卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法以及多糖的含量检测方法与流程

1.本发明涉及药物检测技术领域，特别是涉及一种卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法以及多糖的含量检测方法。


背景技术：

2.卡介菌多糖核酸注射液(bcg polysaccharide nucleic acid，bcg-psn)是用卡介菌(bacillus calmette-gu
é
rin，bcg)培养后收集菌体，采用热酚法提取纯化菌体中的多糖与核酸，经纯化后灭菌并采用生理氯化钠溶液配置而成。bcg-psn中，多糖含量为0.28～0.42mg/ml，核酸含量为40～100μg/ml。bcg-psn是我国首创的免疫调节剂，具有显著的免疫调节、抗炎和抗过敏作用，临床用于多种免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾病，如难治性肺结核、支气管哮喘、支气管炎、病毒感染性疾病及皮肤变态反应疾病等。然而，bcg-psn的组成成分复杂，质量较难以控制，存在潜在的不良反应风险，影响其药用价值和在同类药物中的市场竞争力。
3.传统方法中对于卡介菌多糖核酸注射液的质量控制方法通常是对其多糖含量进行检测。如《中国生物制品规程2000版》中采用蒽酮法测定多糖含量，另外有方法采用碘法测定多糖含量，以及采用邻甲苯胺法测定总还原糖。然而，这些方法对于多糖含量的检测结果容易出现偏差，重复性和准确性不高，难以进行复杂多糖的检测和含量分析。


技术实现要素：

4.基于此，本发明提供一种能够全面、准确地反应卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量的指纹图谱构建方法以及检测方法。
5.本发明的第一方面，提供一种卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，以及对所述对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
6.其中，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：
7.将甘露糖、核糖、葡萄糖和阿拉伯糖溶于水，制备混合单糖溶液；
8.于所述混合单糖溶液中加入酸进行水解反应，制备混合单糖水解液；
9.将所述混合单糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应，制备所述对照品；
10.所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
11.取卡介菌多糖核酸原料或制剂，加入酸进行水解反应，制备多糖水解液；
12.将所述多糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应，制备所述供试品；
13.所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相为乙腈与盐类缓冲液的混合物，洗脱方式为梯度洗脱或等度洗脱。
14.在其中一个实施例中，所述流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为10％～20％的乙腈的盐类缓冲液，流动相b为体积浓度为35％～45％的乙腈的盐类缓冲液，洗脱方式为梯度洗脱；或，
15.所述流动相包括流动相c和流动相d，流动相c为盐类缓冲液，流动相d为乙腈，洗脱方式为等度洗脱。
16.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的过程包括：流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％；或，
17.所述等度洗脱的过程中，保持流动相c与流动相d的体积分数比为80％～85％:20％～15％。
18.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的过程包括：在0至(20～30)min的时间，流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％。
19.在其中一个实施例中，所述盐类缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸铵缓冲液或乙酸钠缓冲液。
20.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱检测的条件还包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为20℃～30℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为240nm～260nm。
21.在其中一个实施例中，水解反应的条件包括：温度为100℃～120℃，时间为2h～5h；及/或水解反应采用的所述酸为三氟乙酸、硫酸和盐酸中的一种或多种。
22.在其中一个实施例中，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应的条件包括：温度为60℃～80℃，时间为20min～70min。
23.在其中一个实施例中，所述指纹图谱包含4个特征峰，分别记作1号峰、2号峰、3号峰和4号峰，以3号峰为参照峰；其中，1号峰为甘露糖，2号峰为核糖，3号峰为葡萄糖，4号峰为阿拉伯糖。
24.本发明的第二方面，提供一种卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，包括用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备、待测品溶液的制备，以及对所述用于绘制标准曲线的对照品溶液和待测品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
25.其中，所述用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备包括如下步骤：
26.将对照品溶于水，制备不同浓度的对照品溶液；所述对照品为一种单糖或多种单糖的混合；
27.于所述对照品溶液中加入酸进行水解反应，制备对照品水解液；
28.将所述对照品水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化反应，制备所述用于绘制标准曲线的对照品溶液；
29.所述待测品溶液的制备包括如下步骤：
30.取待测卡介菌多糖核酸原料或制剂，加入酸进行水解反应，制备多糖水解液；
31.将所述多糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应，制备所述待测品溶液；
32.将所述用于绘制标准曲线的对照品溶液进行高效液相色谱检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
33.将所述待测品溶液进行高效液相色谱检测，检测结果代入所述标准曲线，计算所
述单糖的含量，根据所述单糖的含量计算所述卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量；
34.所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相为乙腈与盐类缓冲液的混合物，洗脱方式为梯度洗脱或等度洗脱。
35.在其中一个实施例中，所述流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为10％～20％的乙腈的盐类缓冲液，流动相b为体积浓度为35％～45％的乙腈的盐类缓冲液，洗脱方式为梯度洗脱；或，
36.所述流动相包括流动相c和流动相d，流动相c为盐类缓冲液，流动相d为乙腈，洗脱方式为等度洗脱。
37.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的过程包括：流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％；或，
38.所述等度洗脱的过程中，保持流动相c与流动相d的体积分数比为80％～85％:20％～15％。
39.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的过程包括：在0至(20～30)min的时间，流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％。
40.在其中一个实施例中，所述盐类缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸铵缓冲液或乙酸钠缓冲液。
41.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱检测的条件还包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为20℃～30℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为240nm～260nm。
42.在其中一个实施例中，水解反应的条件包括：温度为100℃～120℃，时间为2h～5h；及/或，所述酸为三氟乙酸、硫酸和盐酸中的一种或多种。
43.在其中一个实施例中，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应的条件包括：温度为60℃～80℃，时间为20min～70min。
44.在其中一个实施例中，所述对照品为甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、和阿拉伯糖中的一种或多种的混合。
45.在其中一个实施例中，所述对照品为葡萄糖。
46.本发明的第三方面，提供第一方面所述的构建方法构建的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱，和/或第二方面所述的含量检测方法在卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制中的应用。
47.本发明所述的含量检测方法在卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制中的应用，当卡介菌多糖核酸注射液中甘露糖(man)/葡萄糖(glc)含量校正因子范围为0.05-0.12时，所述卡介菌多糖核酸注射液产品合格。
48.本发明对卡介菌多糖核酸原料或制剂的物质基础进行深入研究发现，卡介菌多糖核酸原料或制剂中主要成分多糖和核酸均为大分子物质，直接对其进行质量分析及质量控制极其困难。
49.基于此，本发明通过对卡介菌多糖核酸原料或制剂进行反复地实验摸索，建立了一套全面、准确的多糖分析方法，包含多糖的指纹图谱的构建和/或多糖的含量检测。具体地，采用酸完全水解卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖，并进行pmp衍生化反应，结合高效液相色谱进行指纹图谱构建，并对卡介菌多糖核酸原料或制剂的多糖中的单糖含量进行定
量分析，进而由单糖含量计算卡介菌多糖核酸原料或制剂中的多糖含量。所述方法的优势在于能够有效避免核酸大分子的干扰，以及对多糖水解衍生化后进行hplc准确定性和定量分析。且由于适用高效液相色谱检测，能够方便地对卡介菌多糖核酸原料或制剂进行日常质量控制和检测，可用于卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制。
50.本发明的一方面，建立了卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，通过先对卡介菌多糖核酸原料或制剂进行酸水解，以及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)柱前衍生化，然后在合适的高效液相色谱条件下进行分离检测，如此构建获得了包含4个特征峰的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱，同时方法的重复性、精密度较高，如此能够对卡介菌多糖核酸原料或制剂进行全面、准确的检测分析，能够反映卡介菌多糖核酸原料或制剂质量的稳定性以及品质的差异，为卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制提供切实可靠的依据。
51.本发明的又一方面，建立了卡介菌多糖核酸原料或制剂中的多糖含量检测方法，通过先对单糖(如葡萄糖)进行酸水解，以及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)柱前衍生化，然后在合适的高效液相色谱条件下进行分离检测，如此构建获得了单糖的标准曲线，该标准曲线线性关系较好，能够对卡介菌多糖核酸原料或制剂的多糖的含量进行准确的检测。
52.本发明的再一方面，综合利用前述方法可以单独或同步进行卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建和其中多糖含量检测，如此为卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量标准的提升及完善提供全面的科学依据与参考，促进卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量提高和稳定。同时，采用高效液相色谱法检测，方便用于卡介菌多糖核酸原料或制剂质量控制的日常检测。
附图说明
53.图1为流动相为乙腈和乙酸铵缓冲液的单糖组成hplc分析图；
54.图2为流动相为乙腈和磷酸盐缓冲液的单糖组成hplc分析图；
55.图3为方法学验证中系统适用性重叠图；
56.图4为方法学验证中专属性重叠图；
57.图5为方法学验证中线性关系图；
58.图6为方法学验证中线性重叠图；
59.图7为方法学验证中重复性重叠图；
60.图8为方法学验证中中间精密度重叠图；
61.图9为方法学验证中稳定性(供试品放置于冰盒中)重叠图；
62.图10为方法学验证中稳定性(供试品放置于样品盘中)重叠图；
63.图11为方法学验证中回收率部分典型图谱重叠图；
64.图12为方法学验证中流速1.0ml/min，柱温25℃条件下hplc重叠图；
65.图13为方法学验证中流速0.9ml/min，柱温25℃条件下hplc重叠图；
66.图14为方法学验证中流速1.1ml/min，柱温25℃条件下hplc重叠图；
67.图15为方法学验证中流速1.0ml/min，柱温20℃条件下hplc重叠图；
68.图16为方法学验证中流速1.0ml/min，柱温30℃条件下hplc重叠图；
69.图17为方法学验证中磷酸缓冲液ph6.8条件下hplc重叠图；
70.图18为方法学验证中磷酸缓冲液ph7.0条件下hplc重叠图；
71.图19为方法学验证中0～25min流动相a体积分数由100％变化至75％，流动相b体积分数由0％变化至25％条件下hplc重叠图；
72.图20为方法学验证中流动相a为10％乙腈的磷酸盐缓冲(ph6.9)，流动相b为45％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)条件下hplc重叠图；
73.图21为方法学验证中流动相a为20％的乙腈的磷酸盐缓冲(ph6.9)，流动相b为35％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)条件下hplc重叠图；
74.图22为20批卡介菌多糖核酸注射液的单糖组成hplc分析图；
75.图23为20批卡介菌多糖核酸注射液的单糖组成指纹图谱；
76.图24为卡介菌多糖核酸注射液的对照特征图谱；
77.图25为hpgpc法分析卡介菌多糖核酸样品的示差检测色谱图；
78.图26为hpgpc法分析卡介菌多糖核酸样品的紫外检测色谱图(λ＝260nm)。
具体实施方式
79.以下结合具体实施例对本发明的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法以及多糖的含量检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
80.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
81.本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
82.本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。
83.本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
84.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
85.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
86.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
87.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
88.本发明中涉及的溶液，如无特别说明，溶剂均为水。
89.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
90.本发明中，所述卡介菌多糖核酸原料是指采用《中国药典》2010年版第二增补本(400-402页)卡介菌多糖核酸注射液标准中2.2项下方法制备得到的精制卡介菌多糖核酸。
91.本发明中，所述卡介菌多糖核酸制剂为卡介菌多糖核酸注射液，依《中国药典》2010年版第二增补本(400-402页)卡介菌多糖核酸注射液标准，卡介菌多糖核酸注射液是指将精制卡介菌多糖核酸以灭菌生理氯化钠溶液配置而成的制剂形式。
92.本发明提供一种卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，以及对所述对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
93.其中，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：
94.将甘露糖、核糖、葡萄糖和阿拉伯糖溶于水，制备混合单糖溶液；
95.于所述混合单糖溶液中加入酸进行水解反应，制备混合单糖水解液；
96.将所述混合单糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应，制备所述对照品溶液；
97.所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
98.取卡介菌多糖核酸原料或制剂，加入酸进行水解反应，制备多糖水解液；
99.将所述多糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应，制备所述供试品溶液；
100.所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相为乙腈与盐类缓冲液的混合物，洗脱方式为梯度洗脱或等度洗脱。
101.在其中一示例中，对照品溶液的制备或供试品溶液的制备过程中，水解反应的条件包括：温度为100℃～120℃，时间为2h～5h。具体地，水解反应的温度包括但不限于：100℃、103℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、117℃、120℃。水解反应的时间包括但不限于：2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h。
102.在其中一示例中，对照品溶液的制备或供试品溶液的制备过程中，水解反应采用的酸为三氟乙酸、硫酸和盐酸中的一种或多种。进一步地，水解反应采用的酸为三氟乙酸。
103.在其中一示例中，酸为浓度为3mol/l～5mol/l的酸的水溶液。
104.在其中一示例中，浓度为3mol/l～5mol/l的酸的水溶液与混合单糖溶液或卡介菌多糖核酸原料溶液(以水为溶剂)或制剂的体积比为(0.8～1.2):1。
105.在其中一示例中，卡介菌多糖核酸原料溶液的浓度为0.8～1.2mg/ml。
106.在其中一示例中，混合单糖溶液中各单糖的浓度为0.8～1.2mg/ml。
107.在其中一示例中，对照品溶液的制备或供试品溶液的制备过程中，水解反应结束后，还包括后处理的步骤：将反应液于60℃～80℃减压浓缩至干，所得残余物用水溶解，制备所述混合单糖水解液或多糖水解液。
108.在其中一示例中，对照品溶液的制备或供试品溶液的制备过程中，pmp衍生化反应
的条件包括：温度为60℃～80℃，时间为20min～70min。具体地，pmp衍生化反应的温度包括但不限于：60℃、63℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、77℃、80℃。pmp衍生化反应的时间包括但不限于：20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min。
109.在其中一示例中，对照品溶液的制备或供试品溶液的制备过程中，pmp衍生化反应采用的pmp为浓度为0.3mol/l～0.7mol/l的pmp甲醇溶液，采用的碱为浓度为0.4mol/l～0.8mol/l的氢氧化钠的水溶液。
110.在其中一示例中，浓度为0.3mol/l～0.7mol/l的pmp甲醇溶液与浓度为0.4mol/l～0.8mol/l的氢氧化钠的水溶液的体积比为(1.5～2.5):1。
111.在其中一示例中，对照品溶液的制备或供试品溶液的制备过程中，pmp衍生化反应结束后，还包括后处理的步骤：将反应液中和，然后加水定容，以等体积的三氯甲烷进行洗涤，收集水相，过滤，制备所述对照品溶液或供试品溶液。
112.在其中一示例中，所述流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为10％～20％的乙腈的盐类缓冲液，流动相b为体积浓度为35％～45％的乙腈的盐类缓冲液，洗脱方式为梯度洗脱。进一步地，所述梯度洗脱的过程包括：流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％。更进一步地，所述梯度洗脱的过程包括：在0至(20～30)min的时间，流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％。
113.在另外一示例中，所述流动相包括流动相c和流动相d，流动相c为盐类缓冲液，流动相d为乙腈，洗脱方式为等度洗脱。进一步地，所述等度洗脱的过程中，保持流动相c与流动相d的体积分数比为80％～85％:20％～15％。
114.在其中一示例中，所述盐类缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸铵缓冲液或乙酸钠缓冲液。进一步地，所述盐类缓冲液的ph为5～7。
115.在其中一示例中，所述盐类缓冲液为磷酸盐缓冲液。进一步地，磷酸盐缓冲液的ph为6.8～7。
116.在其中一示例中，所述盐类缓冲液为乙酸铵缓冲液。进一步地，乙酸铵缓冲液的ph为5～6。
117.在其中一示例中，所述高效液相色谱检测的条件还包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为20℃～30℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为240nm～260nm。
118.在其中一示例中，所述对照品溶液或供试品溶液的进样量为5μl～15μl。
119.在其中一示例中，所述指纹图谱包含4个特征峰，分别记作1号峰、2号峰、3号峰和4号峰，以3号峰为参照峰；其中，1号峰为甘露糖，2号峰为核糖，3号峰为葡萄糖，4号峰为阿拉伯糖。
120.进一步地，1号峰为甘露糖，相对保留时间为0.587，相对峰面积为0.18％～10.18％；2号峰为核糖，相对保留时间为0.705，相对峰面积为0.64％～1.79％；3号峰为葡萄糖，相对保留时间为1.000，相对峰面积为81.23％～96.41％；4号峰为阿拉伯糖，相对保留时间为1.140，相对峰面积为0.33％～5.54％。
121.在其中一示例中，所述指纹图谱中，相对保留时间的相对标准偏差rsd均小于2％。
122.本发明还提供一种卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，包括用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备、待测品溶液的制备，以及对所述用于绘制标准曲线的对照品溶液和待测品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
123.其中，所述用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备包括如下步骤：
124.将对照品溶于水，制备不同浓度的对照品溶液；所述对照品为一种单糖或多种单糖的混合；
125.于所述对照品溶液中加入酸进行水解反应，制备对照品水解液；
126.将所述对照品水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应，制备所述用于绘制标准曲线的对照品溶液；
127.所述待测品溶液的制备包括如下步骤：
128.取待测卡介菌多糖核酸原料或制剂，加入酸进行水解反应，制备多糖水解液；
129.将所述多糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化反应，制备所述待测品溶液；
130.将所述用于绘制标准曲线的对照品溶液进行高效液相色谱检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
131.将所述待测品溶液进行高效液相色谱检测，检测结果代入所述标准曲线，计算所述单糖的含量，根据所述单糖的含量计算所述卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量；
132.所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相为乙腈与盐类缓冲液的混合物，洗脱方式为梯度洗脱或等度洗脱。
133.可以理解地，其技术方案中所述用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备、所述待测品溶液的制备以及高效液相色谱检测与前述“指纹图谱构建方法”类似，在此不再赘述。
134.在其中一示例中，所述对照品为甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、和阿拉伯糖中的一种或多种。进一步地，所述对照品为葡萄糖。如此可以更为准确地反映卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量。
135.本发明还提供上述的构建方法构建的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱，和/或上述的含量检测方法在卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制中的应用。
136.可以理解地，前述指纹图谱构建方法和多糖含量检测方法可以分别进行以实现相应的技术效果，同时，由于检测条件相同，可以根据需要同时进行，以进行更为全面的卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量检测和鉴别评估。
137.以下为具体的实施例。
138.实施例及附图中主要涉及的缩写含义如下：
139.man：甘露糖；
140.rib：核糖；
141.glc：葡萄糖；
142.gal：半乳糖；
143.ara：阿拉伯糖。
144.实施例中采用的各批卡介菌多糖核酸注射液来源于市售收集，各批卡介菌多糖核酸原料(即精制卡介菌多糖核酸)来源于湖南斯奇生物制药有限公司。
145.磷酸盐缓冲液(ph6.9)：精密称取kh2po46.8g，naoh 1.036g，加水1l溶解，摇匀，即
得。
146.磷酸盐缓冲液(ph6.8)：精密量取0.2mol/lkh2po46.8g 250ml，加0.2mol/lnaoh 118ml，用水稀释至1l，摇匀，即得。
147.磷酸盐缓冲液(ph7.0)：精密称取kh2po40.68g，加0.1mol/lnaoh 29.1ml，用水稀释至100ml，摇匀，即得。
148.0.5mol/lpmp甲醇溶液的配制：精密称取pmp2.18g，置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
149.0.6mol/lnaoh溶液的配制：精密称取naoh 6g，置于250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
150.0.6mol/lhcl溶液的配制：精密量取浓盐酸5ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
151.0.1mol/l乙酸铵溶液的配制：精密称取乙酸铵7.708g，置于1l量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
152.0.3mol/lhcl溶液的配制：精密量取浓盐酸5ml，置于200ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
153.实施例1
154.本实施例为pmp柱前衍生化-hplc分析卡介菌多糖核酸原料或制剂中单糖组成方法的建立，步骤如下：
155.1.流动相为单独的乙腈和乙酸铵缓冲液pmp柱前衍生化-hplc分析
156.1.1供试品制备：
157.1.1.1酸水解：取卡介菌多糖核酸原料或制剂溶液(注射液直接量取，原料粉配置成1mg/ml溶液)1ml于试管中，分别加入4mol/l三氟乙酸(tfa)溶液1ml，110℃条件下水解反应4h。取出水解液，在70℃水浴锅中将该水解液蒸干，蒸干过程中适量加入甲醇以除去水解液中的三氟乙酸。蒸干后的样品加入300μl水溶解，备用。
158.1.1.2 pmp衍生化：取100μl多糖水解液加入0.6mol/l氢氧化钠溶液100μl和0.5mol/l 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)甲醇溶液200μl，混匀；于70℃下衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入0.3mol/l盐酸溶液200μl中和；混匀后加2ml三氯甲烷洗涤5次，弃去三氯甲烷液，水层15000g离心10min，用0.22μm微孔膜过滤后供hplc分析。
159.1.2对照品制备：
160.分别取甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖混合，配制成各单糖浓度均为0.2mg/ml的混合单糖溶液，同“1.1供试品制备”项进行酸水解和pmp衍生化。
161.1.3色谱条件：
162.仪器：agilent technologies 1260 series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
150mm，id 5μm)色谱柱。流动相c：0.1m乙酸铵缓冲液(ph5.5)；流动相d：乙腈，流动相c：流动相d为83％：17％，等度洗脱。柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm。进样量为20μl。
163.理论塔板数以葡萄糖峰计算，不低于3000，各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均符合药典相关规定。
164.1.4实验结果：
165.从表1和图1中可以看出，各单糖色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5。空白溶液在供试液和对照品中主峰处无干扰。
166.表1混标性能报告
167.名称a相对保留时间rtbk'对称因子峰宽[min]塔板数分离度man0.3167.790.690.42535290-rib0.46111.830.70.666745876.5glc1.00026.790.661.2933572113.42gal1.15731.160.781.353369992.9ara1.29935.090.921.766751702.21
[0168]
备注：a,该混标中无pmp峰；b，混标中各单糖相对于葡萄糖的保留时间。
[0169]
2.流动相为乙腈和磷酸盐缓冲液混合液的pmp柱前衍生化-hplc分析
[0170]
2.1供试品制备
[0171]
2.1.1酸水解：取卡介菌多糖核酸注射液1ml于试管中，分别加入4mol/l三氟乙酸(tfa)溶液1ml，110℃条件下水解反应4h。反应结束后转移至鸡心瓶中，加水1ml润洗试管2次，2ml甲醇润洗1次，合并溶液于70℃下减压浓缩至干，无tfa味，加入100μl水溶解残渣，即得多糖水解液。
[0172]
2.1.2 pmp衍生化：于多糖水解液中加入0.6mol/l氢氧化钠溶液100μl和0.5mol/l pmp甲醇溶液200μl，混匀；于70℃下衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入0.6mol/l盐酸溶液100μl中和，加水定容至2ml；混匀30s，用等体积三氯甲烷洗涤3次，弃去三氯甲烷液，水层15000g离心10min，用0.22μm微孔膜过滤后供hplc分析。
[0173]
2.2对照品制备：
[0174]
分别取甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖混合，配制成各单糖浓度均为0.2mg/ml的混合单糖溶液，同“2.1供试品制备”项进行酸水解和pmp衍生化。
[0175]
2.3色谱条件：
[0176]
仪器：agilent technologies 1260 series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0177]
理论塔板数以葡萄糖峰计算，不低于10000，各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均符合药典相关规定。
[0178]
2.4实验结果：
[0179]
从表2和图2中可以看出，各单糖色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5。空白溶液在供试液和对照品中主峰处无干扰。
[0180]
表2混标性能报告
[0181]
名称相对保留时间rtak'对称因子峰宽[min]塔板数分离度pmp0.5543.760.80.31317968-man0.5974.130.840.2343165171.97
rib0.7145.140.790.2584194395.99glc1.0007.600.800.28333172013.32gal1.0808.290.940.3031323473.44ara1.1338.750.870.2967371672.23
[0182]
备注：a，混标中各单糖相对于葡萄糖的保留时间。
[0183]
另外还可知，单独的乙腈和盐缓冲液的流动相设计，会产生较为明显的溶剂体积及放热效应，混合体积变化大，盐可能会析出堵塞管路，且可能影响分析方法耐用性。本发明的优选方案是控制流动相a和流动相b分别为不同浓度的含有乙腈的盐缓冲液，如此能够有效避免前述缺陷，在液相泵上梯度洗脱时，能够有效减小溶剂体积及放热效应，以及减小盐析出的可能。此外，改变盐缓冲液的ph以及一定范围内的流动相体积分数，影响出峰时间，但不影响单糖出峰顺序以及峰分离度，样品检测的稳定性高。
[0184]
实施例2
[0185]
本实施例为卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖含量的检测方法的方法学验证。
[0186]
1.系统适用性试验
[0187]
1.1样品溶液配制
[0188]
对照品溶液的配制：取葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0189]
供试品溶液：精密量取卡介菌多糖核酸注射液适量，摇匀，即得。
[0190]
单一对照品溶液：分别精密称取1mg阿拉伯糖、1mg甘露糖、1mg葡萄糖、1mg半乳糖与1mg核糖于试管中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0191]
标准单糖混标溶液(系统适应性溶液)：精密称取1mg阿拉伯糖、1mg甘露糖、1mg葡萄糖、1mg半乳糖与1mg核糖于同一试管中，摇匀，即得，标记为hb。
[0192]
1.2测定方法
[0193]
(1)样品处理
[0194]
酸水解：取样品溶液1ml于试管中，分别加入4mol/l三氟乙酸(tfa)溶液1ml，110℃条件下水解反应4h。反应结束后转移至鸡心瓶中，加水1ml润洗试管2次，2ml甲醇润洗1次，合并溶液于70℃下减压浓缩至干，无tfa味，加入100μl水溶解残渣，即得多糖水解液。
[0195]
pmp衍生化：于多糖水解液中加入0.6mol/l氢氧化钠溶液100μl和0.5mol/l 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)甲醇溶液200μl，混匀；于70℃下衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入0.6mol/l盐酸溶液100μl中和，加水定容至2ml；混匀30s，用等体积三氯甲烷洗涤3次，弃去三氯甲烷液，水层15000g离心10min，用0.22μm微孔膜过滤后供hplc分析。
[0196]
色谱条件：仪器：agilent technologies 1260 series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0197]
(2)精密度：分别精密量取酸水解，pmp衍生化后的对照品溶液10μl，注入液相色谱
仪，记录色谱图。连续进样6次，计算峰面积的相对标准偏差。
[0198]
(3)专属性：精密量取酸水解，pmp衍生化后的系统适应性溶液10μl，注入液相色谱仪，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5。空白溶液在供试液和对照品中主峰处无干扰。
[0199]
(4)理论塔板数：以葡萄糖计算的理论塔板数，不得小于10000。
[0200]
1.3结果
[0201]
系统适用性测定结果和专属性测定结果分别见表3、4和图3、4。
[0202]
表3系统适用性测定结果
[0203][0204]
表4专属性测定结果
[0205]
名称相对保留时间rtak'对称因子峰宽[min]塔板数分离度pmp0.5563.750.720.32007579-man0.5964.091.520.2258174991.83rib0.7135.090.860.2495204726.14glc1.0007.540.850.28043188613.54gal1.0808.210.870.284362443.53ara1.1328.660.850.2832400842.32
[0206]
备注：a，混标中各单糖相对于葡萄糖的保留时间rt。
[0207]
1.4结论
[0208]
根据实验结果(表3、4和图3、4)，连续进样6针，葡萄糖(glc)峰面积rsd值为0.78％；以葡萄糖为参考，甘露糖(man)、核糖(rib)、半乳糖(gal)和阿拉伯糖(ara)相对保留时间分别为：0.596、0.713、1.080和1.132，与空白溶剂无干扰，说明该方法系统适用性和专属性良好。
[0209]
2.线性
[0210]
2.1溶液配制
[0211]
(1)线性贮备液的配制：取glc对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性贮备液。
[0212]
(2)线性溶液：精密量取上述的线性储备液适量，用流动相定量稀释成系列浓度的线性溶液，配制方式见表5。
[0213]
表5线性溶液配制
[0214]
浓度水平贮备液体积(ml)量瓶体积(ml)理论浓度(mg/ml)12.52.51.00222.50.8031.52.50.60412.50.4050.840.206取5号溶液1.530.10
[0215]
2.2测定方法
[0216]
测定方法按1.2处理，按外标法计算其含量(按干燥品计算)。分别精密量取各浓度水平经水解，pmp衍生化后的线性溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，并计算其线性相关系数。
[0217]
2.3结果
[0218]
线性测定结果见表6和图5、图6。
[0219]
表6线性测定结果
[0220][0221]
2.4结论
[0222]
根据实验结果(表6和图5、图6)，glc在0.10mg/ml～1.00mg/ml浓度范围内呈线性，线性相关系数r2＝0.9997，线性关系良好。
[0223]
3.精密度
[0224]
3.1重复性
[0225]
(1)溶液配制
[0226]
供试品溶液的制备：取卡介菌多糖核酸注射液7支混合。每个平行取1ml进行实验。
[0227]
(2)测定方法
[0228]
测定方法按1.2处理，按外标法计算其含量(按干燥品计算)。计算其相对标准偏差，结果如表7和图7。
[0229]
表7重复性测定结果
[0230][0231][0232]
(3)结果
[0233]
根据实验结果(表7和图7)，含量测定结果平均值为0.3061mg/支，重复性rsd值为1.30％，小于《中华人民共和国药典(2020版)》(以下简称药典)对含量规定3％，符合药典规定的要求。
[0234]
3.2中间精密度
[0235]
(1)溶液配制
[0236]
供试品溶液的制备：取卡介菌多糖核酸注射液7支混合。每个平行取1ml进行实验。
[0237]
(2)测定方法
[0238]
测定方法按1.2处理，按外标法计算其含量(按干燥品计算)。计算其相对标准偏差。中间精密度中实验员2数据与重复性数据进行比较。
[0239]
(3)结果
[0240]
中间精密度测定结果见表8和图8。
[0241]
表8中间精密度测定结果
[0242][0243]
(4)结论
[0244]
根据实验结果(表8和图8)，第2名实验员含量测定结果平均值为0.3140mg/支，rsd值为2.80％，小于药典对含量规定3％；2名实验人员，于不同时间、不同设备，采用同一均质的样品，各平行测定至少6份，含量测定结果平均值为0.3100mg/支，rsd值为2.49％，小于3％，符合药典规定。
[0245]
4.溶液稳定性
[0246]
4.1溶液配制
[0247]
供试品溶液的制备：取卡介菌多糖核酸注射液7支混合，每个平行取1ml进行实验。
[0248]
对照品溶液的制备：采用2.1中1号贮备液。
[0249]
4.2测定方法
[0250]
上述3.1重复性样品于2～8℃放置一定时间后，取分别精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图的峰面积，计算相对标准偏差。
[0251]
4.3结果
[0252]
冰盒放置的供试品溶液24h内稳定性结果见表9和图9。放置在样品盘中供试品溶液24h内稳定性见表10和图10。
[0253]
表9冰盒放置的供试品溶液24h内稳定性(n＝6)
[0254][0255]
备注：a，准确度(％)＝测得浓度的平均值/已知浓度
×
100；b，重复性实验供试品于-20℃放置8天后进行检测。
[0256]
表10放置在样品盘中供试品溶液24h内稳定性(n＝1)
[0257][0258]
备注：a，准确度(％)＝测得浓度的平均值/已知浓度
×
100。室温：25℃。
[0259]
4.4结论
[0260]
根据实验结果可知，供试品溶液在2～8℃放置24h，-20℃放置8天后，溶液稳定性均良好。室温放置4小时，准确度低于90％，样品测试时应置于2～8℃。
[0261]
5.准确度
[0262]
准确度是通过配制80％、100％和120％样品溶液测得的回收率后判定，要求回收率在90％～108％之间。
[0263]
5.1回收率溶液配制
[0264]
对照品溶液的制备：取glc对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制2份。
[0265]
供试品溶液的制备：精密量取卡介菌多糖核酸注射液适量，摇匀，即得。
[0266]
回收率供试品溶液：另精密量取对照品溶液，加水配制0.49mg/ml、0.35mg/ml和0.21mg/ml，摇匀，即得。
[0267]
5.2测定方法
[0268]
取供试品溶液0.5ml，回收率供试品溶液0.5ml于试管中，照上述1.2样品处理依法操作。
[0269]
5.3结果
[0270]
加样回收率测定结果见表11和图11。
[0271]
表11葡萄糖回收率测定结果(n＝3)
[0272][0273][0274]
备注：a，准确度(％)＝(测得量-注射液含量)/加入量
×
100。
[0275]
5.4结论
[0276]
由实验结果可知(表11和图11)，供试品溶液在80％、100％和120％各浓度下回收率分别为100.67％、103.61％和100.11％，符合药典规定的90％～108％；rsd值分别为1.95％、0.91％和0.83％，说明本方法准确度高，可用于卡介菌多糖核酸注射液所含多糖中葡萄糖的含量测定。
[0277]
6.耐用性
[0278]
耐用性通过更改流速(0.9ml/min和1.1ml/min)，柱温(20℃和30℃)，磷酸盐缓冲液ph，梯度洗脱比例和流动相乙腈和磷酸盐缓冲液比例测定条件变动应能满足系统适用性试验要求，以判断方法的可靠性。
[0279]
6.1溶液配制
[0280]
对照品溶液的制备：取glc对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0281]
供试品溶液的制备：精密量取卡介菌多糖核酸注射液适量，摇匀，即得。
[0282]
标准单糖混标溶液(系统适应性溶液)：精密称取1mg阿拉伯糖、1mg甘露糖、1mg葡萄糖、1mg半乳糖与1mg核糖于同一试管中，摇匀，即得，标记为hb。
[0283]
6.2测定方法
[0284]
测定方法按上述1.2处理，按外标法计算其含量(按干燥品计算)。
[0285]
色谱条件1：
[0286]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0287]
色谱条件2(更改流速为0.9ml/min)：
[0288]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分
数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为0.9ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0289]
色谱条件3(更改流速为1.1ml/min)：
[0290]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1.1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0291]
色谱条件4(更改柱温为20℃)：
[0292]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为20℃，流速为1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0293]
色谱条件5(更改柱温为30℃)：
[0294]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为30℃，流速为1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0295]
色谱条件6(更改磷酸盐缓冲液ph为6.8)：
[0296]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.8)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.8)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0297]
色谱条件7(更改磷酸盐缓冲液ph为7.0)：
[0298]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph7.0)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph7.0)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0299]
色谱条件8(更改梯度洗脱比例)：
[0300]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器
(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至75％，流动相b体积分数由0％变化至25％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0301]
色谱条件9(更改流动相乙腈和磷酸盐缓冲液比例)：
[0302]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：10％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：45％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持80％，b保持20％至样品全部出峰。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0303]
色谱条件10(更改流动相乙腈和磷酸盐缓冲液比例)：
[0304]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：20％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：35％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl
[0305]
6.3结果
[0306]
耐用性实验结果见表12、13和图12～21。
[0307]
表12耐用性测定结果(n＝6)
[0308][0309]
表13hb中葡萄糖在不同色谱条件下性能报告
[0310][0311]
6.4结论
[0312]
由实验结果可知，色谱条件更改流速，rsd为8.98％；更改柱温，rsd为2.47％；更改磷酸盐缓冲液ph：ph6.8，ph6.9，ph7.0，rsd为1.84％；梯度洗脱比例：0-25mina100％～80％，b0～20％和0-25mina100％～75％，b0～25％,rsd为2.49％；更改流动相比例：a10％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)，b45％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)和a20％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)，b35％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)，rsd为4.37％；主峰glc出峰时间改变，但是样品出峰顺序不变，且分离度均大于1.5，说明该方法可靠。各条件下主峰葡萄糖分离度大于1.5，说明方法可靠。
[0313]
7.总结
[0314]
按验证方案，附实际验证结果表14。
[0315]
表14方法学验证结果
[0316][0317]
实施例3
[0318]
本实施例为卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测，步骤如下：
[0319]
(1)待测品制备：
[0320]
1.1酸水解：取待测卡介菌多糖核酸注射液1ml于试管中，分别加入4mol/l三氟乙酸(tfa)溶液1ml，110℃条件下水解反应4h。反应结束后转移至鸡心瓶中，加水1ml润洗试管2次，2ml甲醇润洗1次，合并溶液于70℃下减压浓缩至干，无tfa味，加入100μl水溶解残渣，即得多糖水解液。
[0321]
1.2pmp衍生化：于多糖水解液中加入0.6mol/l氢氧化钠溶液100μl和0.5mol/l 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)甲醇溶液200μl，混匀；于70℃下衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入0.6mol/l盐酸溶液100μl中和，加水定容至2ml；混匀30s，用等体积三氯甲烷洗涤3次，弃去三氯甲烷液，水层15000g离心10min，用0.22μm微孔膜过滤后供hplc分析。
[0322]
(2)对照品制备：
[0323]
取葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得葡萄糖水溶液。精密量取葡萄糖水溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、l.0ml，分别置10ml试管中，各加水补至1.0ml，混匀，得不同浓度的葡萄糖水溶液。对不同浓度的葡萄糖水溶液同“(1)供试品制备”项进行酸水解和pmp衍生化。
[0324]
(3)色谱条件：
[0325]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0326]
理论塔板数以葡萄糖峰计算，不低于10000，各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均符合药典相关规定。
[0327]
记录不同浓度的对照品的色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0328]
记录待测品的色谱图，按外标法以峰面积计算待测品中葡萄糖的含量，20批次卡介菌多糖核酸注射液所含多糖中葡萄糖的含量测定结果见表15。
[0329]
表1520批次卡介菌多糖核酸注射液所含多糖中葡萄糖的含量
[0330]
[0331][0332]
实施例4
[0333]
本实施例为卡介菌多糖原料或核酸制剂的指纹图谱构建方法，步骤如下：
[0334]
(1)供试品制备：
[0335]
1.1酸水解：取不同批次的卡介菌多糖核酸注射液1ml于试管中，分别加入4mol/l三氟乙酸(tfa)溶液1ml，110℃条件下水解反应4h。反应结束后转移至鸡心瓶中，加水1ml润洗试管2次，2ml甲醇润洗1次，合并溶液于70℃下减压浓缩至干，无tfa味，加入100μl水溶解残渣，即得多糖水解液。
[0336]
1.2pmp衍生化：于多糖水解液中加入0.6mol/l氢氧化钠溶液100μl和0.5mol/l 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)甲醇溶液200μl，混匀；于70℃下衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入0.6mol/l盐酸溶液100μl中和，加水定容至2ml；混匀30s，用等体积三氯甲烷洗涤3次，弃去三氯甲烷液，水层15000g离心10min，用0.22μm微孔膜过滤后供hplc分析。
[0337]
(2)对照品制备：
[0338]
分别取甘露糖、核糖、葡萄糖和阿拉伯糖混合，配制成各单糖浓度均为1mg/ml的混合单糖溶液，同“(1)供试品制备”项进行酸水解和pmp衍生化。
[0339]
(3)色谱条件：
[0340]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，id 5μm)色谱柱。流动相a：15％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)；流动相b：40％乙腈的磷酸盐缓冲液(ph6.9)。洗脱梯度：0～25min，流动相a体积分数由100％变化至80％，流动相b体积分数由0％变化至20％。流动相a体积分数保持100％，流动相b保持0％平衡5min。柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm。进样量为10μl。
[0341]
理论塔板数以葡萄糖峰计算，不低于10000，各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均符合药典相关规定。
[0342]
实验结果：20批供试品的单糖组成相似度分析结果见表16和图22、23、24。
[0343]
表16 20批供试品的单糖组成相似度分析
[0344][0345][0346]
(4)对照指纹图谱的确定：
[0347]
通过20批卡介菌多糖核酸注射液的单糖组成的色谱图，确定卡介菌多糖核酸注射液的对照特征图谱，如图24所示，其中共有特征峰为4个；所述的4个共有特征峰以3号峰为参照，所述3号峰为葡萄糖，计算样品中各峰的相对保留时间，以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对面积。相对保留时间rt的相对标准偏差rsd均小于2％。具体地：
[0348]
1号峰平均rt为0.587，rsd为0.12％；
[0349]
2号峰平均rt为0.705，rsd为0.11％；
[0350]
3号峰平均rt为1.000，rsd为0.13％；
[0351]
4号峰平均rt为1.140，rsd为0.12％；
[0352]
其中1号峰甘露糖，相对峰面积0.18％～10.18％；2号峰核糖，相对峰面积0.64％～1.79％；3号峰葡萄糖，相对峰面积81.23％～96.41％；4号峰阿拉伯糖，相对峰面积0.33％～5.54％。
[0353]
实施例5
[0354]
本实施例为卡介菌多糖核酸原粉中甘露糖和葡萄糖的含量检测，步骤如下：
[0355]
(1)用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备：
[0356]
甘露糖对照品溶液的制备取甘露糖对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
[0357]
对照品溶液的的制备取葡萄糖对照品约30mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解，再加入甘露糖对照品溶液2ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
[0358]
用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和l.0ml，分别置10ml螺口试管中，各加水补至1.0ml，混匀，即得。分别加入4mol/l三氟乙酸溶液1ml，110℃条件下水解反应4h。反应结束后70℃下减压浓缩至干，无tfa味，于70℃敞口烘干30min，冷却至室温后加入100μl水溶解残渣，即得多糖水解液。pmp衍生化：多糖水解液，加入0.6mol/l氢氧化钠溶液100μl和0.5mol/lpmp甲醇溶液200μl，混匀；
[0359]
于70℃下衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入0.6mol/l盐酸溶液100μl中和，加水定容至2ml；混匀30s，用三氯甲烷洗涤3次，每次2ml，弃去三氯甲烷溶液，水层15000
′
g离心10min，用0.2μm微孔膜过滤后供hplc分析。
[0360]
(2)待测品的制备精密称取原粉25mg，置于25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该原粉溶液1ml，置10ml螺口试管中，照步骤(1)中用于绘制标准曲线的对照品溶液制备项下方法，自“分别加入4mol/l三氟乙酸溶液1ml，110℃条件下水解反应4h”起，依法操作，取滤液10μl，注入液相色谱仪，测定。
[0361]
(3)色谱条件
[0362]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：agilent zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；流动相a：15％乙腈，85％磷酸盐缓冲液(ph7.0)；流动相b：40％乙腈，60％磷酸盐缓冲液(ph7.0)。洗脱梯度：0-25min为100-80％流动相a，0-20％流动相b；25-30min为80％流动相a，20％流动相b；30-35min为100％流动相a。流速为1.0ml/min，进样体积为10μl；检测波长为250nm。理论塔板数以葡萄糖峰计算，不低于5000，各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均符合2020版中国药典相关规定。
[0363]
(4)含量测定
[0364]
将所述用于绘制标准曲线的对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0365]
将所述待测品溶液进行高效液相色谱检测，检测结果代入所述标准曲线，按标准曲线以峰面积分别计算甘露糖(man)和葡萄糖(glc)含量。
[0366]
实验结果：20批卡介菌多糖核酸原粉的葡萄糖、甘露糖含量测定结果见表17、表18。
[0367]
表17不同批次卡介菌多糖核酸原粉中甘露糖含量测定
[0368]
[0369][0370]
表18不同批次卡介菌多糖核酸原粉葡萄糖含量测定
[0371][0372]
实施例6
[0373]
本实施例为卡介菌多糖核酸注射液中甘露糖和葡萄糖的含量检测和注射液产品中甘露糖(man)/葡萄糖(glc)含量校正因子比较分析，步骤如下：
[0374]
(1)用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备：
[0375]
对照品溶液的的制备取甘露糖(man)对照品2.5mg、葡萄糖(glc)对照品50mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
[0376]
用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和l.0ml，分别置10ml螺口试管中，各加水补至1.0ml，混匀，即得。分别加入4mol/l三氟乙酸溶液1ml，110℃条件下水解反应4h。反应结束后70℃下减压浓缩至干，无tfa味，于70℃敞口烘干30min，冷却至室温后加入100μl水溶解残渣，即得多糖水解液。pmp衍生化：多糖水解液，加入0.6mol/l氢氧化钠溶液100μl和0.5mol/lpmp甲醇溶液200μl，混匀；于70℃下衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入0.6mol/l盐酸溶液100μl中和，加水定容至2ml；用三氯甲烷2ml洗涤，用力振摇30s，弃去三氯甲烷溶液，重复3次，水层15000
′
g离心10min，用0.2μm微孔膜过滤后供hplc分析。
[0377]
(2)待测品的制备精密量取卡介菌多糖核酸注射液1ml，置10ml螺口试管中，照步骤(1)中用于绘制标准曲线的对照品溶液制备项下方法，自“分别加入4mol/l三氟乙酸溶液1ml，110℃条件下水解反应4h”起，依法操作，取滤液10μl，注入液相色谱仪，测定。
[0378]
(3)色谱条件
[0379]
仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(dad检测器)；色谱柱：agilent zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；流动相a：15％乙腈，85％磷酸盐缓冲液(ph7.0)；流动相b：40％乙腈，60％磷酸盐缓冲液(ph7.0)。洗脱梯度：0-25min为100-80％流动相a，0-20％流动相b；25-30min为80％流动相a，20％流动相b；30-35min为100％流动相a。流速为1.0ml/min，进样体积为10μl；检测波长为250nm。理论塔板数以葡萄糖峰计算，不低于5000，各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均符合2020版中国药典相关规定。
[0380]
(4)含量测定
[0381]
将所述用于绘制标准曲线的对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0382]
将所述待测品溶液进行高效液相色谱检测，检测结果代入所述标准曲线，按标准曲线以峰面积分别计算甘露糖(man)和葡萄糖(glc)含量。
[0383]
(5)计算man/glc含量校正因子
[0384]
计算公式：man/glc含量校正因子＝man含量/glc含量。
[0385]
实验结果：选取2个不合格样品(26a、25p)和15个合格样品(25a等其余样品)进行检测，17批卡介菌多糖核酸注射液的葡萄糖、甘露糖含量测定结果和含量校正因子见表19、表20。其中合格样品的含量校正因子(man/glc)在0.05-0.12之间，不合格样品的含量校正因子在此之外，本发明设定的含量校正因子(man/glc)在0.05-0.12之间的样品合格，本方法可用于评价样品，
[0386]
表19不同批次卡介菌多糖核酸注射液甘露糖含量测定
[0387][0388]
表20不同批次卡介菌多糖核酸注射液葡萄糖含量测定
[0389][0390][0391]
对比例1
[0392]
本发明人还尝试采用高效液相凝胶渗透色谱(hpgpc)指纹图谱控制卡介菌多糖核酸注射液的质量，但由于卡介菌多糖核酸产品中所含核酸与多糖均为生物大分子物质，且它们的分子量及其分布存在很大部分的交叉重叠，尝试各类凝胶柱均难以有效分离核酸与多糖，因此采用此法不能实现对卡介菌多糖核酸产品中多糖的含量直接定量分析，同时也充分证实了卡介菌多糖核酸原料及制剂中多糖的检测难度。
[0393]
具体过程如下：
[0394]
1.高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)分析
[0395]
1.1供试品制备：
[0396]
供试品溶液i(注射剂)的制备：取卡介菌多糖核酸注射剂1支，注射液滤过，取续滤液，即得。
[0397]
供试品溶液ii(原料溶液)的制备：称取原料10mg，置于10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，进样前滤过，取续滤液，即得。
[0398]
供试品溶液iii(除核酸后原料溶液，其仅含多糖)的制备：称取除核酸后原料2mg，置于10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，进样前滤过，取续滤液，即得。
[0399]
1.2色谱条件
[0400]
色谱柱：shodex ohpak sb-804hq色谱柱(8.0mm
×
300mm)；流动相0.1mol/l氯化钠，等度洗脱；柱温：35℃；检测器：ri示差；dad检测器,检测波长为260nm；流速：0.5ml/min；供试品溶液ⅰ进样量50μl，供试品溶液ⅱ和iii进样量各20μl。
[0401]
1.3实验结果
[0402]
实验结果如图25所示，卡介菌多糖核酸原料及除核酸后原料的hpgpc色谱峰均在11～20min内，为大分子多糖和核酸类物质，15.5min处的峰面积最大，提示其在含量最多。hpgpc紫外检测结果如图26所示，除核酸后原料在260nm处无吸收峰，说明卡介菌多糖样品中无核酸类物质。除核酸后原料的示差检测图谱显示，该卡介菌多糖组分的至少有4个峰，峰型宽且重叠严重而不能基线分离，提示本品中的多糖组分复杂，其由不同分子量及其分布的多糖组成。上述结果显示，本品中所含核酸与多糖均为生物大分子物质，且它们的分子量及其分布存在很大部分的交叉重叠，难以有效分离核酸与多糖，因此采用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)法不能实现对本品中多糖的检测及其含量的定量分析。此外，多糖无特征性紫外吸收，难以直接用紫外法进行检测。
[0403]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0404]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，以及对所述对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；其中，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：将甘露糖、核糖、葡萄糖和阿拉伯糖溶于水，制备混合单糖溶液；于所述混合单糖溶液中加入酸进行水解反应，制备混合单糖水解液；将所述混合单糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化反应，制备所述对照品溶液；所述供试品溶液的制备包括如下步骤：取卡介菌多糖核酸原料或制剂，加入酸进行水解反应，制备多糖水解液；将所述多糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化反应，制备所述供试品溶液；所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相为乙腈与盐类缓冲液的混合物，洗脱方式为梯度洗脱或等度洗脱。2.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为10％～20％的乙腈的盐类缓冲液，流动相b为体积浓度为35％～45％的乙腈的盐类缓冲液，洗脱方式为梯度洗脱；或，所述流动相包括流动相c和流动相d，流动相c为盐类缓冲液，流动相d为乙腈，洗脱方式为等度洗脱。3.根据权利要求2所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程包括：流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％；或，所述等度洗脱的过程中，保持流动相c与流动相d的体积分数比为80％～85％:20％～15％。4.根据权利要求3所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程包括：在0至(20～30)min的时间，流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％。5.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述盐类缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸铵缓冲液或乙酸钠缓冲液。6.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件还包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为20℃～30℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为240nm～260nm。7.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，水解反应的条件包括：温度为100℃～120℃，时间为2h～5h；及/或，所述酸为三氟乙酸、硫酸和盐酸中的一种或多种。8.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化反应的条件包括：温度为60℃～80℃，时间为20min～70min。9.根据权利要求1～8任一项所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法，
其特征在于，所述指纹图谱包含4个特征峰，分别记作1号峰、2号峰、3号峰和4号峰，以3号峰为参照峰；其中，1号峰为甘露糖，2号峰为核糖，3号峰为葡萄糖，4号峰为阿拉伯糖。10.一种卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，包括用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备、待测品溶液的制备，以及对所述用于绘制标准曲线的对照品溶液和待测品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；其中，所述用于绘制标准曲线的对照品溶液的制备包括如下步骤：将对照品溶于水，制备不同浓度的对照品溶液；所述对照品为一种单糖或多种单糖的混合；于所述对照品溶液中加入酸进行水解反应，制备对照品水解液；将所述对照品水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化反应，制备所述用于绘制标准曲线的对照品溶液；所述待测品溶液的制备包括如下步骤：取待测卡介菌多糖核酸原料或制剂，加入酸进行水解反应，制备多糖水解液；将所述多糖水解液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化反应，制备所述待测品溶液；将所述用于绘制标准曲线的对照品溶液进行高效液相色谱检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；将所述待测品溶液进行高效液相色谱检测，检测结果代入所述标准曲线，计算所述单糖的含量，根据所述单糖的含量计算所述卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量；所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相为乙腈与盐类缓冲液的混合物，洗脱方式为梯度洗脱或等度洗脱。11.根据权利要求10所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，所述流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为10％～20％的乙腈的盐类缓冲液，流动相b为体积浓度为35％～45％的乙腈的盐类缓冲液，洗脱方式为梯度洗脱；或，所述流动相包括流动相c和流动相d，流动相c为盐类缓冲液，流动相d为乙腈，洗脱方式为等度洗脱。12.根据权利要求11所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程包括：流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％；或，所述等度洗脱的过程中，保持流动相c与流动相d的体积分数比为80％～85％:20％～15％。13.根据权利要求12所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程包括：在0至(20～30)min的时间，流动相a的体积分数由100％变化至80％～75％，流动相b的体积分数由0％变化至20％～25％。14.根据权利要求10所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，所述盐类缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸铵缓冲液或乙酸钠缓冲液。15.根据权利要求10所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件还包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，
柱温为20℃～30℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为240nm～260nm。16.根据权利要求10所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，水解反应的条件包括：温度为100℃～120℃，时间为2h～5h；及/或，所述酸为三氟乙酸、硫酸和盐酸中的一种或多种。17.根据权利要求10所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化反应的条件包括：温度为60℃～80℃，时间为20min～70min。18.根据权利要求10～17任一项所述的卡介菌多糖核酸原料或制剂中多糖的含量检测方法，其特征在于，所述对照品为甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖中的一种或多种的混合。19.权利要求1～9任一项所述的构建方法构建的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱，和/或权利要求10～18任一项所述的含量检测方法在卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制中的应用。20.根据权利要求19所述的含量检测方法在卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制中的应用，其特征在于，卡介菌多糖核酸注射液中甘露糖(man)/葡萄糖(glc)含量校正因子范围为0.05-0.12时，所述卡介菌多糖核酸注射液产品合格。

技术总结
本发明涉及一种卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱构建方法以及多糖的含量检测方法。所述指纹图谱构建方法能够构建获得了包含4个特征峰的卡介菌多糖核酸原料或制剂的指纹图谱，同时方法的重复性、精密度较高，如此能够对卡介菌多糖核酸原料或制剂进行全面、准确的检测分析，能够反映卡介菌多糖核酸原料或制剂质量的稳定性以及品质的差异，为卡介菌多糖核酸原料或制剂的质量控制提供切实可靠的依据。酸原料或制剂的质量控制提供切实可靠的依据。


技术研发人员：吴明一 张兰艳 罗兰 黄胜 孟庆鑫 朱艳 杨胜梅 肖锋 谢安 周志鹏 周云喜
受保护的技术使用者：九芝堂股份有限公司
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/10/19