一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法与流程

1.本发明涉及腺苷二磷酸制备技术领域，具体涉及一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法。


背景技术：

2.腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，缩写adp)，是由一分子腺苷与两个相连的磷酸根组成的化合物，它的分子式为c10h15n5o10p2。在生物体内，通常为三磷酸腺苷(atp)水解失去一个磷酸根，即断裂一个高能磷酸键，并释放能量后的产物。
3.adp是人们发现最早、也是体内最重要的诱导血小板聚集的物质，存在于血小板细胞内的高密度颗粒内，当血小板发生凝聚反应时被释放，adp通过血小板上的adp受体对血小板的形状及生物学行为产生影响，进一步加速血小板的凝聚过程。目前adp作为重要的生物原料，被应用于生化研究，测定丙酮酸激酶的活性，制备多聚核苷酸领域。
4.目前制备adp的方法主要有化学合成法以及生物发酵法。化学法主要以腺苷或腺苷单磷酸为底物，通过三氯氧磷有机磷试剂进行磷酸化获得相应的adp原料，该方法需要使用大量的有机试剂，反应条件苛刻，产生的危废较多，环境污染严重，并且合成过程中生产的一磷酸和三磷酸副产物，增加了后续分离纯化的成本，影响最终adp的纯度及收率。生物发酵即通过代谢工程对微生物细胞中adp的代谢通路进行基因改造，从而得到目标产品adp富集的目的，但由于adp的发酵合成浓度有限，并且发酵液成分复杂，微生物代谢过程中易生成其他系列核苷酸的产物(如腺苷、胞苷酸、尿苷酸)，这些物质理化性质较为相似，极大的增加后期产品提纯的难度，不利于其产业化生产。目前研究常常利用磷酸化水解酶或者激酶作为adp-atp之间循环再生，如核苷磷酸化酶、多聚磷酸盐激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶，但如果用来生产adp原料，这些循环再生系统的酶促反应往往处于平衡状态，底物转化不彻底，并且adp易被酶继续水解为腺苷单磷酸(amp)，增加了反应过程中的副产物种类，使得产业化难度高，成本居高不下。也有报道以腺苷或者腺苷酸为底物进行adp的合成，同样存在上述的反应平衡、副产物多问题，并且由于分离纯化难度较大，市场上在售的adp原料纯度多在95％左右。因此，亟需设计一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法来解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，以解决现有技术中的上述不足之处。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，包括以下步骤：
8.s1、酶蛋白制备
9.a、glk酶蛋白工程菌株构建：
10.将来源于大肠杆菌k12菌株的葡萄糖激酶基因(glk)进行分子克隆；
11.b、glk重组酶蛋白发酵：
12.使用大肠杆菌发酵常用培养基进行酶蛋白发酵，利用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)或者乳糖进行蛋白诱导表达；
13.c、glk酶液的制备：用2mm ph7.0磷酸盐缓冲液将收集的glk重组菌的发酵菌体重悬，体积为发酵液体积的0.2～0.5倍，用超声波细胞粉碎机或高压均质机进行细胞破碎，离心收集上清液即为含glk重组酶蛋白的酶液；
14.s2、酶催化反应
15.d、称取原料atp使其终浓度在100～300mm之间，优选200mm，葡萄糖与adp的浓度比在1：1～2，将原料称取至反应釜中，加入纯化水使其达到目标浓度，搅拌使原料完全溶解；
16.e、用饱和氢氧化钠溶液，也可以是氨水、碳酸钠或者有机碱碱性溶液，将原料液ph调节至5～9；
17.f、按照体积1:5～10倍的原料atp质量，优选1:8，量取glk酶液，缓慢加入反应液中；
18.g、控制反应液温度在20～45℃，优选37℃，搅拌进行生物催化反应，反应过程中用饱和naoh溶液，将反应液ph调节至5～9，优选ph7.5；
19.h、反应过程中每间隔1h取样进行hplc检测，观察反应液进度，最终反应3～8h，底物atp转化率大于98％，停止反应；
20.i、酶催化反应液中产品adp的液相纯度》90％，副产物amp占比《5％，酶催化反应结束；
21.s3、反应液脱色
22.j、待酶催化反应结束后，将反应液升温至60～80℃，搅拌维持20～60min，优选30min；
23.k、向加热处理后的酶催化反应液中，加入0.5
‰
～5
‰
的活性炭，优选1
‰
，在30～60℃条件下搅拌1～4h进行吸附脱色，优选45℃条件下，搅拌脱色2h，收集上清液即为脱色液，hplc检测分析脱色液产品含量，损失率《2％；
24.s4、层析柱分离
25.l、将脱色液用强碱性阴离子交换树脂进行分离纯化，除去脱色液中的糖类物质；
26.m、lka20型阴离子交换树脂预处理
27.按照树脂厂家指导，对lka20树脂进行预处理；
28.n、样品吸附
29.将脱色液的ph控制在2.0～11.0，优选ph7.0，按1：5～20的质量比，称取预处理好的lka20树脂加入到脱色液中，在25～40℃条件下缓慢搅拌6-12h，进行adp样品吸附，最终树脂对产物adp吸附挂载率最高近95％；
30.o、样品洗脱：
31.将样品吸附后的lka20树脂装填入层析柱中，使用1-5倍，优选2倍柱体积的纯化水冲洗层析柱，洗脱残留反应溶剂及糖类杂质；
32.使用1-3倍柱体积，优选2倍的纯化水冲洗未吸附的杂质及溶剂；
33.使用2-6倍柱体积，优选4倍的0.05m-0.1m的nacl溶液洗脱核苷酸类杂质，检测杂质洗脱液中adp残留量《5％；
34.使用3-8倍柱体积的0.2m nacl溶液洗脱目标产物adp，检测adp洗脱液纯度，收集合并纯度》95％的洗脱液；
35.s5、纳滤除盐浓缩
36.p、将柱层析收集的产品洗脱液ph调节至4～7，使用纳滤膜系统进行除盐浓缩，纳滤膜过滤分子量为150～500da之间，纳滤过程中，控制样品温度在10～35℃；
37.q、纳滤浓缩产品洗脱液体积达到原始体积的1/2时，补加1/2的体积4℃条件下预冷纯化水，重复3-8次，优选5次；
38.r、继续纳滤浓缩至原始体积的1/8～1/3，优选1/5，停止纳滤；收集产品浓缩液，检测样品纯度》97％；
39.s6、结晶
40.s、将纳滤后的产品浓缩液定量，并向其中缓慢加入1～3倍无水乙醇，优选2.5倍体积，边加入边搅拌，搅拌混匀后在0～20℃条件下结晶，优选10℃，结晶时长10～24h，adp结晶率》97％且不再变化，即可终止结晶；
41.s7、重结晶
42.t、收集结晶后的晶体，加入0.1～1倍反应液体积的纯化水，优选0.3倍，30～60℃条件下将晶体复溶；
43.u、向复溶液中加入1～3倍无水乙醇，优选2.5倍体积，边加入边搅拌，搅拌混匀后在0～20℃条件下结晶，优选10℃，结晶时长2～10h，adp结晶率》97％且不再变化，即可终止结晶，收集晶体；
44.s8、干燥成品
45.v、将收集的adp晶体进行干燥，获得最终adp成品；
46.w、最终adp产品hplc纯度》99％，含量》97％，纯化收率在90％～96％。
47.进一步地，所述s1中的a步骤中，可克隆至真核表达宿主如酿酒酵母、毕赤酵母，原核表达系统如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌宿主中进行目标蛋白表达，优选以大肠杆菌bl21为重组蛋白表达宿主，构建葡萄糖激酶重组表达工程菌株。
48.进一步地，所述s1中的b步骤中，发酵培养基为tb液体培养基，该tb液体培养基中含有：12g/l的蛋白胨，24g/l的酵母粉，4g/l的甘油，2.31g/l的kh2po4，16.43g/l的k2hpo4
·
3h2o；蛋白诱导表达的培养温度为20～40℃，继续培养16～24小时，发酵液od600》60～80即可停止发酵，收集发酵液菌体；所述的glk重组酶蛋白可以为含有glk重组基因的大肠杆菌发酵菌体，也可以为含有glk重组酶蛋白的细胞破碎酶液(简称glk酶液)，或者含有glk重组酶蛋白的冻干粉，当然该酶蛋白亦可与相应的载体材料结合，成为glk重组酶蛋白的固定化酶，本发明种优选glk酶液作为生物催化剂用于adp产品的合成。
49.进一步地，所述s2中的d步骤中，加入纯化水后的控制溶液温度在20～45℃，优选37℃；所述s2中的e步骤中，ph值优选为7.5；所述s2中的g步骤中，饱和naoh溶液也可以为氨水、碳酸钠或者有机碱碱性溶液中的任意一种。
50.进一步地，所述s4中的l步骤中，常用的阴离子交换树脂包括201
×
7型、am207型、xrk209型、lka20型型号，优选lka20型阴离子交换树脂作为层析分离介质。
51.进一步地，所述s5中的p步骤中，ph值优选为5；纳滤膜过滤分子量优选170da，控制样品温度优选15℃。
52.进一步地，所述s8中的v步骤中，干燥方式包括真空烘箱干燥、冻干方式中的一种。
53.在上述技术方案中，本发明提供的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，本发明通过筛选获得的葡萄糖激酶(glk，ec:2.7.1.2)作为催化剂，利用廉价易得的三磷酸腺苷(atp)以及葡萄糖为原料，在体外进行adp产品的生物合成，并经过简单的分离纯化工艺获得较高纯度的adp原料，整个生物合成过程在水相中进行，反应调节温和易控，催化底物浓度高达300mm，底物转化彻底，最高可达99％，生产的adp稳定未发生继续水解，副产物较少，极大的降低了分离纯化工艺的难度，减少其产业化的生产成本及环保压力，且最终的adp纯度》99％。
附图说明
54.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
55.图1为本发明一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法实施例提供的生产工艺流程图。
56.图2为本发明一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法实施例提供的酶催化合成反应式图。
57.图3为本发明一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法实施例提供的酶催化反应各组分变化曲线图。
58.图4为本发明一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法实施例提供的不同ph条件下lka20填料对adp吸附率图。
59.图5为本发明一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法实施例提供的不同乙醇比例条件adp结晶趋势变化曲线图。
60.图6为本发明一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法实施例提供的酶催化反应不同时间hplc检测图谱。
具体实施方式
61.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
62.实施例一
63.如图1-6所示，本发明实施例提供的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，包括以下步骤：
64.s1、酶蛋白制备
65.a、glk酶蛋白工程菌株构建：
66.将来源于大肠杆菌k12菌株的葡萄糖激酶基因(glk)进行分子克隆；
67.b、glk重组酶蛋白发酵：
68.使用大肠杆菌发酵常用培养基进行酶蛋白发酵，利用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)或者乳糖进行蛋白诱导表达；
69.c、glk酶液的制备：用2mm ph7.0磷酸盐缓冲液将收集的glk重组菌的发酵菌体重
悬，体积为发酵液体积的0.2～0.5倍，用超声波细胞粉碎机或高压均质机进行细胞破碎，离心收集上清液即为含glk重组酶蛋白的酶液；
70.s2、酶催化反应
71.d、称取原料atp使其终浓度在100～300mm之间，优选200mm，葡萄糖与adp的浓度比在1：1～2，将原料称取至反应釜中，加入纯化水使其达到目标浓度，搅拌使原料完全溶解；
72.e、用饱和氢氧化钠溶液，也可以是氨水、碳酸钠或者有机碱碱性溶液，将原料液ph调节至5～9；
73.f、按照体积1:5～10倍的原料atp质量，优选1:8，量取glk酶液，缓慢加入反应液中；
74.g、控制反应液温度在20～45℃，优选37℃，搅拌进行生物催化反应，反应过程中用饱和naoh溶液，将反应液ph调节至5～9，优选ph7.5；
75.h、反应过程中每间隔1h取样进行hplc检测，观察反应液进度，最终反应3～8h，底物atp转化率大于98％，停止反应；
76.i、酶催化反应液中产品adp的液相纯度》90％，副产物amp占比《5％，酶催化反应结束；
77.s3、反应液脱色
78.j、待酶催化反应结束后，将反应液升温至60～80℃，搅拌维持20～60min，优选30min；
79.k、向加热处理后的酶催化反应液中，加入0.5
‰
～5
‰
的活性炭，优选1
‰
，在30～60℃条件下搅拌1～4h进行吸附脱色，优选45℃条件下，搅拌脱色2h，收集上清液即为脱色液，hplc检测分析脱色液产品含量，损失率《2％；
80.s4、层析柱分离
81.l、将脱色液用强碱性阴离子交换树脂进行分离纯化，除去脱色液中的糖类物质；
82.m、lka20型阴离子交换树脂预处理
83.按照树脂厂家指导，对lka20树脂进行预处理；
84.n、样品吸附
85.将脱色液的ph控制在2.0～11.0，优选ph7.0，按1：5～20的质量比，称取预处理好的lka20树脂加入到脱色液中，在25～40℃条件下缓慢搅拌6-12h，进行adp样品吸附，最终树脂对产物adp吸附挂载率最高近95％；
86.o、样品洗脱：
87.将样品吸附后的lka20树脂装填入层析柱中，使用1-5倍，优选2倍柱体积的纯化水冲洗层析柱，洗脱残留反应溶剂及糖类杂质；
88.使用1-3倍柱体积，优选2倍的纯化水冲洗未吸附的杂质及溶剂；
89.使用2-6倍柱体积，优选4倍的0.05m-0.1m的nacl溶液洗脱核苷酸类杂质，检测杂质洗脱液中adp残留量《5％；
90.使用3-8倍柱体积的0.2m nacl溶液洗脱目标产物adp，检测adp洗脱液纯度，收集合并纯度》95％的洗脱液；
91.s5、纳滤除盐浓缩
92.p、将柱层析收集的产品洗脱液ph调节至4～7，使用纳滤膜系统进行除盐浓缩，纳
滤膜过滤分子量为150～500da之间，纳滤过程中，控制样品温度在10～35℃；
93.q、纳滤浓缩产品洗脱液体积达到原始体积的1/2时，补加1/2的体积4℃条件下预冷纯化水，重复3-8次，优选5次；
94.r、继续纳滤浓缩至原始体积的1/8～1/3，优选1/5，停止纳滤；收集产品浓缩液，检测样品纯度》97％；
95.s6、结晶
96.s、将纳滤后的产品浓缩液定量，并向其中缓慢加入1～3倍无水乙醇，优选2.5倍体积，边加入边搅拌，搅拌混匀后在0～20℃条件下结晶，优选10℃，结晶时长10～24h，adp结晶率》97％且不再变化，即可终止结晶；
97.s7、重结晶
98.t、收集结晶后的晶体，加入0.1～1倍反应液体积的纯化水，优选0.3倍，30～60℃条件下将晶体复溶；
99.u、向复溶液中加入1～3倍无水乙醇，优选2.5倍体积，边加入边搅拌，搅拌混匀后在0～20℃条件下结晶，优选10℃，结晶时长2～10h，adp结晶率》97％且不再变化，即可终止结晶，收集晶体；
100.s8、干燥成品
101.v、将收集的adp晶体进行干燥，获得最终adp成品；
102.w、最终adp产品hplc纯度》99％，含量》97％，纯化收率在90％～96％。
103.本发明提供的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，本发明通过筛选获得的葡萄糖激酶(glk，ec:2.7.1.2)作为催化剂，利用廉价易得的三磷酸腺苷(atp)以及葡萄糖为原料，在体外进行adp产品的生物合成，并经过简单的分离纯化工艺获得较高纯度的adp原料，整个生物合成过程在水相中进行，反应调节温和易控，催化底物浓度高达300mm，底物转化彻底，最高可达99％，生产的adp稳定未发生继续水解，副产物较少，极大的降低了分离纯化工艺的难度，减少其产业化的生产成本及环保压力，且最终的adp纯度》99％。
104.实施例二
105.s1中的a步骤中，可克隆至真核表达宿主如酿酒酵母、毕赤酵母，原核表达系统如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌宿主中进行目标蛋白表达，优选以大肠杆菌bl21为重组蛋白表达宿主，构建葡萄糖激酶重组表达工程菌株；s1中的b步骤中，发酵培养基为tb液体培养基，该tb液体培养基中含有：12g/l的蛋白胨，24g/l的酵母粉，4g/l的甘油，2.31g/l的kh2po4，16.43g/l的k2hpo4
·
3h2o；蛋白诱导表达的培养温度为20～40℃，继续培养16～24小时，发酵液od600》60～80即可停止发酵，收集发酵液菌体；的glk重组酶蛋白可以为含有glk重组基因的大肠杆菌发酵菌体，也可以为含有glk重组酶蛋白的细胞破碎酶液(简称glk酶液)，或者含有glk重组酶蛋白的冻干粉，当然该酶蛋白亦可与相应的载体材料结合，成为glk重组酶蛋白的固定化酶，本发明种优选glk酶液作为生物催化剂用于adp产品的合成。s2中的d步骤中，加入纯化水后的控制溶液温度在20～45℃，优选37℃；s2中的e步骤中，ph值优选为7.5；s2中的g步骤中，饱和naoh溶液也可以为氨水、碳酸钠或者有机碱碱性溶液中的任意一种。s4中的l步骤中，常用的阴离子交换树脂包括201
×
7型、am207型、xrk209型、lka20型型号，优选lka20型阴离子交换树脂作为层析分离介质。s5中的p步骤中，ph值优选为5；纳滤膜过滤分子量优选170da，控制样品温度优选15℃。s8中的v步骤中，干燥方式包括真空烘箱干
燥、冻干方式中的一种。
106.以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

技术特征：
1.一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、酶蛋白制备a、glk酶蛋白工程菌株构建：将来源于大肠杆菌k12菌株的葡萄糖激酶基因(glk)进行分子克隆；b、glk重组酶蛋白发酵：使用大肠杆菌发酵常用培养基进行酶蛋白发酵，利用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)或者乳糖进行蛋白诱导表达；c、glk酶液的制备：用2mm ph7.0磷酸盐缓冲液将收集的glk重组菌的发酵菌体重悬，体积为发酵液体积的0.2～0.5倍，用超声波细胞粉碎机或高压均质机进行细胞破碎，离心收集上清液即为含glk重组酶蛋白的酶液；s2、酶催化反应d、称取原料atp使其终浓度在100～300mm之间，葡萄糖与adp的浓度比在1：1～2，将原料称取至反应釜中，加入纯化水使其达到目标浓度，搅拌使原料完全溶解；e、用饱和氢氧化钠溶液，也可以是氨水、碳酸钠或者有机碱碱性溶液，将原料液ph调节至5～9；f、按照体积1:5～10倍的原料atp质量，量取glk酶液，缓慢加入反应液中；g、控制反应液温度在20～45℃，搅拌进行生物催化反应，反应过程中用饱和naoh溶液，将反应液ph调节至5～9；h、反应过程中每间隔1h取样进行hplc检测，观察反应液进度，最终反应3～8h，底物atp转化率大于98％，停止反应；i、酶催化反应液中产品adp的液相纯度>90％，副产物amp占比<5％，酶催化反应结束；s3、反应液脱色j、待酶催化反应结束后，将反应液升温至60～80℃，搅拌维持20～60min；k、向加热处理后的酶催化反应液中，加入0.5
‰
～5
‰
的活性炭，在30～60℃条件下搅拌1～4h进行吸附脱色，搅拌脱色2h，收集上清液即为脱色液，hplc检测分析脱色液产品含量，损失率<2％；s4、层析柱分离l、将脱色液用强碱性阴离子交换树脂进行分离纯化，除去脱色液中的糖类物质；m、lka20型阴离子交换树脂预处理按照树脂厂家指导，对lka20树脂进行预处理；n、样品吸附将脱色液的ph控制在2.0～11.0，按1：5～20的质量比，称取预处理好的lka20树脂加入到脱色液中，在25～40℃条件下缓慢搅拌6-12h，进行adp样品吸附，最终树脂对产物adp吸附挂载率95％；o、样品洗脱：将样品吸附后的lka20树脂装填入层析柱中，使用1-5倍柱体积的纯化水冲洗层析柱，洗脱残留反应溶剂及糖类杂质；使用1-3倍柱体积的纯化水冲洗未吸附的杂质及溶剂；使用2-6倍柱体积的0.05m-0.1m的nacl溶液洗脱核苷酸类杂质，检测杂质洗脱液中adp
残留量<5％；使用3-8倍柱体积的0.2m nacl溶液洗脱目标产物adp，检测adp洗脱液纯度，收集合并纯度>95％的洗脱液；s5、纳滤除盐浓缩p、将柱层析收集的产品洗脱液ph调节至4～7，使用纳滤膜系统进行除盐浓缩，纳滤膜过滤分子量为150～500da之间，纳滤过程中，控制样品温度在10～35℃；q、纳滤浓缩产品洗脱液体积达到原始体积的1/2时，补加1/2的体积4℃条件下预冷纯化水，重复3-8次；r、继续纳滤浓缩至原始体积的1/8～1/3，停止纳滤；收集产品浓缩液，检测样品纯度>97％；s6、结晶s、将纳滤后的产品浓缩液定量，并向其中缓慢加入1～3倍无水乙醇，边加入边搅拌，搅拌混匀后在0～20℃条件下结晶，结晶时长10～24h，adp结晶率>97％且不再变化，即可终止结晶；s7、重结晶t、收集结晶后的晶体，加入0.1～1倍反应液体积的纯化水，30～60℃条件下将晶体复溶；u、向复溶液中加入1～3倍无水乙醇，边加入边搅拌，搅拌混匀后在0～20℃条件下结晶，结晶时长2～10h，adp结晶率>97％且不再变化，即可终止结晶，收集晶体；s8、干燥成品v、将收集的adp晶体进行干燥，获得最终adp成品；w、最终adp产品hplc纯度>99％，含量>97％，纯化收率在90％～96％。2.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，其特征在于，所述s1中的a步骤中，可克隆至真核表达宿主如酿酒酵母、毕赤酵母，原核表达系统如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌宿主中进行目标蛋白表达。3.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，其特征在于，所述s1中的b步骤中，发酵培养基为tb液体培养基，该tb液体培养基中含有：12g/l的蛋白胨，24g/l的酵母粉，4g/l的甘油，2.31g/l的kh2po4，16.43g/l的k2hpo4
·
3h2o；蛋白诱导表达的培养温度为20～40℃，继续培养16～24小时，发酵液od600>60～80即可停止发酵，收集发酵液菌体；所述的glk重组酶蛋白可以为含有glk重组基因的大肠杆菌发酵菌体，含有glk重组酶蛋白的细胞破碎酶液，含有glk重组酶蛋白的冻干粉，当然该酶蛋白亦可与相应的载体材料结合，成为glk重组酶蛋白的固定化酶。4.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，其特征在于，所述s2中的d步骤中，加入纯化水后的控制溶液温度在20～45℃；所述s2中的e步骤中，ph值优选为7.5；所述s2中的g步骤中，饱和naoh溶液也可以为氨水、碳酸钠或者有机碱碱性溶液中的任意一种。5.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，其特征在于，所述s4中的l步骤中，常用的阴离子交换树脂包括201
×
7型、am207型、xrk209型、lka20型型号。
6.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，其特征在于，所述s5中的p步骤中，ph值优选为5；纳滤膜过滤分子量优选170da，控制样品温度优选15℃。7.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，其特征在于，所述s8中的v步骤中，干燥方式包括真空烘箱干燥、冻干方式中的一种。

技术总结
本发明公开了一种利用生物酶制备腺苷二磷酸纯品的方法，包括以下步骤：S1、酶蛋白制备a、GLK酶蛋白工程菌株构建；b、GLK重组酶蛋白发酵；c、GLK酶液的制备；S2、酶催化反应；S3、反应液脱色；S4、层析柱分离；S5、纳滤除盐浓缩；S6、结晶；S7、重结晶；S8、干燥成品。本发明通过筛选获得的葡萄糖激酶(GLK，EC:2.7.1.2)作为催化剂，利用廉价易得的三磷酸腺苷(ATP)以及葡萄糖为原料，在体外进行ADP产品的生物合成，并经过简单的分离纯化工艺获得较高纯度的ADP原料，整个生物合成过程在水相中进行，反应调节温和易控，副产物较少，极大的降低了分离纯化工艺的难度，减少其产业化的生产成本及环保压力，且最终的ADP纯度>99％。且最终的ADP纯度>99％。且最终的ADP纯度>99％。


技术研发人员：原海亮 陶晓阳 胡小垒 吴飞
受保护的技术使用者：汇海（苏州）生物技术有限公司
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/10/20