、pcr扩增建库和ngs上机检测。
17.优选地，基因组dna提取所需细胞样本数量应为sgrna序列数的300-500倍，基因组dna的浓度需大于等于150ng/μl。例如：sgrna序列数为1
×
10^5，则基因组dna提取样本细胞需求量为3
×
10^7-5
×
10^7个细胞。
18.优选地，pcr扩增建库为二步法：
19.第一步：以sgrna文库细胞池的基因组dna为模板进行第一轮pcr扩增，单个反应模板量为1-1.5μg，每个样本的反应数为10，反应程序的循环数在15-18之间；
20.第二步：以第一步10个pcr扩增反应产物的混合物为模板进行第二轮pcr扩增，单个反应模板量为2μl，每个样本的反应数为6-9，反应程序的循环数在18-20之间。
21.优选地，二步法pcr扩增建库中第一步扩增使用的引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示。
22.zp1(seq id no:1)：acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgtggaaaggacgaaacacc zp2(seq id no:2)：gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcggtgccactttttcaagtt
23.第三方面，本发明提供一种用于构建sgrna文库细胞池的试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的构建方法进行sgrna文库细胞池构建。
24.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
25.本发明通过采用sgrna文库细胞池构建方法和文库细胞池sgrna序列覆盖度检测方法相结合，使得sgrna序列覆盖度最高可达98％。与现有技术相比，本发明从sgrna文库细胞池构建到sgrna序列覆盖度检测进行全流程优化，具有重现性好、操作简单、耗时短、效率高、综合成本低等优势，适用于任何哺乳动物细胞为目的细胞的sgrna文库细胞池的构建及检测，为功能性细胞研究、药物、肿瘤等医疗靶点筛选提供有利工具。
附图说明
26.图1为本发明的操作流程模式图；a为sgrna文库细胞池构建流程，b为二步pcr扩增建库法结合下的ngs测序流程。
27.图2为实施例2中pcr扩增建库第二步扩增产物电泳展示图。m泳道为dnamarker，1-6号泳道为阴性对照的pcr产物电泳结果，7-12号泳道为实验组的pcr产物电泳结果；目的序列条带大小约250bp，框出的为理论目的条带。
28.图3为实施例2中pcr扩增建库第二步扩增产物电泳胶过柱回收产物的检测结果。m
泳道为dnamarker，1号泳道为阴性对照的电泳结果，2号泳道为实验组的电泳结果；目的序列条带大小约250bp，框出的为理论目的条带。
具体实施方式
29.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
30.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
31.实施例1：sgrna文库细胞池构建
32.本实施例将人类基因组的crispr sgrna敲除文库质粒转入目的细胞hepg2(科佰生物)，构建人类基因组的crispr sgrna敲除文库hepg2细胞池，具体步骤如下：
33.(1)获取人类基因组的crispr sgrna敲除文库质粒(泓迅生物自行构建)。该文库sgrna序列理论数目为74987条，ngs检测实际sgrna序列数目为74974条。文库质粒载体为lenticrispr v2，该载体同时含有cas9和sgrna，带有puromycin(嘌呤霉素，puro)的筛选抗性。
34.(2)慢病毒包装。取200μg步骤(1)文库质粒进行慢病毒包装，所得sgrna文库慢病毒滴度为1
×
108tu/ml。
35.(3)文库慢病毒感染效率测试。将预先孵育培养的hepg2细胞按照2
×
10^5/孔的细胞量分置于6孔板中，然后分别按照moi为0.3、0.5及1加入文库慢病毒同时加入基因转染增强剂polybrene(聚凝胺，终浓度为8μg/ml)，每个moi设置3个重复并编号1#、2#、3#，上述培养24h后，更换不含文库慢病毒及polybrene的新鲜培养基继续培养48h。
36.将培养的细胞进行针对cas9蛋白的if(免疫荧光)染色实验，if染色方法为通用的染色方法。通过检测带有荧光信号的细胞数占总细胞数的比例(百分比)来确定文库慢病毒的感染效率，百分数表示带有荧光信号的细胞占全部细胞的百分比，百分比越高表明感染效率越高。检测结果如表1所示。
37.表1
[0038][0039]
根据上表结果可知，moi为0.3的理论感染效率30％，实际检测值为27.27％，实际感染效率为27.27％
÷
30％＝90.9％；moi为0.5的理论感染效率为50％，实际检测值为44.43％，实际感染效率为44.43％
÷
50％＝88.86％；moi为1的理论感染效率为100％，实际检测值为91.8％，实际感染效率为91.8％
÷
100％＝91.8％。综上，文库慢病毒感染效率为(90.9％+88.86％+91.8％)
÷
3＝90％。
[0040]
(4)puro最优抗性筛选浓度测试。hepg2细胞在施加puro下培养至5-10天内全部死亡的浓度视为puro筛选的最优浓度。设置对hepg2细胞施加puro压力的浓度梯度如下：1.0μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、4.5μg/ml、9μg/ml，每个重复设置1*10^7个细胞，观察并记录不同浓度压力下，hepg2细胞全部死亡的时间。实验结果如表2所示。
[0041]
表2
[0042]
[0043]
由上表可知，施加浓度为2.0μg/ml的puro第7天，细胞全部死亡；施加浓度为2.5μg/ml的puro第5天，细胞全部死亡；施加浓度为1.5μg/ml的puro第10天，细胞全部死亡。这3个浓度均在最优浓度选择范围内。
[0044]
施加浓度为1μg/ml的puro第10天，还有10％的细胞存活；分别施加浓度为4.5μg/ml、9μg/ml的puro第3天，细胞均全部死亡。这几个浓度梯度均不在最优浓度选择范围内。
[0045]
综上，该文库细胞池构建所需puro筛选的最优浓度为1.5μg/ml、2.0μg/ml和2.5μg/ml。随机选2.5μg/ml的puro进行下一步实验。
[0046]
(5)文库慢病毒及所需hepg2细胞数目评估。文库慢病毒在感染hepg2细胞实验前需确定施加病毒量和细胞数量。该文库质粒的sgrna序列数为74987条，按照每条sgrna序列500倍的系数构建细胞池，需要的文库慢病毒量为：74987
×
500＝3.7
×
10^7；慢病毒感染效率为90％，实际所需文库慢病毒量为3.7
×
10^7/90％＝4.1
×
10^7。以文库慢病毒moi为0.3感染细胞，所需细胞数目为4.1
×
10^7/0.3＝1.23
×
10^8个细胞。
[0047]
(6)文库慢病毒感染hepg2细胞。将hepg2细胞培养至步骤(5)所述的细胞数量后施加步骤(5)所述文库慢病毒量，感染24h后更换无慢病毒的新鲜培养基继续培养48h。然后更换含有2.5μg/ml puro抗性的新鲜培养基筛选、培养5天，存活下来的细胞群即为人类全基因组的crispr sgrna敲除文库细胞池。为保证实验的准确性，添加未转染文库慢病毒的hepg2细胞作为空白对照。puro抗性筛选培养的活细胞比例记录如表3所示。
[0048]
表3
[0049][0050]
由表3可知，当空白对照在puro抗性培养基上筛选培养的第5天细胞全部死亡，实验组即施加文库慢病毒感染的细胞在施加puro抗性培养的第5天有约28％的细胞存活，表明有28％的细胞被成功转入质粒。
[0051]
因moi为0.3的理论感染率为30％，28％基本接近30％，因此推测1个有效病毒基本感染了1个细胞，与预期相符。
[0052]
实施例2：sgrna序列覆盖度检测
[0053]
本实施例为实施例1人类基因组的crispr sgrna敲除文库细胞池的sgrna序列覆盖度检测。本实施例检测方法包括基因组dna提取、pcr扩增建库及ngs上机检测三部分，其中pcr扩增建库为二步法扩增。具体步骤如下：
[0054]
(1)基因组dna提取。从实施例1构建的文库细胞池中取1
×
10^7个细胞作为实验组，取未经慢病毒感染的1
×
10^7个hepg2细胞作为对照组，分别按照基因组dna提取试剂盒
(天根)进行基因组dna提取，所得基因组dna浓度为200ng/μl。
[0055]
(2)pcr扩增建库。pcr扩增中的hotstart酶购自赛默飞世尔科技公司。第一步扩增目的为扩大目的序列量。以1μg基因组dna为模板进行扩增，实验组和对照组分别扩增10个反应，单个扩增反应体系如表4所示，反应程序如表5所示。扩增所用引物序列如下：
[0056]
zp1(seq id no:1):acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgtggaaaggacgaaacacc
[0057]
zp2(seq id no:2):gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcggtgccactttttcaagtt
[0058]
表4
[0059]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板5hotstart酶1ddh2o31总计50
[0060]
注：dntp为脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，包括datp、dgtp、dttp、dctp等在内的统称，即扩增目的序列的材料。
[0061]
表5
[0062][0063]
第二步扩增目的为添加ngs上机检测标签序列。将以实验组和对照组第一步pcr扩增的10个反应产物分别混合，然后分别从混合物中取2μl为模板进行扩增，每组扩增6个反应，每个反应体系如表6所示，反应程序如表7所示。其中实验组第二步扩增引物为zp3和zp4；对照组第二步扩增引物为zp3和zp5。所用引物序列如下：
[0064]
zp3(seq id no:3):
[0065]
aatgatacggcgaccaccgagatctacactatagcctacactctttccctacacgacgctcttccgatct
[0066]
zp4(seq id no:4):
[0067]
caagcagaagacggcatacgagatcgagtaatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct
[0068]
zp5(seq id no:5)：
[0069]
caagcagaagacggcatacgagattctccggagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct
[0070]
表6
[0071]
组分体积(ul)5
×
缓冲液10dntp1zp31zp41模板2hotstart酶1ddh2o34
[0072]
表7
[0073][0074]
将第二步扩增产物进行凝胶电泳，目的序列条带大小约250bp(如图2所示)，将带有目的序列的凝胶切下进行序列回收，回收方法为通用的试剂盒回收法(凯杰胶回收试剂盒)。取5μl回收产物进行凝胶电泳检测(如图3所示)，进行上机测序，测序结果分析如表8所示。
[0075]
表8
[0076][0077]
由表8可知，实验组覆盖度高达98.7％，均一性为13.7，这表明98.7％的sgrna成功感染至hepg2细胞中；对照组的覆盖度为4.93％，这可能是非特异性扩增引起的，该数值可以忽略。
[0078]
综上，利用实施例1所述的sgrna文库细胞池构建方法和实施例2所述的序列覆盖度检测方法结合下的细胞池sgrna序列覆盖度高达98％。
[0079]
实施例3
[0080]
取实施例1构建的crispr sgrna敲除文库细胞池，依据实施例1中步骤(4)puro最优抗性筛选浓度测试结果设置如下实验：
[0081]
实验1
[0082]
puro浓度为1μg/ml筛选测试空白对照细胞在第11天全部死亡，因此在puro筛选第11天收集细胞池参照实施例2检测方法进行序列覆盖度测试。
[0083]
实验2
[0084]
puro浓度为1.5μg/ml筛选测试空白对照细胞在第10天全部死亡，因此在puro筛选第10天收集细胞池参照实施例2检测方法进行序列覆盖度测试。
[0085]
实验3
[0086]
puro浓度为2.0μg/ml筛选测试空白对照细胞在第7天全部死亡，因此在puro筛选第7天收集细胞池参照实施例2检测方法进行序列覆盖度测试。
[0087]
实验4
[0088]
puro浓度为2.5μg/ml筛选测试空白对照细胞在第5天全部死亡，因此在puro筛选第5天收集细胞池参照实施例2检测方法进行序列覆盖度测试。
[0089]
实验5
[0090]
puro浓度为4.5μg/ml筛选测试空白对照细胞在第3天全部死亡，因此在puro筛选第3天收集细胞池参照实施例2检测方法进行序列覆盖度测试。
[0091]
实验6
[0092]
puro浓度为9μg/ml筛选测试空白对照细胞在第2天全部死亡，因此在puro筛选第2天收集细胞池参照实施例2检测方法进行序列覆盖度测试。
[0093]
上述实验1-6的结果如表9所示。
[0094]
表9
[0095][0096][0097]
如表9所示，puro浓度为1μg/ml，筛选为11天时，覆盖度为88.2％；
[0098]
puro浓度在1.5-2.5μg/ml之间时，筛选时间为7-10天，覆盖度相对较高且趋于稳定在94％左右；当puro浓度在4.5-9μg/ml之间时，筛选时间为2-3天，覆盖度明显降低至32.1％-39.7％。
[0099]
综上，文库细胞池的sgrna序列覆盖度受抗性筛选浓度的影响，筛选时间控制在5-10天以内的抗性筛选浓度为最优筛选浓度，过高或过低均会导致sgrna序列覆盖度降低。
[0100]
实施例4
[0101]
本实施例取实施例1构建的crispr sgrna敲除文库细胞池，对比了实施例1步骤(6)中以2.5μg/ml的puro筛选培养不同时间段对文库细胞池序列覆盖度的影响，参照实施例2检测方法进行序列覆盖度测试，结果如表10所示。
[0102]
表10
[0103]
puro筛选天数(day)sgrna序列覆盖度
593.2％792.1％1094.6％1289.7％1588.9％
[0104]
根据表10所示，puro抗性下筛选、培养5-10天，sgrna序列覆盖度在92.1％-94.6％之间，几乎不受影响；培养超过10天，随着培养天数增加，覆盖度开始逐渐下降。
[0105]
综上，以2.5μg/ml的puro浓度筛选第5天对照细胞全部死亡，在其基础上文库细胞池继续培养5天几乎不影响sgrna序列覆盖度，超过5天，覆盖度开始下降。由此可知，在细胞筛选最优时间点上继续培养1-5天不影响文库细胞池的覆盖度。
[0106]
实施例5
[0107]
本实施例参照实施例1步骤(6)中文库慢病毒感染目的细胞24h后，更换无慢病毒及polybrene的新鲜培养基培养不同时间段再进行puro筛选对感染效率的影响。本实施例的其它步骤均与实施例1一致，文库慢病毒的moi为0.3，理论感染效率为30％。结果如表11所示。
[0108]
表11
[0109]
培养时间(h)感染效率05.2％1211.3％2425.7％3627.6％4829.2％6031.8％7240.57％8448.9％
[0110]
如表11所示，文库慢病毒感染24h后，转移至无慢病毒及polybrene的新鲜培养基培养0-24h后进行抗性筛选的感染效率在5.2％-25.7％之间，明显低于30％；培养36-60h后的感染效率在27.6％-31.8％之间，接近30％，其中，培养48h后的感染效率为29.2％，最为接近30％；培养72-84h后的感染效率在40.57％-48.9％之间，明显高于30％。
[0111]
综上，文库慢病毒感染24h后，转移至无慢病毒及polybrene的新鲜培养基培养36-60h为最优培养时间范围，培养48h为最优时间点。
[0112]
实施例6
[0113]
本实施例参照实施例2的sgrna文库细胞池的序列覆盖度检测的pcr扩增建库方法，对比了第一步pcr扩增反应不同模板量下，对第二步pcr扩增产物及sgrna序列覆盖度检测效果的影响，结果如表12所示。
[0114]
表12
[0115]
模板量(μg)第二步pcr扩增产物sgrna序列覆盖度0.5正常30.2％1正常95.7％
1.5正常94.8％2.5未检测出/
[0116]
如表12所示，模板量为1-1.5μg时的覆盖度为94.8％-95.7％，为最优区间；模板量过低会导致sgrna覆盖度降低，如0.5μg；模板量过高会影响第二步pcr扩增。
[0117]
综上，第一步pcr扩增反应的最优模板量为1-1.5μg。
[0118]
实施例7
[0119]
本实施例参照实施例2的sgrna文库细胞池的序列覆盖度检测中的pcr扩增建库方法，对比了第一步pcr扩增不同模板浓度下sgrna序列覆盖度检测效果。
[0120]
实验1模板浓度为30ng/μl时的反应体系如表13。
[0121]
表13
[0122]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板33hotstart酶1ddh2o3总计50
[0123]
实验2模板浓度为50ng/μl时的反应体系如表14。
[0124]
表14
[0125]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板20hotstart酶1ddh2o16总计50
[0126]
实验3模板浓度为100ng/μl时的反应体系如表15。
[0127]
表15
[0128]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板20
hotstart酶1ddh2o16总计50
[0129]
实验4模板浓度为150ng/μl时的反应体系如表16。
[0130]
表16
[0131]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板7hotstart酶1ddh2o29总计50
[0132]
实验5模板浓度为200ng/μl时的反应体系如表17。
[0133]
表17
[0134]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板5hotstart酶1ddh2o31总计50
[0135]
实验6模板浓度为300ng/μl时的反应体系如表18。
[0136]
表18
[0137]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板4hotstart酶1ddh2o32总计50
[0138]
实验7模板浓度为400ng/μl时的反应体系如表19。
[0139]
表19
[0140]
组分体积(μl)5
×
缓冲液10dntp1zp11zp21模板2.5hotstart酶1ddh2o33.5总计50
[0141]
上述7组不同模板浓度下的sgrna序列覆盖度检测结果如表20所示。
[0142]
表20
[0143]
模板浓度sgrna序列覆盖度30ng/μl23.8％50ng/μl54.1％100ng/μl72.5％150ng/μl96.6％200ng/μl98.1％300ng/μl94.8％400ng/μl96.1％
[0144]
如表20所示，pcr扩增模板总量为1μg，随着模板浓度升高，sgrna覆盖度逐渐升高，如模板浓度从30ng/μl提升至200ng/μl时，sgrna序列覆盖度从23.8％提升至98.1％；模板浓度在150-400ng/μl时，覆盖度趋于稳定，在94.8％-98.1％左右。
[0145]
综上，pcr扩增建库第一步pcr扩增反应中，模板浓度范围为≧150ng/μl。
[0146]
实施例8
[0147]
本实施例参照实施例2的sgrna文库细胞池的序列覆盖度检测中的pcr扩增建库方法，对比了第一步pcr扩增不同反应数下sgrna序列覆盖度检测效果，结果如表21所示。
[0148]
表21
[0149]
第一步pcr扩增反应数覆盖度11.22％323.4％546.8％1095.7％2096.23％3097.10％
[0150]
如表21所示，第一步pcr扩增反应数为1、3、5时，覆盖度分别为1.22％、23.4％、46.8％，覆盖度均＜50％；第一步pcr扩增反应数为10、20、30时，覆盖度分别为95.7％、96.7％、97.10％，可见反应数为20、30的覆盖度与反应数为10的覆盖度差异不大，推测该sgrna文库细胞池的覆盖度约为97.10％。
[0151]
综上，基于工作成本、工作周期及覆盖度可靠性考虑，第一步pcr扩增反应数为10为最优设置。
[0152]
实施例9
[0153]
本实施例参照实施例2的sgrna文库细胞池的序列覆盖度检测中的pcr扩增建库方法，对比了第二步pcr扩增不同反应数下sgrna序列覆盖度的检测效果，结果如表22所示。
[0154]
表22
[0155]
第二步pcr扩增反应数覆盖度153.8％374.2％694.8％995.1％1290.7％
[0156]
如表22所示，第二步pcr扩增反应数在1-3之间时，sgrna覆盖度在53.8％-74.2％左右；第二步pcr扩增反应数在6-9之间时，sgrna覆盖度明显升高在94.8％-95％左右；第二步pcr扩增反应数超过9，sgrna覆盖度会下降至90.7％左右。
[0157]
综上，pcr建库中第二步pcr扩增反应数会影响文库细胞池的覆盖度，第二步pcr扩增反应最优反应数在6-9之间。
[0158]
对比例1
[0159]
本对比例提供一种sgrna文库细胞池覆盖度检测方法，本方法与实施例2的区别仅在于，本对比例检测方法pcr扩增建库采用一步法建库，其余步骤参照实施例2。所述一步法为进行一次pcr扩增，所得扩增产物可直接进行ngs上机检测。关键步骤为先将8条反向引物ngs-ko-r1至ngs-ko-r8进行等比例混合，混合物中每条引物终浓度均为20pmol/μl，所得反向引物混合物作为一步法扩增的反向引物；ngs-ko-f1作为一步法建库pcr扩增的正向引物。pcr扩增体系如表23所示，反应程序如表24所示。
[0160]
一步法建库引物序列如下：
[0161]
ngs-ko-f1(seq id no:6)：
[0162]
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttatagcctgctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacc
[0163]
ngs-ko-r1(seq id no:7)：
[0164]
caagcagaagacggcatacgagatcgagtaatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgccactttttcaa
[0165]
ngs-ko-r2(seq id no:8)：
[0166]
caagcagaagacggcatacgagattctccggagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgcca
[0167]
ctttttcaa
[0168]
ngs-ko-r3(seq id no:9)：
[0169]
caagcagaagacggcatacgagataatgagcggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgcca
[0170]
ctttttcaa
[0171]
ngs-ko-r4(seq id no:10)：
[0172]
caagcagaagacggcatacgagatggaatctcgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgcca
[0173]
ctttttcaa
[0174]
ngs-ko-r5(seq id no:11)：
[0175]
caagcagaagacggcatacgagatttctgaatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgccact
[0176]
ttttcaa
[0177]
ngs-ko-r6(seq id no:12)：
[0178]
caagcagaagacggcatacgagatacgaattcgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgccac
[0179]
tttttcaa
[0180]
ngs-ko-r7(seq id no:13)：
[0181]
caagcagaagacggcatacgagatagcttcaggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgcca
[0182]
ctttttcaa
[0183]
ngs-ko-r8(seq id no:14)：
[0184]
caagcagaagacggcatacgagatgcgcattagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccgactcggtgcca
[0185]
ctttttcaa
[0186]
表23
[0187]
组分体积(μl)ddh2o23.55
×
pcr缓冲液1010mm dntp1正向引物(20pmol/μl)1反向引物(20pmol/μl)1hotstart酶1模板12.5总计50
[0188]
表24
[0189][0190]
测序结果分析如表25所示，序列分析结果如表26所示。
[0191]
表25
[0192][0193]
根据上述测序结果分析显示，一步法建库的sgrna序列覆盖度为97.44％，二步法建库的sgrna序列覆盖度为98.7％。这表明二步法建库的覆盖度略高于一步法建库的覆盖度，但是没有明显差异。
[0194]
表26
[0195]
样品名称sgrna序列编号sgrna序列序列名读数一步法建库74879gtcaccaatcctgtccctagseq id no:1517468二步法建库74879gtcaccaatcctgtccctagseq id no:16459
[0196]
根据上述序列分析结果显示，一步法建库中第74879号sgrna序列读数为17468，远高于理论值500；二步法建库中第74879号sgrna序列读数为459，接近500。这表明二步法建库下检测的sgrna序列覆盖倍数比一步法建库的更为准确。
[0197]
综上，本发明使用的二步法扩增建库下的ngs检测结果优于一步法扩增建库。
[0198]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种sgrna文库细胞池构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：步骤1：将sgrna文库质粒进行慢病毒包装，获得sgrna文库慢病毒；步骤2：将所述sgrna文库慢病毒感染目的细胞24h，然后更换新鲜的无病毒培养基继续培养所述目的细胞30-60h；步骤3：将步骤2获得的细胞置于抗性培养基上筛选、培养5-10天，存活下来的细胞集合即为所述sgrna文库细胞池。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述sgrna文库慢病毒按照moi为0.2-0.5感染目的细胞；优选地，所述moi为0.3-0.5。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中更换新鲜的无病毒培养基继续培养所述目的细胞的培养时间为48h。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna文库慢病毒滴度大于等于1
×
108tu/ml。5.一种sgrna序列覆盖度检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：利用权利要求1-4任一项所述的构建方法构建sgrna文库细胞池，并进行sgrna序列覆盖度检测。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：基因组dna提取、pcr扩增建库和ngs上机检测。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述基因组dna的浓度需大于等于150ng/μl。8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述pcr扩增建库为二步法：第一步：以sgrna文库细胞池的基因组dna为模板进行第一轮pcr扩增，单个反应模板量为1-1.5μg，每个样本的反应数为10，反应程序的循环数在15-18之间；第二步：以第一步10个pcr扩增反应产物的混合物为模板进行第二轮pcr扩增，单个反应模板量为2μl，每个样本的反应数为6-9，反应程序的循环数在18-20之间。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述二步法pcr扩增建库中第一步扩增使用的引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示。10.一种用于构建sgrna文库细胞池的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1-4中任一项所述的构建方法进行sgrna文库细胞池构建。

技术总结
本发明提供了一种sgRNA文库细胞池构建方法，目的细胞经sgRNA文库慢病毒以较低感染复数感染24h后更换新鲜培养基继续培养36-60h，然后再更换为带抗性药物的培养基筛选、培养5-10天，存活下来的细胞集合即为sgRNA文库细胞池。本发明还提供了一种sgRNA序列覆盖度检测方法，即规范化的二步PCR扩增建库结合下的NGS检测法。本发明提供的sgRNA文库细胞池覆盖度可达98％以上，且系统地规范了从sgRNA文库细胞池构建到sgRNA覆盖度检测的全流程操作方法，操作简单高效，重现性好，适用于哺乳动物细胞为目的细胞的sgRNA文库细胞池的构建及检测。测。测。


技术研发人员：刘海虹 邓文文 柳伟强 黄国帅 诸天源 申姝茵 杨平
受保护的技术使用者：苏州泓迅生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.08.28
技术公布日：2023/10/20