一种包括灵芝提取物的用于改善头发或头皮状态的组合物的制作方法

1.本发明涉及一种包括灵芝提取物的用于改善头发或头皮状态的组合物。


背景技术：

2.压力会刺激人体的交感神经，使毛细血管紧张，促进皮脂分泌，使头皮健康恶化，从而导致脱发。
3.关于因外源性压力引起的脱发，由于因微尘和污染物质引起的有毒物质的积累，脱发正在增加。微尘抑制毛囊中β-连环蛋白(β-catenin)的表达，减少细胞周期蛋白d1(cyclin d1)等头发生长因子，从而诱发脱发。
4.关于因内源性压力引起的脱发机制，美国哈佛大学干细胞再生研究小组通过对小鼠的研究发现，受到压力时分泌的激素之一“皮质酮”会抑制促进毛囊干细胞生长的蛋白质的产生，并使再生本身停止(“corticosterone inhibits gas6 to govern hair follicle stem-cell quiescence”，nature，volume 592，pages 428-432(2021))。经确认，因没有肾上腺而无法生成皮质酮的小鼠的毛囊休眠期短于20天，其头发生长周期为正常小鼠头发生长周期的三分之一。皮质酮作用于被知晓为毛乳头的毛囊下方皮肤细胞群。经证实，即使皮质酮水平发生变化，从毛乳头分泌的现有已确定的因子也不会发生任何变化，并且皮质酮抑制促进毛囊生长的gas6的生成。
5.另一方面，现有的防止脱发功能性告知成分显示出清洁头皮、抗头皮屑菌等间接防止脱发效果，从而大多难以期待直接的促进头发生长或防止脱发效果。
6.因此，本发明人通过确认灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分对防止脱发，例如由压力引起的脱发等具有直接效果而完成了本发明。


技术实现要素：

7.本发明的一方面提供一种灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的制备方法。
8.本发明的另一方面提供一种灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的用途。
9.本发明的又一方面提供一种包括灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的组合物。
10.本发明的再一方面提供一种预防、改善或治疗个体状态的方法，其包括：向有此需要的个体处理或施用有效量的所述组合物。
11.本发明的一方面提供一种灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的制备方法。
12.根据所述方法，可以获得大量含有灵芝有效成分即灵芝酸a的灵芝提取物。另外，根据所述方法，可以获得头发或头皮状态改善效果非常优异的灵芝提取物。另外，根据所述方法，可以获得对脱发功能具有直接效果的灵芝提取物，例如促进头发生长、防止脱发、强化发根等。此外，根据所述方法，可以获得在防止或减轻由内源性或外源性压力引起的脱发方面具有优异效果的灵芝提取物。
13.所述方法包括：(1)制备灵芝乙醇提取物；以及
14.(2)获得所述灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分。
15.所述方法还可以包括：(3)通过使用乙酸乙酯作为洗脱溶剂对所述馏分进行硅胶柱层析来获得乙酸乙酯馏分。
16.所述方法包括：(1)制备灵芝乙醇提取物。
17.所述“灵芝(ganoderma lucidum)”是一种灵芝科的蘑菇，又名不老草。所述灵芝不限于特定形态，例如可以使用灵芝本身、灵芝的干燥物或其切碎物等。
18.术语“提取物(extract)”包括通过提取天然物的成分而获得的所有物质，无论提取方法、提取溶剂、提取条件、所提取的成分或提取物的形式如何，并且还包括通过在提取天然物的成分后以其他方式对其进行加工或处理而获得的物质。例如，所述加工或处理可包括稀释、浓缩、干燥、纯化、分馏、过滤、发酵、酶处理等。因此，所述提取物可以包括提取液、提取液的稀释液或浓缩液、通过干燥提取液而获得的干燥物、或其粗纯化物或纯化物、或通过将其分馏而获得的馏分。
19.所述提取方法可以包括但不限于已知的天然物提取方法，例如热水提取、乙醇提取、加热提取、冷浸提取、回流提取、回流冷却提取、超声波提取和亚临界提取等。在一具体实施例中，所述提取方法可以为热水提取或加热提取。
20.所述萃取溶剂可选自水、有机溶剂或其混合物。所述水可以为蒸馏水或纯化水。所述有机溶剂可以为c1至c6的醇，例如乙醇。所述溶剂可以为水和乙醇的混合物。所述溶剂可以为10％(v/v)至90％(v/v)乙醇、20％(v/v)至90％(v/v)乙醇、20％(v/v)至80％(v/v)乙醇、30％(v/v)至90％(v/v)乙醇、30％(v/v)至80％(v/v)乙醇、30％(v/v)至70％(v/v)乙醇、40％(v/v)至90％(v/v)乙醇、40％(v/v)至80％(v/v)乙醇、40％(v/v)至70％(v/v)乙醇、40％(v/v)至60％(v/v)乙醇，例如，40％(v/v)乙醇、50％(v/v)乙醇、60％(v/v)乙醇或70％(v/v)乙醇。在一具体实施例中，所述溶剂可以为50％(v/v)乙醇。
21.当使用乙醇作为所述提取溶剂时，与用水相比，可以获得灵芝酸a含量更高的灵芝提取物。另外，当使用50％(v/v)至70％(v/v)乙醇，尤其是50％(v/v)乙醇作为所述提取溶剂时，与使用比其更低或更高浓度的乙醇相比，可以获得灵芝酸a含量更高的灵芝提取物。
22.所述提取溶剂可以由本领域技术人员以适于制备提取物的量来选择。具体地，所述溶剂的重量可以为但不限于灵芝总重量的1倍至100倍、5倍至100倍、10倍至100倍、1倍至50倍、5倍至50倍、10倍至50倍、1倍至20倍、5倍至20倍，或10倍至20倍。
23.所述提取条件是指用于提取天然物成分的条件，例如提取时间、提取温度等。所述提取时间可以为30分钟至120小时、30分钟至100小时、30分钟至80小时、30分钟至60小时、30分钟至40小时、30分钟至20小时、30分钟至10小时、2小时至120小时、2小时至100小时、2小时至80小时、2小时至60小时、2小时至40小时、2小时至24小时、10小时至120小时、10小时至100小时、10小时至80小时、10小时至60小时、10小时至40小时，或者10小时至24小时，但可以根据如提取溶剂、提取温度等其他条件适当地选择。所述提取温度可以为20℃至150℃、20℃至120℃、20℃至100℃、20℃至80℃、30℃至150℃、30℃至120℃、30℃至100℃、30℃至80℃、50℃至150℃、50℃至120℃、50℃至100℃、50℃至80℃、70℃至150℃、70℃至120℃、70℃至100℃，或70℃至80℃，但可以根据如提取溶剂、提取时间等其他条件适当地选择。
24.在一具体实施例中，所述灵芝乙醇提取物可以为通过过滤和浓缩提取液而获得的浓缩物。
25.所述方法包括：(2)获得所述灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯(ethyl acetate)馏分。
26.术语“馏分(fraction)”是指通过为了从包括许多不同成分的混合物中分离特定成分或特定成分组而进行分馏来获得的结果物。
27.所述获得馏分的分馏方法没有特别限制，可以根据本领域常用的方法进行。分馏次数可以为一次或两次或更多，并且可以由本领域技术人员适当地选择。在一具体实施例中，所述馏分可以通过向灵芝乙醇提取物中加入乙酸乙酯，然后仅回收乙酸乙酯层来获得。
28.所述乙酸乙酯馏分还包括可以通过用其他方法加工或处理馏分而获得的物质。例如，所述加工或处理可包括稀释、浓缩、干燥、纯化、分馏、过滤等。在一具体实施例中，所述乙酸乙酯馏分可以为其浓缩物。
29.所述方法还可以包括：(3)通过使用乙酸乙酯作为洗脱溶剂对所述馏分进行硅胶柱层析来获得乙酸乙酯馏分。
30.术语“硅胶柱层析”是指使用填充有硅胶的柱的层析。
31.具体地，所述硅胶柱层析可以通过将步骤(2)中得到的馏分在硅胶柱上展开，然后展开乙酸乙酯作为洗脱溶剂来进行。然后，仅取在薄层色谱(thin layer chromatography，tlc)上检测到灵芝酸a的馏分，即可得到乙酸乙酯馏分。
32.因此，从所述步骤(3)获得的乙酸乙酯馏分可以包括灵芝酸a(ganoderic acid a)。所述步骤(3)中得到的乙酸乙酯馏分可能含有非常丰富的灵芝酸a含量。灵芝的指标成分即灵芝酸a为一种强极性的物质。与此不同，用作馏分的溶剂即乙酸乙酯为具有相对低极性的溶剂。因此，当灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分粉末溶于水时，除了灵芝酸a之外的杂质会沉淀，这使得商品化变得困难。为了解决这种问题，通过进行所述步骤(3)的硅胶柱层析，可以获得富含灵芝酸a且无杂质的可实现商品化的乙酸乙酯馏分。
33.另外，与使用灵芝酸a本身相比，所述步骤(3)中获得的乙酸乙酯馏分在改善头发或头皮状态方面可以具有优异的效果。例如，与使用灵芝酸a本身相比，所述步骤(3)中获得的乙酸乙酯馏分可以在增加hgf、vegf、kgf、igf-1表达的功效方面更优异；或者在降低il-6表达的功效方面更优异。
34.另外，所述步骤(3)中获得的乙酸乙酯馏分可以为非刺激性物质。因此，所述馏分可安全地用于人体。
35.所述乙酸乙酯馏分还包括可以通过用其他方法加工或处理馏分而获得的物质。例如，所述加工或处理可包括稀释、浓缩、干燥、纯化、分馏、过滤等。在一具体实施例中，所述乙酸乙酯馏分可以为通过浓缩和干燥馏分而得到的干燥物。在另一具体实施例中，所述乙酸乙酯馏分可以为通过将所述馏分的干燥物溶解在溶剂中而获得的稀释物。
36.本发明的另一方面提供一种灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的用途。具体地，提供一种包括灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的组合物。
37.所述灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分可以为根据一方面的方法制备的灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分。
38.所述馏分的用途可以包括改善头发或头皮状态。因此，所述组合物可以为用于改善头发或头皮状态的组合物。
39.所述头发或头皮状态的改善可以是指促进头发生长、防止脱发、强化发根和抑制头皮炎症中的一种或多种。
vivo)人头皮来源的毛囊培养模型中，确认了所述馏分的增加毛囊长度效果、增加发根直径效果和维持毛囊生长期效果。
53.相对于所述组合物的总重量，所述组合物中包括的所述馏分的含量可以为0.001％至80％，例如，0.01％至60％、0.01％至50％、0.01％至40％、0.01％至30％、0.01％至20％、0.01％至10％、0.01％至5％、0.05％至60％、0.05％至50％、0.05％至40％、0.05％至30％、0.05％至20％、0.05％至10％、0.05％至5％、0.1％至60％、0.1％至50％、0.1％至40％、0.1％至30％、0.1％至20％、0.1％至10％、0.1％至5％、1％至50％、1％至40％、1％至30％、1％至20％、1％至10％、10％至50％、10％至40％、10％至30％，或10％至20％。
54.相对于所述组合物的总重量，所述组合物中包括的所述馏分的浓度可以为大于或等于0.1ppm且小于100ppm，例如，0.1ppm至90ppm、0.1ppm至80ppm、0.1ppm至70ppm、0.1ppm至60ppm、0.1ppm至50ppm、0.1ppm至40ppm、0.1ppm至30ppm、0.1ppm至20ppm、0.1ppm至10ppm、1ppm至90ppm、1ppm至80ppm、1ppm至70ppm、1ppm至60ppm、1ppm至50ppm、1ppm至40ppm、1ppm至30ppm、1ppm至20ppm，或1ppm至10ppm。若所述馏分的浓度小于0.1ppm，则可能无法获得所需的头发或头皮状态改善效果。
55.所述组合物可以包括所述灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分作为活性成分。
56.术语“包括......作为活性成分”是指本说明书的馏分以能够发挥上述效果的程度添加，意味着包括通过为了药物递送和稳定化等而添加各种成分作为辅助成分来配制(formulation)成各种形式。
57.所述组合物可以为液体状态或干燥状态。在一具体实施例中，所述组合物可以为干粉的形式。
58.用于制备干燥状态的组合物的干燥方法可以采用本领域常用的方法，并无特别限制。所述干燥方法的非限制性实例包括风干法、自然干燥法、喷雾干燥法、冻干法等。这些方法可以单独使用，也可以并用至少两种。
59.所述组合物可以包括足以减少提取物劣化(deterioration)的有效量的添加剂。所述添加剂可以例如为粘合剂，但不限于此。
60.所述组合物还可以包括化妆品学、药学或食品学可接受的载体。所述组合物可以与载体一起配制并作为化妆品、药物、食品添加剂形式等提供。
61.所述组合物可以为化妆品组合物。
62.除了本说明书公开的活性成分外，所述化妆品组合物还可以包括化妆品组合物中常用的成分、功能性添加剂等，例如可以包括诸如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、分散剂、防腐剂、维生素、色素、香料等常规的辅助剂和载体。
63.所述化妆品组合物不特别限于特定剂型，并且可根据目的适当地选择剂型。所述化妆品组合物可具有例如增溶剂型、乳化剂型或分散剂型。所述化妆品组合物可具有例如软化化妆水、营养化妆水、按摩霜、营养霜、精华液、面膜、凝胶、安瓶或皮肤粘合化妆品剂型。
64.所述化妆品组合物可以为可用于头发或头皮的剂型。所述化妆品组合物，例如可以为生发油、护发素、护发精华液、护发乳、营养护发乳、洗发水、润发水、护发焗油膏、发露、营养发露、保湿发露、按摩发露、发蜡、发用气溶胶、护发膜、营养护发膜、发皂、毛发清洁泡沫、润发油、干发剂、护发处理剂、染发剂、烫发剂、毛发漂白剂、发胶、发釉、美发油、毛发定
型剂、毛发保湿剂、毛发摩丝或护发气雾剂的剂型，具体可以为洗发剂、清洁剂、护发剂、焗油膏、发膜、润发剂、头皮膜、生发水、精华液、乳液、乳霜、油、雾、喷雾或发胶剂型。
65.所述组合物可以为用于皮肤外用剂的组合物。
66.在本说明书中，所述皮肤外用剂可以为乳霜、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤混悬剂、透皮贴剂、含药绷带、乳液，或其组合。所述皮肤外用剂可以根据需要与化妆品或药物等的皮肤外用剂中通常使用的成分适当组合，例如水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂、各种皮肤营养剂，或其组合。所述皮肤外用剂也可以适当地配合金属螯合剂，如依地酸二钠、依地酸三钠、柠檬酸钠、聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等；药剂，如咖啡因、单宁、维拉帕米、甘草提取物、光甘草定、植物果实的热水提取物、各种草药、醋酸生育酚、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或盐等；美白剂，如维生素c、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等；和糖类，如葡萄糖、果糖、海藻糖等。
67.所述组合物可以为药物组合物。
68.所述药物组合物可以进一步包括药学上可接受的稀释剂或载体。所述稀释剂可以为乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素、甘露醇或其组合。所述载体可以为赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或其组合。所述赋形剂可以为微晶纤维素、乳糖、低取代羟基纤维素或其组合。所述崩解剂可以为羧甲基纤维素钙、羟基乙酸淀粉钠、无水磷酸一氢钙或其组合。所述粘合剂可以为聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羟丙基纤维素或其组合。所述润滑剂可以为硬脂酸镁、二氧化硅、滑石或其组合。
69.所述药物组合物可以配制成口服或非口服给药剂型。口服剂型可以为颗粒剂、散剂、液体剂、片剂、胶囊剂、干糖浆剂等。非口服剂型可以为注射剂、软膏剂等。
70.所述组合物可以为食品组合物。所述食品组合物可以为保健功能性食品组合物。
71.在所述保健功能性食品组合物中，所述馏分可以单独使用，也可以与其他食品或食品成分组合使用，并且可以按照常规方法适当使用。活性成分的混合量可以根据使用目的(预防、保健或治疗)适当确定。通常，在制备食品或饮料时，相对于原材料，本说明书的组合物的添加量可以为50重量份或更少，或15重量份或更少。对所述保健功能性食品的种类没有特别限制。在保健功能性食品的类型中，饮料组合物可以包括各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分，就像常规饮料一样。所述天然碳水化合物为单糖，如葡萄糖和果糖等；双糖，如麦芽糖和蔗糖等；多糖，如糊精、环糊精等；和糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇等。作为调味剂，可以使用奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物等天然调味剂，或者糖精和阿斯巴甜等合成调味剂。所述保健功能性食品组合物还可以包括营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂，或其组合。所述保健功能性食品组合物还可以包括天然果汁、果汁饮料、用于制备蔬菜饮料的果肉，或其组合。
72.本发明的再一方面提供一种预防、改善或治疗个体状态的方法，其包括：向有此需要的个体处理或施用有效量的所述组合物。
73.所述个体的状态可以是指头发或头皮状态，具体可以是指与脱发相关的状态，或与头皮炎症相关的状态。
74.术语“施用”、“引入”和“植入”可互换使用，可以是指通过引导根据一具体实施例
的组合物至少部分定位至所需部位的方法或途径来将根据一具体实施例的组合物置于个体内。
75.所述施用可以通过本领域已知的方法进行。所述施用可以通过任意方式直接施用于个体，例如通过诸如静脉内、肌肉内、口服、透皮(transdermal)、粘膜、鼻内(intranasal)、气管内(intratracheal)或皮下施用的途径。所述施用可以全身或局部进行。
76.所述个体可以为哺乳动物，例如人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫。所述个体可以为需要改善头发或头皮状态的个体，例如需要促进头发生长、防止脱发、强化发根或头皮炎症抑制效果的个体。
77.所述施用可以是指每天向每个个体施用0.1mg至1000mg的根据一具体实施例的组合物，例如，0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg，或10mg至25mg。然而，剂量可以根据诸如制剂方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况、食物、施用时间、施用途径、排泄速率和反应敏感性等因素而不同地规定，本领域技术人员可以考虑这些因素适当调整剂量。施用次数可以为每天一次，或在临床上可接受的副作用范围内可施用两次或更多次，对施用部位而言，可以施用于一个或两个或更多个地方，并且施用间隔可以为每天或2天至5天，一次治疗的总施用天数可以为1天至30天。如有需要，可以在适当的时间后重复相同的治疗。对于人以外的动物，也可以使用与人类相同的每公斤剂量，或者，例如可以施用通过将所述剂量基于目标动物与人的器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)等换算而获得的量。
78.考虑到本说明书的复杂性，省略冗余内容，本说明书中未另外定义的术语具有本发明所属技术领域中通常使用的含义。
附图说明
79.图1为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)的细胞存活率(％)根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的图表。
80.图2为人毛乳头细胞(hdp)的细胞存活率(％)根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的图表。
81.图3为根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的人毛乳头细胞(hdp)的显微镜观察结果。
82.图4为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)的细胞存活率(％)根据灵芝酸a的浓度(ppm)的图表。
83.图5为人毛乳头细胞(hdp)的细胞存活率(％)根据灵芝酸a的浓度(ppm)的图表。
84.图6为根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的眼粘膜刺激试验结果的图表。
85.图7为人毛乳头细胞(hdp)中hgf表达水平的图表。
86.图8为人毛乳头细胞(hdp)中vegf表达水平的图表。
87.图9为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中kgf表达水平的图表。
88.图10为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中igf-1表达水平的图表。
89.图11为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中il-6表达水平的图表。
90.图12为毛囊长度变化的代表性图像。
91.图13为毛囊长度(mm)的图表。
92.图14为发根直径(mm)的图表。
93.图15为毛囊器官的生长期和退化期比率的图表。
具体实施方式
94.下面将结合实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅是为了示例性地描述本发明，而本发明的范围不限于这些实施例。
95.实验例1、根据提取溶剂的灵芝酸a(ganoderic acid a)含量的比较
96.灵芝10g中加入提取溶剂，在60℃下加热提取8小时后，冷却至室温(30℃)，仅取液相。然后，将通过0.5μm过滤器再次过滤所述液相而获得的滤液使用减压旋转蒸发器浓缩以获得真空干燥的粉末。
97.使用溶剂将所获得的粉末溶解至100ppm后，用0.45um过滤器过滤并用作hplc样品，通过hplc-pda系统对所述样品进行分析。使用内径4.6mm、长度250mm的不锈钢管内填充5μm用于液相色谱柱的十八烷基硅烷化硅胶的柱作为分析柱。使用水和乙腈作为流动相。
98.根据提取溶剂的粉末重量和灵芝酸a(ga)的含量如下表1所示。
99.【表1】
[0100][0101][0102]
如表1所示，经证实，当使用50％乙醇作为提取溶剂时，可以获得含有高浓度灵芝活性成分灵芝酸a的灵芝提取物。另外，当使用乙酸乙酯(ethyl acetate，ea)作为提取溶剂时，证实灵芝酸a的含量较高，因从而在纯化工艺中使用了乙酸乙酯溶剂。
[0103]
实施例1、灵芝提取物的制备
[0104]
按以下方式制备灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分。
[0105]
1.5kg的灵芝加入15kg的50％乙醇(etoh)水溶液，在60℃下加热提取8小时后，冷却至室温(30℃)，仅取液相。然后，将通过0.5μm过滤器再次过滤所述液相而获得的提取液使用减压旋转蒸发器浓缩至总液量的1/10。
[0106]
将浓缩液用乙酸乙酯(ethyl acetate)进行分馏2次，将分馏液用减压旋转蒸发器浓缩至总液量的1/10。将浓缩液用纯化水进行二次分馏后，仅回收乙酸乙酯层，将使用减压旋转蒸发器浓缩至固含量为50％的液体用作加载溶液。
[0107]
填充170g的硅胶(silica gel)并展开所述加载溶液后，展开1l的乙酸乙酯，分别接收100ml。仅将在薄层色谱(thin layer chromatography，tlc)上检测到灵芝酸a(ganoderic acid a)的馏分(fraction)使用减压旋转蒸发器进行浓缩以获得真空干燥粉末(15％或更高)。
[0108]
将灵芝酸a(ganoderic acid a)用1,3-丙二醇溶解至1800ppm至2000ppm浓度，经0.45um除菌过滤获得最终溶液。
[0109]
实验例2、细胞毒性试验(cell cytotoxicity test)
[0110]
为了确认实施例1的灵芝提取物的安全性，进行了细胞毒性试验。
[0111]
具体地，分别用不同浓度的实施例1的灵芝提取物或灵芝酸a处理人头发胚胎基质细胞(human hair germinal matrix cell，hhgmc)和人毛乳头细胞(human hair follicle dermal papilla cell，hfdpc，hdp)。未处理组用作对照组。通过用mtt试剂处理来测量细胞存活率(cell viability)。
[0112]
图1为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)的细胞存活率(％)根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的图表。
[0113]
图2为人毛乳头细胞(hdp)的细胞存活率(％)根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的图表。
[0114]
图3为根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的人毛乳头细胞(hdp)的显微镜观察结果。
[0115]
图4为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)的细胞存活率(％)根据灵芝酸a的浓度(ppm)的图表。
[0116]
图5为人毛乳头细胞(hdp)的细胞存活率(％)根据灵芝酸a的浓度(ppm)的图表。
[0117]
如图1所示，实施例1的灵芝提取物从50ppm开始显示出对人头发胚胎基质细胞(hhgmc)的细胞毒性。因此，在以下与hhgmc相关的实验中，实施例1的灵芝提取物以1ppm(当换算为灵芝酸a浓度时约为0.18ppm至0.2ppm)、5ppm(当换算为灵芝酸a浓度时约为0.9ppm至1ppm)和10ppm(当换算为灵芝酸a浓度时约为1.8ppm至2ppm)的浓度使用。
[0118]
如图2和图3所示，经证实，由于样品本身的颜色，实施例1的灵芝提取物在人毛乳头细胞(hdp)中显示出较高的mtt结果值，但是当在显微镜下观察细胞时显示出从100ppm开始的细胞毒性。因此，在以下与hdp相关的实验中，实施例1的灵芝提取物以10ppm(当换算为灵芝酸a浓度时约为1.8ppm至2ppm)、25ppm(当换算为灵芝酸a浓度时约为4.5ppm至5ppm)和50ppm(当换算为灵芝酸a浓度时约为9ppm至10ppm)的浓度使用。
[0119]
如图4和图5所示，灵芝酸a在人头发胚胎基质细胞(hhgmc)和人毛乳头细胞(hdp)中浓度达到40ppm时没有显示出细胞毒性。在以下与hhgmc相关的实验中，灵芝酸a以0.2ppm、1ppm和2ppm的浓度使用，在以下与hdp相关的实验中，灵芝酸a以2ppm、5ppm和10ppm的浓度使用。
[0120]
实验例3、眼粘膜刺激试验
[0121]
为了确认实施例1的灵芝提取物的安全性，进行了眼粘膜刺激试验。采用3d眼刺激性评价国际标准模型的mctt hce
tm
(eye irritation_2019oecd tg 492登录型号)，按照国际标准进行了实验。
[0122]
具体地，使用实施例1的灵芝提取物对预培养的人造皮肤进行组织内处理10分钟。
通过处理wst-1溶液并测量黄色甲臜(formazan)提取液的吸光度来确认细胞存活率(％)。在本眼粘膜刺激试验中，细胞存活率为35％或更低的物质判定为眼刺激性物质，而细胞存活率超过35％的物质判定为非刺激性物质。其结果值如下表2所示。
[0123]
【表2】
[0124][0125]
图6为根据实施例1的灵芝提取物的浓度(ppm)的眼粘膜刺激试验结果的图表。
[0126]
如表2和图6所示，实施例1的灵芝提取物在眼粘膜刺激试验中的细胞存活率超过35％。因此，证实了实施例1的灵芝提取物为非刺激性物质。
[0127]
实验例4、强化发根及生长头发的功效评价
[0128]
为了确认实施例1的灵芝提取物的直接再生头发的功效，进行了实验以测量与强化发根和生长头发相关的因子的表达水平。
[0129]
具体地，每个样品在人毛乳头细胞(hdp)中以不同浓度处理，并通过实时(real-time)pcr测量肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，hgf)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)的表达水平。米诺地尔(minoxidil)1ppm处理组作为阳性对照组，未处理组作为阴性对照组。hgf通过刺激毛乳头细胞促进细胞增殖来参与毛发的再生。vegf通过增加毛囊周围微血管的生成和分布度，增加营养供应，从而使头发变粗，促进生长头发。
[0130]
另外，每个样品在人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中以不同浓度处理，并通过实时(real-time)pcr测量角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，kgf)和igf-1的表达水平。咖啡因(caffeine)1ppm处理组作为阳性对照组，未处理组作为阴性对照组。kgf通过调节角质细胞(keratinocyte)的生长和分化来促进内皮细胞和新头发的生成。igf-1调节角质细胞(keratinocyte)的增殖并维持生长期状态。
[0131]
图7为人毛乳头细胞(hdp)中hgf表达水平的图表。
[0132]
图8为人毛乳头细胞(hdp)中vegf表达水平的图表。
[0133]
图9为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中kgf表达水平的图表。
[0134]
图10为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中igf-1表达水平的图表。
[0135]
如图7所示，当将灵芝酸a以2ppm、5ppm和10ppm的浓度使用时，没有增加hgf基因表
达的功效，反而，随着浓度增加，hgf基因表达减少。另一方面，当以10ppm、25ppm和50ppm的浓度使用实施例1的灵芝提取物时，证实了hgf基因表达在所有浓度下均增加，并且其功效也优于米诺地尔阳性对照组。
[0136]
如图8所示，当将灵芝酸a以5ppm或更低的浓度使用时，vegf基因表达增加，但在10ppm的浓度下没有效果。另一方面，当以10ppm、25ppm和50ppm的浓度使用实施例1的灵芝提取物时，vegf基因表达在所有浓度下均增加，特别是在10ppm的低浓度下效果优异。
[0137]
如图9所示，当以0.2ppm、1ppm或2ppm的浓度使用灵芝酸a时，没有增加kgf基因表达的功效。另一方面，当以1ppm、5ppm和10ppm的浓度使用实施例1的灵芝提取物时，证实了kgf基因表达在所有浓度下均增加，并且其功效也优于咖啡因阳性对照组。尤其，随着实施例1的灵芝提取物的浓度增加，kgf基因表达也增加。
[0138]
如图10所示，当将灵芝酸a以0.2ppm、1ppm和2ppm的浓度使用时，igf-1基因表达在所有浓度下均增加，但随着灵芝酸a浓度的增加，igf-1基因表达减少。另一方面，当以1ppm、5ppm和10ppm的浓度使用实施例1的灵芝提取物时，证实了igf-1基因表达在所有浓度下均增加，并且其功效也优于咖啡因阳性对照组。尤其，随着实施例1的灵芝提取物的浓度增加，igf-1基因表达也增加。
[0139]
因此，经证实，实施例1的灵芝提取物在人毛乳头细胞(hdp)中增加hgf和vegf的表达，在人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中增加kgf和igf-1的表达。由此可见，实施例1的灵芝提取物具有优异的强化发根效果和生长头发效果。
[0140]
实验例5、由微尘引起的脱发的缓解效果评价
[0141]
为了评价实施例1的灵芝提取物缓解由微尘引起的脱发的功效，进行了实验。
[0142]
具体地，用100ppm的pm10(粒径为10μm或更小的微尘)和样品处理人头发胚胎基质细胞(hhgmc)，并通过实时pcr测量il-6的表达水平。作为样品，使用1ppm、5ppm和10ppm的实施例1的灵芝提取物或0.2ppm、1ppm和2ppm的灵芝酸a。咖啡因(caffeine)5ppm处理组作为阳性对照组，未处理组作为阴性对照组。促炎细胞因子il-6(interleukin-6)通过诱导头发细胞老化和炎症来抑制头发生长。
[0143]
图11为人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中il-6表达水平的图表。
[0144]
如图11所示，当灵芝酸a以2ppm的浓度使用时，il-6的表达减少，而在2ppm或更低的浓度下，降低il-6表达的效果不显着或不存在。另一方面，当以1ppm、5ppm和10ppm的浓度使用实施例1的灵芝提取物时，il-6的表达在所有浓度下均大幅减少。
[0145]
由此可见，实施例1的灵芝提取物具有通过抑制由微尘引起的炎症反应来缓解由微尘引起的脱发的功效。
[0146]
实验例6、离体(ex vivo)人头皮来源毛囊培养模型的功效评价
[0147]
在离体(ex vivo)人头皮来源的毛囊培养模型中，为了评价实施例1的灵芝提取物的增加毛囊长度效果、增减发根直径效果和维持毛囊生长期效果，进行了实验。
[0148]
同样地，毛囊(hair follicle)器官的分离和培养如下进行。经首尔国立大学盆唐医院irb批准，这项研究中使用了20岁或更多且60岁或更少的没有皮肤病的韩国成年人的头皮组织。头皮组织用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次并置于灭菌培养皿中。在解剖显微镜下分离毛囊，尽量去除所分离的毛囊组织周围的脂肪组织。以真皮乳头(dermal papillar，dp)为基准剪成一定长度。在37℃和5％co2条件下，在william's e培养基(2mm l-谷氨酰
胺、10μg/ml胰岛素、10ng/ml氢化可的松、1％抗生素)中培养毛囊。
[0149]
在离体(ex vivo)人头皮来源的毛囊培养模型中，将实施例1的灵芝提取物在不同浓度下处理并培养0天、3天、6天、9天和12天后，评价了毛囊长度、发根直径、毛囊生长期维持效果。将实施例1的灵芝提取物以0.05％、0.15％和0.25％的浓度使用。将作为指标物质对照组的灵芝酸a以10ppm或20ppm的浓度使用。米诺地尔0.2ppm或咖啡因10ppm用作阳性对照组。丙二醇(载体)用作阴性对照组。
[0150]
培养第0天、第3天、第6天、第9天和第12天，使用解剖显微镜(sz51，olympus，日本)和touplite软件(touptek，中国)对毛囊进行拍照。另外，使用image j(美国国家卫生研究院(the national institutes of health)，美国)程序测量毛囊长度和发根直径。此外，还观察了头发生长周期。
[0151]
使用spss软件包程序(ibm，美国)验证了所有计算数据的统计显着性。数据的正态性通过shapiro wilk检验以及峰度和偏度进行了验证。重复测量的方差分析法(analysis of variance，repeated measures anova)用于按时间点进行前后和组间比较(p《0.05)。
[0152]
毛囊长度变化率(％)如下计算式1计算。
[0153]
【计算式1】
[0154]
毛囊长度变化率(％)＝(各时间点的毛囊长度/第0天的平均毛囊长度)
×
100-第0天的毛囊长度平均百分比(％)
[0155]
发根直径变化率(％)如下计算式2计算。
[0156]
【计算式2】
[0157]
发根直径变化率(％)＝(各时间点的发根直径/第0天的平均发根直径)
×
100-第0天的发根直径平均百分比(％)
[0158]
与毛囊生长周期相关的指标由退化期头发数量与头发总数的比率(ratio，％)表示，如下计算式3计算。
[0159]
【计算式3】
[0160]
比率(％)＝(退化期头发数/头发总数)
×
100
[0161]
(1)离体(ex vivo)毛囊长度(hair follicle length)增加效果
[0162]
图12为毛囊长度变化的代表性图像。
[0163]
图13为毛囊长度(mm)的图表。
[0164]
如图12和图13所示，经证实，实施例1的灵芝提取物在离体(ex vivo)人头皮来源的毛囊培养模型中显示出优异的毛囊长度增加效果。
[0165]
(2)离体(ex vivo)发根直径(hair bulb diameter)增加效果
[0166]
图14为发根直径(mm)的图表。
[0167]
如图14所示，经证实，实施例1的灵芝提取物在离体(ex vivo)人头皮来源的毛囊培养模型中显示出优异的发根直径增加效果。
[0168]
(3)离体(ex vivo)毛囊生长期(anagen)维持效果
[0169]
下表3显示了毛囊器官的生长期和退化期的比值。
[0170]
【表3】
[0171][0172][0173]
图15为毛囊器官的生长期和退化期比率的图表。
[0174]
如表3和图15所示，经证实，实施例1的灵芝提取物在离体(ex vivo)人头皮来源的毛囊培养模型中显示出优异的毛囊生长期维持效果。
[0175]
综上所述，实施例1的灵芝提取物在小于50ppm的浓度下对人头发胚胎基质细胞(hhgmc)没有细胞毒性，在小于100ppm的浓度下对人毛乳头细胞(hdp)没有细胞毒性，通过眼粘膜刺激试验，在10ppm至200ppm的所有浓度下均判定为非刺激性物质。因此，证实了实施例1的灵芝提取物对人体使用是安全的。
[0176]
另外，经证实，实施例1的灵芝提取物在人毛乳头细胞(hdp)中增加hgf和vegf的表达，在人头发胚胎基质细胞(hhgmc)中增加kgf和igf-1的表达，从而具有优异的强化发根效果和生长头发效果。
[0177]
另外，由于实施例1的灵芝提取物降低因pm10处理而增加的促炎细胞因子il-6的表达，因此可以抑制由微尘引起的炎症反应以缓解由微尘引起的脱发并减少头皮炎症。
[0178]
此外，经证实，在离体(ex vivo)人头皮来源的毛囊培养模型中，实施例1的灵芝提取物具有增加毛囊长度效果、增加发根直径效果和维持毛囊生长期效果。
[0179]
因此，实施例1的灵芝提取物可有效用于改善头发或头皮状态的组合物。
[0180]
根据本发明一方面的方法，可以获得具有直接防止脱发效果的灵芝乙醇提取物的
乙酸乙酯馏分。
[0181]
根据本发明一方面的灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分具有促进头发生长、防止脱发、强化发根和抑制头皮炎症的效果，尤其具有防止因微尘引起的脱发的效果，从而可以广泛应用于化妆品组合物、药物组合物、保健功能性食品组合物等各种用途。

技术特征：
1.一种灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的制备方法，其包括：(1)制备灵芝乙醇提取物；以及(2)获得所述灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：(3)通过使用乙酸乙酯作为洗脱溶剂对所述馏分进行硅胶柱层析来获得乙酸乙酯馏分。3.根据权利要求2所述的方法，其中，从所述步骤(3)获得的乙酸乙酯馏分包括灵芝酸a。4.一种化妆品组合物，其包括灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分。5.根据权利要求4所述的化妆品组合物，其用于改善头发或头皮状态。6.根据权利要求5所述的化妆品组合物，其中，所述头发或头皮状态的改善是指促进头发生长、防止脱发、强化发根和抑制头皮炎症中的一种或多种。7.根据权利要求5所述的化妆品组合物，其中，所述头发或头皮状态的改善是指防止因压力引起的脱发或因微尘引起的脱发。8.根据权利要求5所述的化妆品组合物，其中，(
ⅰ
)增加人毛乳头细胞中的肝细胞生长因子(hgf)和血管内皮生长因子(vegf)中一种或多种的表达；或者(
ⅱ
)增加人头发胚胎基质细胞中的kgf和igf-1中一种或多种的表达；或者(
ⅲ
)减少因微尘增加的促炎细胞因子il-6的表达；或者(
ⅳ
)具有增加毛囊长度、增加发根直径、维持毛囊生长期效果中的一种或多种效果。9.一种用于促进头发生长或防止脱发的药物组合物，其包括灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分。10.一种用于改善头发或头皮状态的保健功能性食品组合物，其包括灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分。

技术总结
本发明涉及一种灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分的制备方法、由所述方法制备的灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯馏分在改善头发或头皮状态中的用途。由于所述馏分在促进头发生长、防止脱发、强化发根和抑制头皮炎症，尤其是防止因压力或微尘引起的脱发方面表现优异，因此可应用于化妆品组合物、药物组合物、保健功能性食品组合物等。品组合物等。品组合物等。


技术研发人员：权瑛智 金贤娜 秋素米 薛铉静 金珍英 姜惠慜 李昭宪
受保护的技术使用者：株式会社现代百朗德
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/10/19