制备不同粒径的草酸钙晶体的方法

1.本发明属于医学研究领域，具体涉及制备不同粒径的草酸钙晶体的方法。


背景技术：

2.肾结石(renal calculi)常见的症状有腰腹部绞痛、恶心、呕吐、烦躁不安、腹胀、血尿等。肾结石分类有草酸钙结石、尿酸盐结石和磷酸铵镁结石等，其中草酸钙结石最为常见，占71％～84％。构成草酸钙结石的主要晶体成分之一是一水草酸钙(com)，是肾结石中热力学最稳定的相。
3.目前肾结石相关的科学研究中，科研人员通过草酸钙结晶在细胞层面的表征，探究草酸钙结石的形成和发展及其对人体的影响。但是目前草酸钙晶体制备方法不统一，制备晶体大小不规则，不利于肾结石医学研究。因此为了探究肾结石的形成与发展的不同阶段、肾结石发展的机理、及其预防措施，研制出形状规则且性质稳定的不同大小草酸钙晶体十分重要。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种制备稳定的不同粒径的草酸钙晶体的方法。
5.本发明提供了一种制备粒径为5.8
±
0.4μm的草酸钙晶体的方法，该方法包括以下步骤：
6.1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；
7.2)先后将20ml氯化钙溶液、20ml草酸钠溶液加入到离心管中；
8.3)上下颠倒混匀；
9.4)以离心管的中心为圆心，室温垂直颠倒混匀孵育2h，垂直颠倒的转速10rpm；
10.5)2500rpm离心5min，弃去上清；
11.6)加入5ml的有机溶剂，2500rpm离心5min，弃上清；
12.7)重复步骤6；
13.8)通风风干，即得粒径为5.8
±
0.4μm的草酸钙晶体。
14.进一步地，步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇。
15.本发明还提供了一种制备粒径为10
±
0.8μm的草酸钙晶体的方法，该方法包括以下步骤：
16.1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；
17.2)先将20ml氯化钙溶液加入离心管中，再以500ml/h的速度加入20ml草酸钠溶液；
18.3)置于旋转混匀仪中，在室温条件下以20rpm孵育1h；
19.4)2500rpm离心5min，弃上清；
20.5)加入5ml的有机溶剂，2500rpm离心5min，弃上清；
21.6)重复步骤5；
22.7)通风风干，即得粒径为10
±
0.8μm的草酸钙晶体。
23.进一步地，步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇。
24.本发明还提供了一种制备粒径为14
±
1.2μm的草酸钙晶体的方法，该方法包括以下步骤：
25.1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；
26.2)将草酸钠溶液和氯化钙溶液分别预热至70℃；
27.3)在容器中先加入200ml 70℃的氯化钙溶液，再以2500ml/h的速度加入温度为70℃的200ml草酸钠溶液；
28.4)保持恒温70℃，10rpm持续搅拌1h；
29.5)2500rpm离心5min，弃去上清；
30.6)加入5ml有机溶剂，2500rpm离心5min弃上清；
31.7)重复步骤6；
32.8)通风风干，即得粒径为14
±
1.2μm的草酸钙晶体；
33.优选地，步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇；步骤4)所述搅拌为磁力搅拌。
34.本发明还提供了一种制备粒径为18
±
2.0μm的草酸钙晶体的方法，该方法包括以下步骤：
35.1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；
36.2)将草酸钠溶液和氯化钙溶液预热至70℃；
37.3)在容器中先加入200ml 70℃的氯化钙溶液，再以10000ml/h的速度加入200ml 70℃的草酸钠溶液；
38.4)保持恒温70℃，10rpm持续搅拌1h；
39.5)2500rpm离心5min，弃去上清；
40.6)加入5ml有机溶剂，2500rpm离心5min，弃上清；
41.7)重复步骤6；
42.8)通风风干，即得粒径为18
±
2.0μm的草酸钙晶体；
43.优选地，步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇；步骤4)所述搅拌为磁力搅拌。
44.本发明还提供了上述方法制备得到的草酸钙晶体。
45.本发明还提供了一组不同粒径且稳定性好的草酸钙晶体的制备方法，所述草酸钙晶体的粒径为5.8
±
0.4μm，10
±
0.8μm，14
±
1.2μm和18
±
2.0μm，其包括上述制备方法。
46.本发明还提供了上述草酸钙晶体在研究草酸钙晶体对肾脏细胞的影响中的用途。
47.本发明还提供了一种研究草酸钙晶体对肾脏细胞的影响的方法，方法如下：
48.1)取肾脏细胞进行体外培养；
49.2)取上述方法制备的不同粒径草酸钙晶体加入前述培养体系中，设置对照组，对照组不加入晶体；
50.3)观察晶体对肾脏细胞的影响。
51.本发明制备草酸钙晶体的温度，离心时间，转速都有严格要求，任意改变参数，得到晶型或者粒径大小会有变化，不能得到粒径大小统一的稳定的草酸钙晶体。
52.本发明提供了一种可以制备晶体大小分别在5.8
±
0.4μm，10
±
0.8μm，14
±
1.2μm，
18
±
2.0μm的形状规则且性质稳定的草酸钙晶体的方法。该草酸钙晶体主要成分为一水草酸钙。本发明制备的不同粒径的草酸钙晶体可以模拟肾结石形成的不同阶段，可用于探究肾结石的形成和发展的机理及其预防措施。
53.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
54.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
55.图1为极小粒径的草酸钙晶体sem图(a)10μm，(b)3μm。
56.图2为次小粒径的草酸钙晶体sem图(a)10μm，(b)3μm。
57.图3为中等粒径的草酸钙晶体sem图(a)10μm，(b)3μm。
58.图4为大粒径的草酸钙晶体sem图(a)10μm，(b)3μm。
59.图5为各粒径的草酸钙晶体红外光谱图。
具体实施方式
60.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
61.实验所用相关仪器如下：
62.漩涡混匀仪：mx-rd-pro型数控圆盘旋转混匀仪。
63.垂直颠倒仪：tube revolver，型号：tr-02u(hyq-2231)。
64.实施例1稳定的不同粒径草酸钙晶体的制备
65.一、制备方法(一)制备极小粒径的草酸钙晶体(min-com,5.8
±
0.4μm)的
66.1.用ddh2o配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液。
67.2.在50ml的离心管中，先加入20ml的2mm氯化钙溶液。
68.3.立即加入20ml的1mm草酸钠溶液。
69.4.上下颠倒混匀。
70.5.以离心管的中心为圆心，室温垂直颠倒混匀孵育2h，垂直颠倒的转速10rpm；
71.6.2500rpm离心5min，弃去上清至剩余5ml左右。
72.7.加入5ml甲醇，2500rpm离心5min，弃上清。
73.8.重复步骤7。
74.9.通风风干30min。
75.10.紫外线30min杀菌。
76.(二)制备次小粒径的草酸钙晶体(submid-com,10
±
0.8μm)
77.1.用ddh2o配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液。
78.2.在50ml的离心管中，先加入20ml 2mm氯化钙溶液。
79.3.用横流泵以500ml/h的速度加入20ml 1mm草酸钠溶液。
80.4.在漩涡混匀仪上室温20rpm水平孵育1h。
81.5.2500rpm离心5min，弃去上清至剩余5ml左右。
82.6.加入5ml甲醇，2500rpm离心5min，弃上清。
83.7.重复步骤6。
84.8.通风风干30min。
85.9.紫外线30min杀菌。
86.(三)制备中等粒径的草酸钙晶体(mid-com,14
±
1.2μm)
87.1.用ddh2o配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液。
88.2.将1mm草酸钠溶液和2mm氯化钙溶液分别预热至70℃。
89.3.将500ml的烧杯置于100rpm，70℃的恒温磁力搅拌器上，先加入200ml
90.70℃的2mm氯化钙溶液。
91.4.用横流泵以2500ml/h的速度加入温度为70℃的1mm草酸钠溶液。
92.5.保持恒温70℃，10rpm持续搅拌1h。
93.6.2500rpm离心5min，弃去上清至剩余5ml左右。
94.7.加入5ml甲醇，2500rpm离心5min，弃上清。
95.8.重复步骤7。
96.9.通风风干30min。
97.10.紫外线30min杀菌。
98.(四)制备大粒径的草酸钙晶体(max-com,18
±
2.0μm)
99.1.用ddh2o配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液。
100.2.将1mm草酸钠溶液和2mm氯化钙溶液预热至70℃。
101.3.将500ml的烧杯置于100rpm，70℃的恒温磁力搅拌器上，先加入200
102.ml 70℃的2mm氯化钙溶液。
103.4.用横流泵以10000ml/h的速度加入温度为70℃的1mm草酸钠溶液
104.200ml。
105.5.保持恒温70℃，10rpm持续搅拌1h。
106.6.2500rpm离心5min，弃去上清至剩余5ml左右。
107.7.加入5ml甲醇，2500rpm离心5min，弃上清。
108.8.重复步骤7。
109.9.通风风干30min。
110.10.紫外线30min杀菌。
111.二、本发明晶体稳定性以及组分检测
112.(一)检测方法
113.1、扫描电子显微镜检测
114.取前述方法制备的各种粒径的草酸钙晶体，分别放置4个月，期间采用扫描电镜观察其粒径变化。
115.2、傅立叶红外光谱检测
116.分别取前述方法制备的各种粒径的草酸钙晶体，采用傅立叶红外光谱(ftir)测定其主要成分。
117.(二)检测结果
118.1、扫描电子显微镜检测结果
119.经过观察，本发明方法制备的各种粒径草酸钙晶体均非常稳定，其粒径几乎没有变化，比如，极小晶体的草酸钙晶体，粒径始终保持在5.8
±
0.4μm。并且通过图1-图4可知，除了极小晶体，其他粒径大小的草酸钙晶型统一，均为穿刺孪晶。
120.2、傅立叶红外光谱检测结果
121.通过傅立叶红外光谱(ftir)证实，所形成的草酸钙晶体是一水草酸钙晶体，ftir光谱图如下，在1319cm-1
处有金属羧酸盐拉伸的特征峰，与草酸钙分子配位的水分子在1629cm-1
处产生了与弯曲模式相匹配的特定峰。配位水分子的不对称和对称伸缩峰由3000cm-1
以上的宽谱峰所示。此外，800cm-1
附近的两个峰是草酸钙晶体的特征峰。
122.试验例1采用本发明不同粒径晶体研究肾结石机理
123.1、取肾脏细胞进行体外培养；
124.2、取实施例1制备的不同粒径晶体加入前述培养体系中，设置对照组，对照组不加入晶体；
125.3、观察晶体对肾脏细胞的影响。
126.综上，本发明提供了一种可以制备晶体粒径分别在5.8
±
0.4μm，10
±
0.8μm，14
±
1.2μm，18
±
2.0μm的形状规则且性质稳定的草酸钙晶体的方法。该草酸钙晶体主要成分为一水草酸钙。本发明制备的不同粒径的草酸钙晶体可以模拟肾结石形成的不同阶段，可用于探究肾结石的形成和发展的机理及其预防措施。

技术特征：
1.一种制备粒径为5.8
±
0.4μm的草酸钙晶体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；2)先后将20ml氯化钙溶液、20ml草酸钠溶液加入到离心管中；3)上下颠倒混匀；4)以离心管的中心为圆心，室温垂直颠倒混匀孵育2h，垂直颠倒的转速10rpm；5)2500rpm离心5min，弃去上清；6)加入5ml有机溶剂，2500rpm离心5min，弃上清；7)重复步骤6；8)通风风干，即得粒径为5.8
±
0.4μm的草酸钙晶体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇。3.一种制备粒径为10
±
0.8μm的草酸钙晶体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；2)先将20ml氯化钙溶液加入离心管中，再以500ml/h的速度加入20ml草酸钠溶液；3)置于旋转混匀仪中，在室温条件下以20rpm孵育1h；4)2500rpm离心5min，弃上清；5)加入5ml有机溶剂，2500rpm离心5min，弃上清；6)重复步骤5；7)通风风干，即得粒径为10
±
0.8μm的草酸钙晶体。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇。5.一种制备粒径为14
±
1.2μm的草酸钙晶体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；2)将草酸钠溶液和氯化钙溶液分别预热至70℃；3)在容器中先加入200ml 70℃的氯化钙溶液，再以2500ml/h的速度加入温度为70℃的200ml草酸钠溶液；4)保持恒温70℃，10rpm持续搅拌1h；5)2500rpm离心5min，弃去上清；6)加入5ml有机溶剂，2500rpm离心5min弃上清；7)重复步骤6；8)通风风干，即得粒径为14
±
1.2μm的草酸钙晶体；优选地，步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇；步骤4)所述搅拌为磁力搅拌。6.一种制备粒径为18
±
2.0μm的草酸钙晶体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)配制1mm草酸钠溶液、2mm氯化钙溶液；
2)将草酸钠溶液和氯化钙溶液预热至70℃；3)在容器中先加入200ml 70℃的氯化钙溶液，再以10000ml/h的速度加入200ml 70℃的草酸钠溶液；4)保持恒温70℃，10rpm持续搅拌1h；5)2500rpm离心5min，弃去上清；6)加入5ml有机溶剂，2500rpm离心5min，弃上清；7)重复步骤6；8)通风风干，即得粒径为18
±
2.0μm的草酸钙晶体；优选地，步骤1)中使用的为溶剂为去离子水，步骤5)中所述有机溶剂为甲醇；步骤4)所述搅拌为磁力搅拌。7.权利要求1～6任意一项所述方法制备得到的草酸钙晶体。8.一组不同粒径且稳定性好的草酸钙晶体的制备方法，其特征在于，所述草酸钙晶体的粒径为5.8
±
0.4μm，10
±
0.8μm，14
±
1.2μm和18
±
2.0μm，其包括权利要求1或2、3或4、5以及6所述制备方法。9.权利要求7所述草酸钙晶体在研究草酸钙晶体对肾脏细胞的影响中的用途。10.一种研究草酸钙晶体对肾脏细胞的影响的方法，其特征在于，方法如下：1)取肾脏细胞进行体外培养；2)取权利要求1-6任一项方法制备的不同粒径草酸钙晶体加入前述培养体系中，设置对照组，对照组不加入晶体；3)观察晶体对肾脏细胞的影响。

技术总结
本发明提供了一种制备稳定的不同粒径草酸钙晶体的方法。本发明方法制备的草酸钙晶体形状规则且性质稳定的，可以用于模拟肾结石形成的不同阶段，可用于探究肾结石的形成和发展的机理及其预防措施。的机理及其预防措施。的机理及其预防措施。


技术研发人员：金熙 袁义琼 戚世乾 王坤杰 唐丹 冯师健 文钧 简钟宇 刘彧
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/20