一种含NeuroprotectinD1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物

一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域。技术领域，具体为一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物。


背景技术：

2.视神经由视网膜神经节细胞(rgcs)发出的轴突汇集而成，是眼将视觉信息传送至大脑视觉皮层的唯一通路。诸多疾病(如青光眼、视神经炎、缺血性视神经病变等)均可引起视神经损伤及rgcs进行性凋亡。当前治疗手段多以延缓疾病进展为目的，缺乏有效的救治手段，最终可造成患者视力障碍甚至致盲。因此，寻找一种更为有效的视神经保护药物便成为了眼科的热点研究问题之一。
3.dha(docosahexaenoic acid)是视网膜组织中含量最多的ω-3多不饱和脂肪酸，其下游代谢产物npd1则属于特异性促消退介质(spms)中的一种。在神经系统中，npd1可以通过调控凋亡相关蛋白的表达来抑制神经元凋亡，这一点已在包括阿尔兹海默病、缺血性脑卒中等疾病中得到证实。同时npd1也可抑制激活的小胶质细胞释放促炎因子，并促进其吞噬作用来限制炎症发展，从而改善局部免疫微环境。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物，以解决上述背景技术提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：玻璃体腔注射neuroprotectin d1(npd1)降低n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)诱导的rgc凋亡同时改善视功能；
6.(1)n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)损伤动物模型的建立及neuroprotectin d1(npd1)处理：将21天龄的le大鼠随机分为三组，分别行玻璃体腔pbs注射、10mm nmda、单独注射和10mm nmda+100ng npd1共注射，体系皆为2μl，对侧左眼注射2μl pbs，具体步骤包括：应用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉le大鼠，后应用盐酸奥布卡因行眼表麻醉，随后将大鼠置于手术显微镜下，充分暴露眼球后，使10μl微量注射器以与眼球壁成15
°
的角度，从外眦部进针，将1μl液体缓慢注入玻璃体腔；
7.(2)制作冰冻切片：分离眼球后，置于4％pfa中固定10min，后去除前节置于4％pfa室温固定1h，转移至30％蔗糖中脱水过夜，取出脱水成功的视杯置于吸水纸上，待其干燥后包埋于o.c.t中，置于-80℃中冰冻，后用冰冻切片机将其切成10μm的视网膜切片并贴于载玻片上，选取包含视乳头的视网膜纵切面进行下一步的免疫荧光染色；
8.(3)免疫荧光染色检测nmda损伤后rgc的存活率和凋亡率：配制含1％bsa和0.5％triton的封闭破膜液，滴加并覆盖视网膜切片，于37℃孵育30min；配制含1％ bsa和0.3％ triton的抗体稀释液，以此稀释一抗至目标浓度并与样本在4℃孵育过夜，而后用相应物种的二抗于室温下避光孵育2h。根据tunel试剂盒说明书操作标记凋亡细胞。最后用dapi染液
标记细胞核5min，后清洗3遍，滴加抗荧光淬灭剂进行封片，完成后即可在荧光或共聚焦显微镜下观察目标细胞的形态特征或目标抗原的表达模式；
9.(4)视网膜电流图(erg)及闪光视觉诱发电位(vep)及评估小鼠视功能：le大鼠经暗适应过夜后由上述同种方式麻醉，待其昏迷后，用托吡卡胺滴眼充分扩瞳，并将其安置于espion diagnosys电生理仪器的恒温台上，正确安装电极，包括覆盖角膜的负极、皮下埋置在两只眼睛之间的参考电极以及连接尾巴的地电极，两角膜电极同时用作光刺激器和反应记录器，在恒定的绿色背景(40cd/m2)下光适应5min以抑制感光细胞的电生理活性后，在11.38cds/m2的绿光的刺激下采集稳定波形并提取其b波后第一个负反应的幅值以评估rgc的电生理活性；大鼠准备同erg检测。角膜电极用作光刺激器，皮下埋置的参考电极和负电极分别位于两只眼睛之间及枕骨粗隆，而接地电极埋置于大鼠尾部。在白色背景(30cd/m2)；
10.(5)视觉行为学评估大鼠视功能：将待测大鼠置于暗箱，暗适应过夜，不限食水；将le大鼠置于平台上适应2min，待其稳定后，运行电脑程序，此时显示屏上将依次出现空间频率为0.05至0.6cycle/degree(c/d)的顺时针或逆时针移动的黑白光栅，其旋转速度为12
°
/s，对比度为100％，每个测试阶段中，置于设备上空的摄像机将记录大鼠识别光栅的头部追踪行为；由两人分别统计大鼠的最佳视敏度，即大鼠可以区别并响应的最高空间频率，逆时针和顺时针旋转的不同光栅分别对应左、右眼的视敏度。
11.进一步的，neuroprotectin d1是作为活性成分的rgc保护药物。
12.进一步的，neuroprotectin d1是由15-脂氧酶(15-lox)以二十二碳六烯酸(dha)作为底物生成的下游代谢产物。
13.进一步的，neuroprotectin d1在制备抑制rgc损伤或凋亡的药物中药物组合物可呈选自如下的剂型：溶液、悬液、乳剂、丸剂、片剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。
14.有益效果：本发明具有如下优点：
15.无论是玻璃体腔内注射npd1还是膳食补充dha以提高内源性npd1水平，均可以有效抑制由nmda引起的视网膜神经节细胞的凋亡，下调calpain-1及凋亡相关蛋白bax、bid、aif、caspase-3的表达，同时抑制小胶质细胞活化从而提高rgcs的生存率，进一步改善由nmda损伤引起的视功能损害。
附图说明:
16.图1为大鼠玻璃体腔注射npd1降低nmda诱导的rgc凋亡同时改善视功能。a为动物实验时间线；b为视网膜免疫荧光染色标记凋亡的rgc和残存的rgc；c和d分别为统计凋亡的rgc和残存rgc数目；e和f分别为各组phnr代表性波形及其幅值量化统计曲线图；g和h分别为各组fvep典型波形及p2波幅值的量化统计曲线图；i和j分别为大鼠虚拟视觉运动实验示意图和视敏度量化数据。
17.图2为npd1减轻nmda损伤视网膜中calpain-1参与的细胞凋亡反应。a、b和c分别为定量检测视网膜中calpain-1和calpain-2蛋白相对表达量的条带图及统计结果；e为nmda损伤视网膜中calpain-1相关凋亡反应通路示意图；d和f-i为视网膜中calpain-1和bax、bid、aif、caspase-3等凋亡相关基因表达量。
18.图3为npd1下调nmda损伤后rgc中calpain-1的表达。a、b为免疫荧光显示在nmda损
伤后calpain-1在rgc中表达增高；c为免疫荧光显示npd1下调nmda损伤后rgc中calpain-1的表达。
19.图4为npd1调控大鼠nmda损伤后视网膜中小胶质细胞的激活及其吞噬功能；a-c为视网膜中iba1、mcp-1、和cd68的蛋白相对表达量的条带图及统计结果；d和e分别为小胶质细胞的形态代表图及平均突起长度统计值。
具体实施方式:
20.下面结合附图和具体实验对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实验过程中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
21.本发明的一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物，采用玻璃体腔注射n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)建立视网膜神经兴奋性损伤模型，造模前48小时玻璃体腔注射npd1，并以等量平衡盐溶液作为阴性对照；或在造模前1个月使用富含dha的饲料进行喂养，并以缺乏dha的饲料、普通饲料作为阴性对照。建模成功后48-72小时，利用视网膜电流图(erg)、闪光视觉诱发电位(vep)及视觉行为学实验评估小鼠视功能；通过免疫荧光染色检测损伤后rgc凋亡率和生存率及小胶质细胞活化情况；通过蛋白免疫印迹法检测视网膜损伤后凋亡相关蛋白的表达情况及小胶质细胞活化情况。
22.实施例1：玻璃体腔注射npd1降低nmda诱导的rgc凋亡同时改善视功能
23.(1)nmda损伤动物模型的建立及npd1处理：将21天龄的le大鼠随机分为三组，分别行玻璃体腔pbs注射、10mm nmda、单独注射和10mm nmda+100ng npd1共注射，体系皆为2μl，对侧左眼注射2μl pbs。具体步骤包括：应用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉le大鼠，后应用盐酸奥布卡因行眼表麻醉。随后将大鼠置于手术显微镜下，充分暴露眼球后，使10μl微量注射器以与眼球壁成15
°
的角度，从外眦部进针，将1μl液体缓慢注入玻璃体腔。
24.(2)制作冰冻切片：分离眼球后，置于4％pfa中固定10min，后去除前节置于4％pfa室温固定1h，转移至30％蔗糖中脱水过夜。取出脱水成功的视杯置于吸水纸上，待其干燥后包埋于o.c.t中，置于-80℃中冰冻，后用冰冻切片机将其切成10μm的视网膜切片并贴于载玻片上。选取包含视乳头的视网膜纵切面进行下一步的免疫荧光染色。
25.(3)免疫荧光染色检测nmda损伤后rgc的存活率和凋亡率：配制含1％bsa和0.5％triton的封闭破膜液，滴加并覆盖视网膜切片，于37℃孵育30min；配制含1％ bsa和0.3％ triton的抗体稀释液，以此稀释一抗至目标浓度并与样本在4℃孵育过夜。而后用相应物种的二抗于室温下避光孵育2h。根据tunel试剂盒说明书操作标记凋亡细胞。最后用dapi染液标记细胞核5min，后清洗3遍。滴加抗荧光淬灭剂进行封片，完成后即可在荧光或共聚焦显微镜下观察目标细胞的形态特征或目标抗原的表达模式。
26.(4)视网膜电流图(erg)及闪光视觉诱发电位(vep)及评估小鼠视功能：le大鼠经暗适应过夜后由上述同种方式麻醉。待其昏迷后，用托吡卡胺滴眼充分扩瞳，并将其安置于espion diagnosys电生理仪器的恒温台上，正确安装电极，包括覆盖角膜的负极、皮下埋置在两只眼睛之间的参考电极以及连接尾巴的地电极。两角膜电极同时用作光刺激器和反应记录器，在恒定的绿色背景(40cd/m2)下光适应5min以抑制感光细胞的电生理活性后，在
11.38cds/m2的绿光的刺激下采集稳定波形并提取其b波后第一个负反应的幅值以评估rgc的电生理活性。
27.大鼠准备同erg检测。角膜电极用作光刺激器，皮下埋置的参考电极和负电极分别位于两只眼睛之间及枕骨粗隆，而接地电极埋置于大鼠尾部。在白色背景(30cd/m2)下，两个角膜刺激器(3cds/m2)交替运行以排除对侧眼的电活动干扰，采集提取p2波幅值以评估视觉功能。
28.(5)视觉行为学评估大鼠视功能:将待测大鼠置于暗箱，暗适应过夜，不限食水；将le大鼠置于平台上适应2min，待其稳定后，运行电脑程序，此时显示屏上将依次出现空间频率为0.05至0.6cycle/degree(c/d)的顺时针或逆时针移动的黑白光栅，其旋转速度为12
°
/s，对比度为100％。每个测试阶段中，置于设备上空的摄像机将记录大鼠识别光栅的头部追踪行为；由两人分别统计大鼠的最佳视敏度，即大鼠可以区别并响应的最高空间频率。逆时针和顺时针旋转的不同光栅分别对应左、右眼的视敏度。
29.结果如图1所示：玻璃体腔注射npd1不仅可以降低nmda诱导的rgc凋亡反应，同时可以显著改善nmda造成的视功能损伤。
30.实施例2：玻璃体腔注射npd1减少nmda损伤后rgc中calpain-1的表达水平
31.(1)蛋白印迹法检测calpain家族及凋亡相关蛋白表达水平：le大鼠分组处理同实施例1，建模后在固定时间点断颈处死，分离视网膜组织，提取总蛋白进行western blotting实验检测相关表达。配制含1％蛋白酶抑制剂的ripa蛋白裂解液，经水浴超声匀浆提取新鲜视网膜蛋白样品；根据bca试剂盒说明，检测各蛋白样品浓度；据sds-page凝胶试剂盒说明配制10％分离胶和5％上层浓缩胶；各孔蛋白上样量为20μg，在80v恒压下电泳至各孔样品到达两层胶的分界面，即转120v恒压电泳，当溴酚蓝条带跑出分离胶下缘时停止电泳，卸下凝胶，切胶、裁膜，并于冰水浴中，以300ma恒流湿转60min；电转完毕后，取出pvdf膜依次以tbst漂洗10min及5％bsa室温封闭2
32.h；随后，pvdf膜与抗体于4℃恒温摇床孵育过夜；吸弃一抗并漂洗后用hrp标记的相应物种的二抗于室温摇床上孵育2h；最后在bio-rad凝胶成像系统曝光成像并采集数据，利用image lab软件分析条带灰度值，并计算各组样品目标蛋白相对表达量。
33.(2)实时荧光定量pcr技术检测calpain-1及凋亡相关基因转录水平：le大鼠分组处理同实施例1，建模后在固定时间点断颈处死，分离视网膜组织，剪碎后置于1ml trizol中，利用氯仿抽提法提取总rna；在利用紫外分光光度仪评估检测总rna的质量及浓度；其后按照takara逆转录试剂说明书去除基因组dna，而后将去除基因组dna的rna反转录为cdna；利用特异性引物、各组cdna及sybr green试剂进行实时定量pcr，其结果在bio-rad系统上读取分析，评估各目标基因的融解曲线及ct值，随后利用公式计算目的基因相对表达量。
34.实施例3：玻璃体腔注射npd1调控大鼠nmda损伤后视网膜中小胶质细胞的激活程度
35.(1)蛋白印迹法检测小胶质细胞相关蛋白表达水平：具体步骤同实施例1。
36.(2)免疫荧光染色观察nmda损伤后视网膜小胶质细胞形态：配制含1％bsa和0.5％triton的封闭破膜液，滴加并覆盖视网膜切片，于37℃孵育30min；配制含1％ bsa和0.3％ triton的抗体稀释液，以此稀释一抗至目标浓度并与样本在4℃孵育过夜。而后用相应物种的二抗于室温下避光孵育2h。最后用dapi染液标记细胞核5min，后清洗3遍。滴加抗荧光淬
灭剂进行封片，完成后即可在荧光或共聚焦显微镜下观察小胶质细胞形态特征并对其树突长度进行记录。
37.表1:npd1对nmda损伤视网膜中tunel和brn3a双阳性细胞比例的影响(ap＜0.05vs pbs，bp＜0.05vs nmda,x
±
s,n＝12,％)
[0038][0039]
表2:npd1对nmda损伤视网膜中brn3a阳性细胞比例的影响(ap＜0.05vs pbs，bp＜0.05vs nmda,x
±
s,n＝12,％)
[0040][0041]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物，其特征在于，包括以下步骤：玻璃体腔注射neuroprotectin d1(npd1)降低n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)诱导的rgc凋亡同时改善视功能；(1)n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)损伤动物模型的建立及neuroprotectin d1(npd1)处理：将21天龄的le大鼠随机分为三组，分别行玻璃体腔pbs注射、10mm nmda、单独注射和10mm nmda+100ng npd1共注射，体系皆为2μl，对侧左眼注射2μl pbs，具体步骤包括：应用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉le大鼠，后应用盐酸奥布卡因行眼表麻醉，随后将大鼠置于手术显微镜下，充分暴露眼球后，使10μl微量注射器以与眼球壁成15
°
的角度，从外眦部进针，将1μl液体缓慢注入玻璃体腔；(2)制作冰冻切片：分离眼球后，置于4％pfa中固定10min，后去除前节置于4％pfa室温固定1h，转移至30％蔗糖中脱水过夜，取出脱水成功的视杯置于吸水纸上，待其干燥后包埋于o.c.t中，置于-80℃中冰冻，后用冰冻切片机将其切成10μm的视网膜切片并贴于载玻片上，选取包含视乳头的视网膜纵切面进行下一步的免疫荧光染色；(3)免疫荧光染色检测nmda损伤后rgc的存活率和凋亡率：配制含1％bsa和0.5％triton的封闭破膜液，滴加并覆盖视网膜切片，于37℃孵育30min；配制含1％bsa和0.3％triton的抗体稀释液，以此稀释一抗至目标浓度并与样本在4℃孵育过夜，而后用相应物种的二抗于室温下避光孵育2h。根据tunel试剂盒说明书操作标记凋亡细胞。最后用dapi染液标记细胞核5min，后清洗3遍，滴加抗荧光淬灭剂进行封片，完成后即可在荧光或共聚焦显微镜下观察目标细胞的形态特征或目标抗原的表达模式；(4)视网膜电流图(erg)及闪光视觉诱发电位(vep)及评估小鼠视功能：le大鼠经暗适应过夜后由上述同种方式麻醉，待其昏迷后，用托吡卡胺滴眼充分扩瞳，并将其安置于espion diagnosys电生理仪器的恒温台上，正确安装电极，包括覆盖角膜的负极、皮下埋置在两只眼睛之间的参考电极以及连接尾巴的地电极，两角膜电极同时用作光刺激器和反应记录器，在恒定的绿色背景(40cd/m2)下光适应5min以抑制感光细胞的电生理活性后，在11.38cds/m2的绿光的刺激下采集稳定波形并提取其b波后第一个负反应的幅值以评估rgc的电生理活性；大鼠准备同erg检测。角膜电极用作光刺激器，皮下埋置的参考电极和负电极分别位于两只眼睛之间及枕骨粗隆，而接地电极埋置于大鼠尾部。在白色背景(30cd/m2)；(5)视觉行为学评估大鼠视功能：将待测大鼠置于暗箱，暗适应过夜，不限食水；将le大鼠置于平台上适应2min，待其稳定后，运行电脑程序，此时显示屏上将依次出现空间频率为0.05至0.6cycle/degree(c/d)的顺时针或逆时针移动的黑白光栅，其旋转速度为12
°
/s，对比度为100％，每个测试阶段中，置于设备上空的摄像机将记录大鼠识别光栅的头部追踪行为；由两人分别统计大鼠的最佳视敏度，即大鼠可以区别并响应的最高空间频率，逆时针和顺时针旋转的不同光栅分别对应左、右眼的视敏度。2.根据权利要求1所述的一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物，其特征在于，neuroprotectin d1是作为活性成分的rgc保护药物。3.根据权利要求1所述的一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物，其特征在于，neuroprotectin d1是由15-脂氧酶(15-lox)以二十二碳六烯酸
(dha)作为底物生成的下游代谢产物。4.根据权利要求2所述的一种含neuroprotectin d1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物，其特征在于，neuroprotectin d1在制备抑制rgc损伤或凋亡的药物中药物组合物可呈选自如下的剂型：溶液、悬液、乳剂、丸剂、片剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。

技术总结
本发明公开了一种含Neuroprotectin D1作为活性成分的视网膜神经节细胞保护药物，包括玻璃体腔注射Neuroprotectin D1(NPD1)降低N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的RGC凋亡同时改善视功能：N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)损伤动物模型的建立及Neuroprotectin D1(NPD1)处理，制作冰冻切片，免疫荧光染色检测NMDA损伤后RGC的存活率和凋亡率，视网膜电流图(ERG)及闪光视觉诱发电位(VEP)及评估小鼠视功能，视觉行为学评估大鼠视功能。行为学评估大鼠视功能。


技术研发人员：郜原 朱立夫 黎其友 马俊锋
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/10/19