NK细胞冻存液的制作方法

nk细胞冻存液
技术领域
1.本发明涉及细胞储存技术领域，具体地涉及一种新型nk细胞冻存液、其制备方法以及用途。


背景技术：

2.细胞免疫治疗是指经过体外编辑培养扩增的免疫细胞输入病人体内，进而杀灭血液及组织中的病原体或癌细胞的方法。然而目前97％以上的细胞治疗临床试验采用新鲜的细胞进行治疗，受地域限制较大，使得某些病人无法在第一时间接受有效的治疗，因此低温贮藏对于实现跨区域的细胞运输对细胞免疫疗法的临床应用至关重要。
3.细胞的低温贮藏技术(也称为细胞冻存)是通过在低温或超低温(-196℃的液氮中)冷冻保存活细胞，降低细胞的代谢速度，调节和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内在的生化反应十分缓慢，甚至停止生长，从而保持细胞活性延长细胞保存年限。细胞冻存是细胞免疫治疗过程中细胞储存及运输环节中最为关键的步骤之一，冻存质量决定着复苏后细胞的存活质量和功能状态，从而影响细胞治疗的效果。不同冻存液的组成成分及形成的渗透压是冻存复苏过程中影响细胞的活率和功能的主要因素之一。fda批准的多数car-t产品通常采用含有5-10％ dmso、血清、人血清白蛋白的冻存液冻存，然后在37℃水浴复苏。与car-t产品相比，现有的car-nk的临床试验中对于nk细胞的冻存难度更大，采用常规的冻存液冻存在复苏后难以保证nk的活率、得率和功能。
4.nk细胞(natural killer cells,自然杀伤细胞)是人体防御肿瘤的第一道防线，在固有免疫系统具有重要的作用，不需要提前致敏就可以对肿瘤细胞进行直接杀伤。虽然现在nk细胞已经被用于肿瘤免疫的细胞治疗，并在临床治疗肿瘤(如白血病，淋巴瘤和黑色素瘤)有很好的效果；但对于第三方细胞库和临床施用而言，nk细胞的冻存一直是一个亟待解决的问题。具体来说，nk细胞至少包括存在外周血中的nk细胞、由ipsc分化而来nk细胞以及由ipsc分化而来并经过扩增，例如通过aapc(artificial antigen-presenting cell，表面抗原呈递细胞)扩增的nk细胞。由ipsc分化而来的nk细胞的冻存难度比外周血中的nk细胞更大，因为ipsc分化而来的nk细胞通常要经过体外扩增的步骤，而这一步是激活nk细胞的过程，nk细胞在高活性状态下更难冻存(或者说冻存后复苏的效果更差)。
5.因此，本领域需要提供一种能够有效冻存ipsc分化而来的nk细胞的冻存液，所述nk细胞在复苏后具有较高的活率、得率和杀伤功能。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于，提供一种用于nk细胞的冻存液，所述nk细胞是由ipsc分化而来和/或经过扩增的nk细胞。本发明的目的还在于，提供一种制备本发明的冻存液的方法、冻存nk细胞的方法以及确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法。
7.具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题：
8.1.一种用于nk细胞的冻存液，其中所述冻存液包含如下组分：
9.(i)10％-70％的nk细胞培养基；
10.(ii)10％-45％的右旋糖酐-40溶液；
11.(iii)任选的不超过35％的人血清白蛋白；和
12.(iv)任选的不超过70％的cs10或csb。
13.2.根据项1所述的冻存液，其中所述nk细胞培养基选自下组：复方电解质注射液rpmi-1640、xpander、x-vivo和kbm581。
14.3.根据项1或2所述的冻存液，其中所述右旋糖酐-40溶液为右旋糖酐-40的6％溶液。
15.4.根据项1-3中任一项所述的冻存液，其中所述冻存液不含外加的缓冲液或溶剂，其选自hepes和甘油。
16.5.根据项1-4中任一项所述的冻存液，其中所述冻存液不含外加的营养物，所述营养物选自下组：氯化钠、il-15、il-2、干细胞因子(scf)、葡萄糖和/或维生素。
17.6.根据项1-5中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞在其中冻存并复苏后的活率为至少35％，优选至少40％，更优选至少45％。
18.7.根据项1-6中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞在其中冻存并复苏后的得率为至少18％，优选至少20％，更优选至少22％。
19.8.根据项1-7中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞在其中冻存并复苏后的δ杀伤效果为至多60％，优选至多20％，更优选至多15％。
20.9.根据项1-8中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞是外周血中的nk细胞或由ipsc分化而来的nk细胞。
21.10.根据项9所述的冻存液，其中所述由ipsc分化而来的nk细胞是经过扩增的nk细胞，优选为经过aapc扩增的nk细胞。
22.11.一种制备根据项1-10中任一项所述的冻存液的方法，其包括：
23.(1)分别提供组分(i)、(ii)、任选的(iii)和任选的(iv)；
24.(2)将(1)中提供的组分加以混合得到混合液；
25.(3)将所述混合液进行除菌，得到用于nk细胞的冻存液。
26.12.根据项11所述的方法，其中所述的除菌为过滤除菌，优选通过0.22μm的细菌过滤器进行。
27.13.一种冻存nk细胞的方法，其包括：
28.(1)在nk细胞中加入根据项1-10中任一项所述的冻存液，移入冻存管中；
29.(2)将所述冻存管降温至-90℃以下冻存。
30.14.项1-10任一项所述的冻存液在冻存nk细胞中的用途。
31.15.一种确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法，其包括：
32.(1)提供待冻存的nk细胞；
33.(2)在待冻存的nk细胞中加入冻存液，移入冻存管中，并将所述冻存管降温至-90℃以下冻存；
34.(3)将冻存的nk细胞复苏，并测定复苏的nk细胞的活率、得率和δ杀伤效果；和
35.(4)根据步骤(3)的结果确定冻存液冻存nk细胞的效果。
36.16.根据项15所述的方法，其中所述nk细胞是外周血中的nk细胞或由ipsc分化而
来的nk细胞。
37.17.根据项16所述的冻存液，其中所述由ipsc分化而来的nk细胞是经过扩增的nk细胞，优选为经过aapc扩增的nk细胞。
38.18.根据项15-17中任一项所述的方法，其中所述活率是指复苏后所得到的活nk细胞数占总nk细胞数的比例，所述得率是指复苏后的活nk细胞数与冻存前活nk细胞数的比例，所述δ杀伤效果是指复苏后的nk细胞杀伤能力与冻存前nk细胞杀伤能力相比下降的幅度。
39.借由上述技术方案，本发明的nk细胞冻存液及其制备方法和用途至少具有如下优势：
40.1.本发明的冻存液既适于冻存外周血中的nk细胞，又适于冻存由ipsc分化而来的nk细胞以及由ipsc分化而来并经过扩增(优选经过aapc扩增)的nk细胞。由ipsc分化而来的nk细胞由于涉及激活nk细胞的过程因而其冻存难度比外周血中的nk细胞更大，现有技术对此几乎从未提及；
41.2.使用本发明的冻存液冻存的nk细胞在复苏后，具有比使用其他冻存液更高的活率、得率和杀伤功能，不仅能够在冻存过程中有效保护nk细胞不被破坏，而且能够尽可能多地实现其原有的杀伤效果。
42.上述内容仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术内容并予以实施，以下结合本发明的优选实施方案并配合附图详细说明如下。
附图说明
43.图1为显示本发明的冻存液冻存nk细胞的过程以及确定本发明的冻存液冻存nk细胞的效果的示意图；
44.图2a显示在本发明的冻存液中冻存的pbnk细胞复苏后的活率；图2b显示在本发明的冻存液中冻存的pbnk细胞复苏后的得率；
45.图3a显示在本发明的冻存液中冻存的oi42-enk细胞复苏后的活率；图3b显示在本发明的冻存液中冻存的oi42-enk细胞复苏后的得率；图3c显示在本发明的冻存液中冻存的oi42-enk细胞复苏后的体外杀伤能力；图3d显示在本发明的冻存液中冻存48小时的oi42-enk细胞复苏后的δ杀伤效果；
46.图4a显示在本发明的冻存液中冻存的kb15-enk细胞复苏后的活率；图4b显示在本发明的冻存液中冻存的kb15-enk细胞复苏后的得率；
47.图5a显示本发明的冻存液中冻存的qn-023a enk细胞复苏后的活率；图5b显示在本发明的冻存液中冻存的qn-023a enk细胞复苏后的得率；图5c显示在本发明的冻存液中冻存的qn-023a enk细胞复苏后体外杀伤能力(48小时和thp-1细胞共温育，效应细胞:靶细胞＝1:1)；图5d显示在本发明的冻存液中冻存48小时的qn-023a enk细胞复苏后的δ杀伤效果。
48.发明详述
49.i.定义
50.除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者
类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
51.本技术所使用的术语“细胞冻存”是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于低温或超低温中保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在有需要的时候在将细胞复苏使用。此外，适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而丢种，从而起到细胞保种的作用。
52.本技术所使用的术语“细胞冻存液”或“冻存液”是将细胞冻存于其中的制剂或组合物，其通常含有5-10％ dmso、血清、人血清白蛋白等组分。但常规的冻存液并不适合冻存nk细胞，尤其是由ipsc分化而来nk细胞。
53.本技术所使用的术语“nk细胞”通常来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结，也可通过诱导多能干细胞(ipsc)分化而来。nk细胞不同于t细胞和b细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。
54.本技术所使用的术语“诱导多能干细胞(ipsc)”通常是指源自已被诱导或改变(即重编程)入能够分化成所有三个胚层或真皮层的组织：中胚层、内胚层和外胚层的细胞的分化细胞(例如，分化的成人、新生儿或胎儿细胞)的干细胞。产生的ipsc并非指在自然界中存在的细胞。在一些情况下，ipsc可被改造成直接分化为定型细胞(例如，nk细胞)。在某些情况下，ipscs可被改造成首先分化为组织特异性干细胞(例如，造血干细胞(hsc))，后者可被进一步诱导成分化为定型细胞(例如，nk细胞)。
55.本技术所使用的术语“nk细胞培养基”是指能够支持nk细胞生长的物质以及其配制物或混合物。本领域中使用的nk细胞培养基包括但不限于：rpmi-1640、复方电解质注射液xpander、x-vivo和kbm581。
56.本技术中所使用的术语“cs10”和“csb”分别指本领域常用的商业上可得到的防冻液，它们都不含血清和任何动物成分。其中cs10含有10％dmso，而csb不含dmso。
57.本技术所使用的术语“活率”是指复苏后所得到的活nk细胞数占总nk细胞数的比例。活率越高表示冻存液的冻存效果越好。
58.本技术所使用的术语“得率”是指复苏后的活nk细胞数与冻存前活nk细胞数的比例。得率越高表示冻存液的冻存效果越好。
59.本技术所使用的术语“δ杀伤效果”是指复苏后的nk细胞杀伤能力与冻存前nk细胞杀伤能力相比下降的百分数。δ杀伤效果越小表示冻存液的冻存效果越好。
60.ii.本发明的冻存液
61.为更进一步阐述本发明为达成发明目的所采取的技术手段及实现的技术效果，以下结合附图，对根据本发明的nk细胞冻存液及其制备方法和用途进行详细说明。
62.在一个实施方案中，本发明提供了一种用于nk细胞的冻存液，其中所述冻存液包含如下组分：
63.(i)nk细胞培养基；
64.(ii)聚糖类非渗透性保护剂，优选为右旋糖酐，更优选为右旋糖酐-40溶液；
65.(iii)任选的蛋白类非渗透性保护剂，优选为人血清白蛋白；和
66.(iv)任选的商业防冻剂。
67.在一个实施方案中，本发明提供了一种用于nk细胞的冻存液，其中所述冻存液包含如下组分(按重量计)：
68.(i)10％-70％的nk细胞培养基；
69.(ii)10％-45％的右旋糖酐-40溶液；
70.(iii)任选的不超过35％的人血清白蛋白；和
71.(iv)任选的不超过70％的cs10或csb
72.在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液中的nk细胞培养基是任何能够支持nk细胞生长的组分，其包括但不限于复方电解质注射液rpmi-1640、xpander、x-vivo和kbm581。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液含有10％-70％(按重量计)的nk细胞培养基。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液含有10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％和70％(按重量计)的nk细胞培养基。
73.在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液中包含的聚糖类非渗透性保护剂为右旋糖酐，其包括但不限于中分子右旋糖酐(dextran-70)、低分子右旋糖酐(dextran-40)和小分子右旋糖酐(dextran-10)。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液包含10％-45％(按重量计)的右旋糖酐-40溶液(6％)。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液包含10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％(按重量计)的右旋糖酐-40溶液(6％)。
74.在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液中包含或者不包含蛋白类非渗透性保护剂，所述蛋白类非渗透性保护剂可为人血清白蛋白。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液任选地包含不超过35％(按重量计)的人血清白蛋白。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液不包含人血清白蛋白，或者任选地包含5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％(按重量计)的人血清白蛋白。
75.在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液包含或者不包含商业防冻剂，优选地所述商业防冻剂选自cs10或csb。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液任选地包含不超过60％(按重量计)的cs10或csb。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液不包含cs10或csb，或者任选地包含5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，
63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％(按重量计)的cs10或csb。
76.在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液除上述(i)-(iv)的成分外不含外加的缓冲液或溶剂。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液除上述(i)-(iv)的成分外不含hepes和/或pbs。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液除上述(i)-(iv)的成分外不含外加的营养物。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液除上述(i)-(iv)的成分外不含氯化钠、il-15、il-2、干细胞因子(scf)、葡萄糖和/或维生素。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液除上述(i)-(iv)的成分外不含氯化钠注射液(0.9％)。在一个实施方案中，本发明的nk细胞的冻存液除上述(i)-(iv)的成分外不含10％葡萄糖注射液或50％葡萄糖注射液。
77.在一个实施方案中，将nk细胞在本发明的nk细胞的冻存液中冻存并复苏后的活率为至少35％，优选至少40％，更优选至少45％。在一个实施方案中，将nk细胞在本发明的nk细胞的冻存液中冻存并复苏后的得率为至少18％，优选至少20％，更优选至少22％。在一个实施方案中，将nk细胞在本发明的nk细胞的冻存液中冻存并复苏后的δ杀伤效果至多60％，优选至多20％，更优选至多15％。
78.在一个实施方案中，在本发明的nk细胞的冻存液中冻存的nk细胞是外周血中的nk细胞或由ipsc分化而来的nk细胞。在一个实施方案中，在本发明的nk细胞的冻存液中冻存的nk细胞是由ipsc分化而来、并经过扩增的nk细胞。在一个实施方案中，在本发明的nk细胞的冻存液中冻存的nk细胞是由ipsc分化而来、并经过aapc扩增的nk细胞。
79.iii.制备本发明的冻存液的方法和冻存nk细胞的方法
80.在一个实施方案中，本发明提供了一种制备本发明的冻存液的方法，其包括：
81.(1)分别提供如上所述的组分(i)-(ii)、任选的(iii)和/或(iv)；
82.(2)将(1)中提供的组分加以混合得到混合液；
83.(3)将所述混合液进行除菌，得到用于nk细胞的冻存液。
84.在一个实施方案中，本发明的冻存液的制备方法中的除菌为过滤除菌。在一个实施方案中，本发明的冻存液的制备方法中的除菌通过0.22μm或0.45μm的细菌过滤器进行。在一个实施方案中，本发明的冻存液的制备方法中的除菌通过0.22μm的细菌过滤器进行。
85.在一个实施方案中，本发明提供了一种使用本发明的冻存液来冻存nk细胞的方法，其包括：
86.(1)在nk细胞中加入根据本发明的冻存液，移入冻存管中；
87.(2)将所述冻存管降温至-90℃以下冻存。
88.在一个实施方案中，本发明冻存nk细胞的方法中的步骤(2)优选为将所述冻存管在液氮中冻存。
89.iv.本发明的冻存液的用途和确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法
90.在一个实施方案中，本发明提供了本发明的冻存液用于冻存nk细胞中的用途。在一个实施方案中，提供了本发明的冻存液用于冻存外周血中的nk细胞的用途。在一个实施方案中，提供了本发明的冻存液用于冻存由ipsc分化而来的nk细胞的用途。在一个实施方案中，在一个实施方案中，提供了本发明的冻存液用于冻存由ipsc分化而来、并经过扩增的nk细胞的用途。在一个实施方案中，提供了本发明的冻存液用于冻存由ipsc分化而来、并经
过aapc扩增的nk细胞的用途。
91.在一个实施方案中，本发明提供了一种确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法，其包括：
92.(1)提供待冻存的nk细胞；
93.(2)在待冻存的nk细胞中加入冻存液，移入冻存管中，并将所述冻存管降温至-90℃以下冻存；
94.(3)将冻存的nk细胞复苏，并测定复苏的nk细胞的活率、得率和δ杀伤效果；和
95.(4)根据步骤(3)的结果确定冻存液冻存nk细胞的效果。
96.在一个实施方案中，在本发明用于确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法中所述nk细胞是外周血中的nk细胞或由ipsc分化而来的nk细胞。在一个实施方案中，在本发明用于确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法中所述nk细胞是由ipsc分化而来、并经过扩增的nk细胞。在一个实施方案中，在本发明用于确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法中所述nk细胞是由ipsc分化而来、并经过aapc扩增的nk细胞。
97.在一个实施方案中，nk细胞的活率是指复苏后所得到的活nk细胞数占总nk细胞数的比例(复苏后的活nk细胞数/总nk细胞数*100％)。在一个实施方案中，nk细胞的得率是指复苏后所得到的活nk细胞数与冻存前活nk细胞数的比例(复苏后的活nk细胞数/冻存前活nk细胞数*100％)。在一个实施方案中，nk细胞的δ杀伤效果是指复苏后的nk细胞杀伤能力与冻存前nk细胞杀伤能力相比下降的百分数((冻存前nk细胞杀伤能力-复苏后的nk细胞杀伤能力)/冻存前nk细胞杀伤能力*100％)。在一个实施方案中，nk细胞杀伤能力标准化至nalm6 fluo。在一个实施方案中，本发明nk细胞的复苏通过将冻存有nk细胞的冻存管从低温中取出，于37-40℃的水浴中融化。
98.需要说明的是，本技术中测定的上述指标是nk细胞复苏后当天(d0)、第一天(d1)、第二天(d2)和/或第三天(d3)的活率和得率，以及复苏当天对急性淋巴白血病细胞(nalm6)的杀伤能力。其中，本技术优选nk细胞复苏后第1天的活率和得率作为筛选冻存液的指标，是因为在复苏后几个小时到一天之内，受损伤细胞会逐渐死亡，在复苏后第1天达到最低值后细胞状态会逐渐恢复，且增殖能力也逐渐恢复。因此nk细胞复苏后第一天的活率和得率最能反映冻存液的效果。此外，对肿瘤细胞的杀伤能力是nk细胞区别于大多数其他细胞的重要性质，因此本技术也将δ杀伤效果作为功能评价指标之一。
具体实施方式
99.下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施例并不能被理解为是对本发明保护范围的限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对这些具体实施例作出多种变更或修改，所述变更和修改后的实施方案仍落入本发明的保护范围。
100.以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。
101.实施例的冻存液中所使用的成分均选用医用注射级别的市售品，成分明确，可直接输入人体，方便快捷，无安全风险，并可以通过公开渠道购买获得。
102.实施例中使用的外周血nk(pbnk)细胞从上海赛笠生物科技有限公司(批号：slb-cd56nk-05b+)获得。
103.实施例中使用的ipsc nk细胞(kb15 enk和oi42 enk)细胞由杭州启函生物科技有限公司提供。所述细胞是采用从脐带血中分离的人cd34+细胞基于zhu h和kaufman d s,an improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells,methods mol biol.,2019；2048:107-119中所描述的方法获得的。实施例中使用的qn-023a细胞由杭州启函生物科技有限公司提供。其制备方法可参见pct/cn2022/090508。
104.本发明全部操作均在标准gmp实验室进行，并进行质量监测，包括细菌及真菌污染检测、细胞内毒素检测、细胞活率检测、细胞得率检测、细胞杀伤能力检测等。
105.实施例1.nk细胞冻存液的制备
106.本实施例根据本发明提供的冻存液制备方法，按照下表1中的配方制备了本发明的23种nk细胞冻存液。
107.表1.nk细胞冻存液的配方
108.[0109][0110]
实施例2.pbnk细胞的冻存
[0111]
制备好冻存液后，根据本发明提供的冻存nk细胞的方法对来自外周血的nk细胞(pbnk细胞)进行冻存实验。由于pbnk采用x-vivo作为扩增培养基，因此，表i中的nk细胞培养基组分选用x-vivo。
[0112]
冻存nk细胞的具体步骤如下：
[0113]
(1)将来自外周血的nk细胞制成细胞悬液；
[0114]
(2)将细胞悬液加入离心管中，在2000-3000rpm的条件下，离心5分钟；
[0115]
(3)弃去上清，每支冻存管加入适量生理盐水，调整细胞浓度为约3.5x107个细胞/ml，计数活的pbnk细胞数作为冻存前活nk细胞数，在2000-3000rpm的条件下，离心5分钟；
[0116]
(4)弃去上清，每支冻存管加入约1.5ml实施例1制备得到的nk细胞冻存液1-22和24号，在4℃条件下预冷，并调整细胞浓度为为约3.5x107个细胞/ml；
[0117]
(5)将冻存管放入程序降温仪，启动预制程序，约1.5小时完成冻存；
[0118]
(6)将冻存管转入液氮中进行冻存。
[0119]
(7)细胞复苏：冻存至一定的时间后，将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，注意细胞液面一定要完全浸入水面以下，冻存管口高于水面，快速摇晃使细胞在1分钟内融化，待液体中有米粒大小的冰晶，从水浴锅中取出。复苏后的细胞加入到x-vivo培养基中观察。
[0120]
(8)复苏后细胞计数：从复苏后的细胞悬液中，吸取20微升，通过标准的吖啶橙/碘化丙啶(ao/pi)规程，使用countstar细胞计数仪对复苏后活的nk细胞数和复苏后总的nk细胞数分别进行计数，重复三次。分别计算nk细胞复苏后的活率和得率，以平均值
±
标准偏差表示。实验结果如表2以及图2a和图2b所示。
[0121]
表2.不同冻存液冻存的pbnk细胞复苏后1天的活率和得率
[0122]
[0123][0124]
由表2的实验结果可知，含有外加的缓冲液hepes的20号配方的活率和得率最低，说明外加缓冲液会降低冻存液的冻存效果。全部采用商业防冻剂csb的24号配方、全部采用商业防冻剂cs10的17号配方和含有绝大部分(92％)商业防冻剂cs10和少量(8％)dmso的3号配方的活率和得率也不佳，说明全部采用或主要采用商业防冻剂的配方虽然配制简单，但其冻存效果不佳。通过配方12与配方5、14和20的比较可知，当hsa在冻存液中的含量超过35％时，冻存液的活率下降明显。通过配方18、4和19的比较可知，当在冻存液中含有外加的氯化钠或者葡萄糖时，冻存液的得率和活率均有明显下降。
[0125]
对表1中的21种冻存液配方的活率进行排序，活率超过45％的配方分别为：配方21、配方18、配方22、配方9、配方12、配方10和配方6。在这8个配方中得率超过20％的配方分别为：配方21、配方18、配方9、配方22和配方10。将这5个综合考虑活率和得率优于其他配方的配方在由ipsc分化而来的enk细胞上进行测试。
[0126]
实施例3.oi42-enk细胞的冻存
[0127]
根据本发明提供的冻存nk细胞的方法对由ipsc分化而来的nk细胞(oi42-enk细胞)进行冻存实验。由于enk采用kbm581作为基础培养基，因此，表i中的nk细胞培养基组分选用kbm581。
[0128]
采用与实施例2基本类似的方法进行oi42-enk细胞的冻存和复苏实验，实验结果
如图3a、图3b、图3c和图3d所示。
[0129]
综合考虑oi42 enk细胞复苏后的活率、得率以及δ杀伤效果的结果可知，与配方9-10相比，采用配方18和21-22冻存的oi42-enk细胞的活率和得率更佳；与配方9和22相比，采用配方10、18和21冻存的oi42-enk细胞的杀伤能力更强。
[0130]
实施例4.kb15 enk细胞的冻存
[0131]
根据本发明提供的冻存nk细胞的方法对由ipsc分化而来的nk细胞(kb15 enk细胞)进行冻存实验。同样地，由于enk采用kbm581作为基础培养基，因此，表i中的nk细胞培养基组分选用kbm581。
[0132]
采用与实施例2-3基本类似的方法进行kb15 enk细胞的冻存和复苏实验，实验结果如图4a和图4b所示。
[0133]
结果显示，采用配方21和配方10冻存的kb15 enk细胞在复苏后同样具有优异的活率和得率。
[0134]
实施例5.qn-023a enk细胞的冻存
[0135]
根据本发明提供的冻存nk细胞的方法对由ipsc分化而来的经过基因编辑的nk细胞(qn-023a enk细胞)进行冻存实验。同样地，由于enk采用kbm581作为基础培养基，因此，表i中的nk细胞培养基组分选用kbm581。
[0136]
采用与实施例2-4基本类似的方法进行qn-023a enk细胞的冻存和复苏实验，实验结果如图5a、图5b、图5c和图5d所示。
[0137]
综合考虑qn-023a enk细胞复苏后的活率、得率以及δ杀伤效果的结果可知，与配方9、18和22相比，采用配方10和21冻存的qn-023a enk细胞的活率和得率更佳；与配方10、18和22相比，采用配方9和21冻存的qn-023a enk细胞的杀伤能力更强。
[0138]
以上所述，仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。本领域的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对上述披露的技术内容作出多种变更或修改，这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于nk细胞的冻存液，其中所述冻存液包含如下组分：(i)10％-70％的nk细胞培养基；(ii)10％-45％的右旋糖酐-40溶液；(iii)任选的不超过35％的人血清白蛋白；和(iv)任选的不超过70％的cs10或csb。2.根据权利要求1所述的冻存液，其中所述nk细胞培养基选自下组：复方电解质注射液rpmi-1640、xpander、x-vivo和kbm581。3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其中所述右旋糖酐-40溶液为右旋糖酐-40的6％溶液。4.根据权利要求1-3中任一项所述的冻存液，其中所述冻存液不含外加的缓冲液或溶剂，其选自hepes和甘油。5.根据权利要求1-4中任一项所述的冻存液，其中所述冻存液不含外加的营养物，所述营养物选自下组：氯化钠、il-15、il-2、干细胞因子(scf)、葡萄糖和/或维生素。6.根据权利要求1-5中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞在其中冻存并复苏后的活率为至少35％，优选至少40％，更优选至少45％。7.根据权利要求1-6中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞在其中冻存并复苏后的得率为至少18％，优选至少20％，更优选至少22％。8.根据权利要求1-7中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞在其中冻存并复苏后的δ杀伤效果为至多60％，优选至多20％，更优选至多15％。9.根据权利要求1-8中任一项所述的冻存液，其中所述nk细胞是外周血中的nk细胞或由ipsc分化而来的nk细胞。10.根据权利要求9所述的冻存液，其中所述由ipsc分化而来的nk细胞是经过扩增的nk细胞，优选为经过aapc扩增的nk细胞。11.一种制备根据权利要求1-10中任一项所述的冻存液的方法，其包括：(1)分别提供组分(i)、(ii)、任选的(iii)和任选的(iv)；(2)将(1)中提供的组分加以混合得到混合液；(3)将所述混合液进行除菌，得到用于nk细胞的冻存液。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的除菌为过滤除菌，优选通过0.22μm的细菌过滤器进行。13.一种冻存nk细胞的方法，其包括：(1)在nk细胞中加入根据权利要求1-10中任一项所述的冻存液，移入冻存管中；(2)将所述冻存管降温至-90℃以下冻存。14.权利要求1-10任一项所述的冻存液在冻存nk细胞中的用途。15.一种确定冻存液冻存nk细胞的效果的方法，其包括：(1)提供待冻存的nk细胞；(2)在待冻存的nk细胞中加入冻存液，移入冻存管中，并将所述冻存管降温至-90℃以下冻存；(3)将冻存的nk细胞复苏，并测定复苏的nk细胞的活率、得率和δ杀伤效果；和
(4)根据步骤(3)的结果确定冻存液冻存nk细胞的效果。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述nk细胞是外周血中的nk细胞或由ipsc分化而来的nk细胞。17.根据权利要求16所述的冻存液，其中所述由ipsc分化而来的nk细胞是经过扩增的nk细胞，优选为经过aapc扩增的nk细胞。18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述活率是指复苏后所得到的活nk细胞数占总nk细胞数的比例，所述得率是指复苏后的活nk细胞数与冻存前活nk细胞数的比例，所述δ杀伤效果是指复苏后的nk细胞杀伤能力与冻存前nk细胞杀伤能力相比下降的幅度。

技术总结
本发明涉及一种用于NK细胞的冻存液，所述NK细胞是由iPSC分化而来和/或经过aAPC扩增的NK细胞。所述冻存液包含或由如下组分组成：NK细胞培养基、右旋糖酐-40、任选的人血清白蛋白和商业防冻液。本发明的冻存液大大提高了NK细胞复苏后的得率、活率和杀伤能力。本发明还提供了制备所述冻存液的方法和使用所述冻存液冻存细胞的方法。冻存细胞的方法。


技术研发人员：赵娟娟 陈静 盛涵樱 郭亭亭 李婷 杨璐菡
受保护的技术使用者：杭州启函生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/10/19