一种dsRNA污染物的评估标志物及其利用斑马鱼早期胚胎进行检测的方法

一种dsrna污染物的评估标志物及其利用斑马鱼早期胚胎进行检测的方法
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种dsrna污染物的评估标志物及其利用斑马鱼早期胚胎进行检测的方法，所述方法为mrna疗法所依赖的体外转录mrna的质量检测新方法。


背景技术：

2.体外转录的信使rna(ivt mrna)已被广泛用于基因功能研究和rna治疗技术，这些rna作为治疗药物需要具有低免疫原性的功能性rna。在体外转录过程中，会产生双链rna(dsrna)副产物。这些dsrna可以被模式识别受体(pattern recognition receptors，prrs)识别为类病毒非自身分子，这些模式识别受体包括分布于内体的toll样受体家族成员tlr3、细胞质中的rig-i和mda5。当这些prrs识别到dsrna时，便会激活信号转导，导致干扰素(ifns)和促炎症细胞因子的表达上升。这些因子启动jak/stat级联反应，触发大量基因的上调，包括负责抗病毒活动的干扰素刺激基因(interferon stimulated genes，isgs)。此外，dsrna还可以诱导综合性应激反应(integrated stress response，isr)。它结合并激活蛋白激酶r(pkr，也称eif2ak2)，通过磷酸化翻译起始因子eif2α来阻止整体的蛋白质翻译。ivt mrna中的dsrna副产物会导致强烈的先天免疫反应，甚至导致人体出现休克症状，此外，dsrna副产物也会降低治疗性mrna的翻译水平，弱化其治疗效果。
3.显然ivt mrna在用于rna疗法之前，需要进行严格的质量控制。如，进行体内实验前利用dsrna特异性抗体j2来检测体系中dsrna中的含量，可以初步确定ivt mrna的质量，此方法能够快速检测出dsrna，但是抗体的灵敏性与dsrna的长度相关，并且体外实验无法直接反映体内情况而降低其可靠度；基于冷冻电镜(cryo-em)的mda5特异结合法，mda5和dsrna复合体结合后会存在短纤维丝，每个mda5分子横跨14-15个rna碱基对，可以利用此方法来观察胞质内dsrna的存在及确定其长度，但是这一技术方法因为其设备要求高而受限，并且也无法直接评估dsrna是否会对细胞或个体造成的实际影响；用小鼠和哺乳动物细胞进行mrna质量检测时，需要体外人工的先将ivt mrna进行lnp脂质体包装，然后再通过尾静脉注射或者细胞转染的方式将ivt mrna导入，检测干扰素上调的水平，这是目前检测和评估ivt mrna中免疫源性最常用的方法，但此方法试剂费用昂贵，步骤繁琐，对于实验人员的技术要求比较高，需要具备此方面的实验技术和理论基础才能从事此检测，对于非实验人员并不友好。因此目前缺少基于体内实验的、快速、高效、经济实惠并且对于检测人员操作要求低的dsrna的检测方法。
4.斑马鱼作为目前研究逐渐广泛的模式生物，已经开始逐渐的应用于多个领域包括环境、物化、生化、材料等的检测和监测。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100％，所以可用斑马鱼模拟人类疾病。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病。相比于传统的模式生物，斑马鱼的饲养成本更低并且更容易成活，易于室内大规模繁
殖，对检测人员的依赖程度低；产卵数更多，一次产卵200～300枚，足够保证多次实验的同时开展；斑马鱼胚胎体积大，直径大约700μm，可以方便快速的对其胚胎进行显微注射来实现在体研究，目前基于对显微注射技术的开发，机械臂能够协助检测人员更快更高效的实现这一显微技术，目前开发出的自动显微注射仪，使得即使在缺乏显微注射技术的情况下也能在斑马鱼胚胎中实现注射；斑马鱼胚胎体外透明发育便于观察，可以直接在光镜下观察来确定污染物对胚胎造成的影响，对于检测人员十分友好。斑马鱼已在国内外成为一种热门的药学研究工具，目前斑马鱼的研究主要限于发育遗传学方面，深度开发在斑马鱼胚胎中实现快速高效地检测ivt mrna疗法可靠性的方法具有积极正向的发展前景。


技术实现要素：

5.基于上述问题，申请人最近发现ivt mrna中的dsrna污染物会在斑马鱼早期胚胎中引起一种前所未见的应激反应。这些发现使我们能够利用斑马鱼胚胎作为一种廉价、快速和敏感的体内系统来进行ivt mrna和mrna疫苗的质量控制。斑马鱼早期胚胎中的p53靶基因，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等的表达水平，可以帮助检测ivt mrna中是否存在过多的dsrna污染物。同时，dsrna在斑马鱼早期胚胎中对luciferase报告mrna翻译的抑制也可以作为检测标准。
6.具体的，本发明提供一种斑马鱼早期胚胎在体外转录mrna的dsrna污染物检测中的应用；
7.进一步的，所述应用为针对斑马鱼早期胚胎中的p53靶基因，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等的表达水平进行定量检测，通过结果判定检测ivt mrna中是否存在过多的dsrna污染物。
8.进一步的，所述定量检测的步骤为：
9.检测p53下游靶基因
10.1)以100pg/胚胎的剂量显微注射ivt mrna到斑马鱼1细胞期胚胎，30枚胚胎以上，未注射的胚胎作为对照；
11.2)在6hpf(受精后6小时)时提取胚胎的总rna，进行反转录得到cdna；
12.3)利用qpcr比较未注射和注射胚胎的p53靶基因的表达水平，以持家基因gapdh的表达作为内参，注射组胚p53靶基因相对表达量上调小于1.5倍为质量合格；
13.其中，进一步的，所述p53靶基因选自isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a中的一种或多种。
14.或者为：检测luciferase报告mrna的翻译水平
15.1)混合注射100pg/胚胎ivt mrna和50pg/胚胎luciferase报告mrna到斑马鱼1细胞期胚胎，30枚胚胎以上；
16.2)单独注射50pg/胚胎luciferase报告mrna的胚胎作为对照。实验设置三组重复；
17.3)在6hpf(受精后6小时)时裂解胚胎，进行荧光素酶报告基因检测。实验组荧光素酶活性下降到对照的80％以下且有显著性差异，则认为有过度的dsrna污染。
18.有益效果
19.本发明发现ivt mrna中的dsrna污染物会在斑马鱼早期胚胎中引起一种前所未见的应激反应，从而提供了一种利用斑马鱼早期胚胎作为ivt mrna中是否存在过多的dsrna
污染物的检测方法，并由此筛选获得了dsrna污染物的评估标志物及其利用斑马鱼早期胚胎进行检测的方法。研究证实，dsrna通过pkr-eif2α非依赖的方式引起全局蛋白质翻译抑制，并导致p53的激活。在缺乏ifn配体的情况下，p53强烈上调了包括干扰素刺激基因在内的大量基因的表达，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等。其中类泛素蛋白isg15的大量表达可以通过增强isgylation来降低蛋白通过泛素蛋白酶体降解的速度。这些发现使我们能够利用斑马鱼胚胎作为一种廉价、快速和敏感的体内系统来进行ivt mrna和mrna疫苗的质量控制。斑马鱼早期胚胎中的p53靶基因，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等的表达水平，可以帮助检测ivt mrna中是否存在过多的dsrna污染物。同时，dsrna在斑马鱼早期胚胎中对luciferase报告mrna翻译的抑制也可以作为检测标准。通过上述检测方法，快速，整个流程包括注射、提取rna、qrt-pcr以及荧光素酶报告基因检测全过程只需要1个工作日，而且可以实现高灵敏性，可以检测到低至1-3.5ng/μl的1kb长度的dsrna的效果。
附图说明
20.图1dsrna在野生型斑马鱼胚胎中特异性上调p53信号通路的靶基因；
21.图2野生型斑马鱼胚胎中dsrna污染物的评估标志物的筛选，其中，a，经过纤维素层析降低三种ivt mrna双链rna的含量，利用j2抗体进行dot blot检测可以明显看出纤维素层析后双链rna的量显著下降。b，注射100pg/胚胎dsrna污染的cas9 mrna可以导致phlda3和isg15的大量表达，原位杂交定性检测可以看到明显增强的染色信号。c，qrt-pcr检测发现p53下游靶基因isg15、phlda3、cdkn1a和casp8都可以用于mrna中双链rna副产物的检测，在减少双链的ivt mrna的刺激下，这些基因的表达水平明显下降；
22.图3isg15表达对dsrna的敏感性检测结果示意图；
23.图4利用luciferase报告mrna检测双链rna污染检测结果。
24.图5实例检测，体外合成的tol2 tp、nanog、gfp mrna在注射到斑马鱼胚胎后isg15表达水平检测结果
25.图6实例检测，体外合成的tol2 tp、nanog、gfp mrna在注射到斑马鱼胚胎后luciferase表达水平检测结果
实施例
26.除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
27.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
28.实施例1针对dsrna污染物的斑马鱼早期胚胎评估标志物的筛选
29.向野生型和mztp53突变体中注射30pg dsrna(实验所用的dsrna来源于cas9 mrna前1000bp的序列，先转录出正义链和反义链，然后1：1混合通过退火生成，具体序列如seq id no.1所示，
30.gatggcaaaggttgacgatagcttctttcatagactggaggagagcttcctggtcgaggaggacaagaa
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33.gattgaaggagacctgaaccccgataacagcgatgttgataaactgttcatccaactggttcagacctataaccaactgt
34.ttgaggagaaccctattaacgccagcggagtggatgcaaaggccatcctgagcgctagactgagcaaaagcagaagactg
35.gaaaatctgatcgcccagctgcccggcgaaaaaaagaatggactgttcggcaatctgattgcactgagcctgggactgac
36.acctaacttcaagagcaatttcgatctggctgaggacgccaaactgcagctgagcaaagacacatatgatgacgacctgg
37.ataacctgctggcacaaattggtgaccaatacgctgacctgttcctggctgctaagaatctgagcgatgccattctgctg
38.agcgacatcctgagagtgaacacagagattaccaaggcacccctgagcgcaagcatgattaagagatacgacgagcacca
39.ccaagatctgaccctgctgaaggccctggtcagacaacaactgccagagaagtataaagaaattttctttgaccaaagca
40.agaacggttacgctggctacattgacggcggtgcaagccaagaggagttctataagttcattaagccaatcctggagaaa
41.atggatggaactgaggagctgctggttaagctgaatagagaggatctgctgagaaaacaaagaacattcgacaacggtagcatcccacaccagattcatctgggtgagctgcacgcaattctga)，在受精后6小时取斑马鱼胚胎进行rna-seq检测，发现野生型中有大量基因高表达响应dsrna刺激(如图1所示)，而在mztp53突变体(p53缺失突变的斑马鱼品系)中，这些基因的表达水平并不上调。这说明dsrna通过激活p53来调节大批基因的表达水平。
42.图1结果基于转录组的数据，每一列表示实验组的一个重复样。该热图数据经过标准化，显示相对于野生型未注射组上调的倍数。标准化方法如下：每个重复样中某基因的表达水平(tpm)除以野生型三个重复样该基因表达量的平均值。右侧色度条代表相比于野生型未注射，某个基因上调的倍数。这些响应dsrna刺激且位于p53下游的基因ensembl编号分别是：ensdarg00000073711、ensdarg00000100012、ensdarg00000103199、ensdarg00000069630、ensdarg00000075343、ensdarg00000078683、ensdarg00000037804、ensdarg00000041505、ensdarg00000074983、ensdarg00000038151、ensdarg00000075954、ensdarg00000103700、ensdarg00000086374、ensdarg00000059729、ensdarg00000017676、ensdarg00000042727、ensdarg00000069282、ensdarg00000032831、ensdarg00000007077、ensdarg00000111788、ensdarg00000103277、ensdarg00000028173、ensdarg00000061233、ensdarg00000100513、ensdarg00000095966、ensdarg00000062970、ensdarg00000057173、ensdarg00000103788、ensdarg00000041115、ensdarg00000087832、ensdarg00000086685、ensdarg00000093440、ensdarg00000100964、ensdarg00000015355、ensdarg00000105292、
ensdarg00000040362、ensdarg00000076554、ensdarg00000110291、ensdarg00000105499、ensdarg00000088165、ensdarg00000070705、ensdarg00000079403、ensdarg00000093005、ensdarg00000004392、ensdarg00000021547、ensdarg00000116628、ensdarg00000042904、ensdarg00000062058、ensdarg00000010658、ensdarg00000042874、ensdarg00000096594、ensdarg00000019856、ensdarg00000000588、ensdarg00000045553、ensdarg00000058325、ensdarg00000090401、ensdarg00000094584、ensdarg00000055100、ensdarg00000091280、ensdarg00000041108、ensdarg00000097746、ensdarg00000042410、ensdarg00000102572、ensdarg00000097929、ensdarg00000045636、ensdarg00000117583、ensdarg00000043323、ensdarg00000057568、ensdarg00000105162、ensdarg00000069888、ensdarg00000003219、ensdarg00000063665、ensdarg00000115416、ensdarg00000062489、ensdarg00000077237、ensdarg00000020693、ensdarg00000086996、ensdarg00000100279、ensdarg00000102554、ensdarg00000042641、ensdarg00000095893、ensdarg00000069909、ensdarg00000093577、ensdarg00000041107、ensdarg00000003584、ensdarg00000036541、ensdarg00000023587、ensdarg00000044754、ensdarg00000039943、ensdarg00000007289、ensdarg00000042900、ensdarg00000059057、ensdarg00000004150、ensdarg00000031683、ensdarg00000076093、ensdarg00000079402(http://asia.ensembl.org/index.html)。
43.实施例2isg15、phlda3、casp8和cdkn1a等的表达水平进行定量检测
44.进一步实验中，从上述结果中选取了转录组中上调最明显的4个基因，分别为isg15、phlda3、casp8和cdkn1a，随后对这4个基因进行rt-qpcr来验证其上调比例，发现isg15和phlda3的表达对dsrna的刺激相比于另外两个基因更加敏感，因此更适用于进行dsrna污染物的评估。
45.并对其进行了进一步的研究，具体如下：
46.1)体外合成cas9 mrna(ambion，am1340)，随后对cas9 mrna进行纤维素层析(m,boros g,muramatsu h,et al.a facile method for the removal of dsrna contaminant from in vitro-transcribed mrna.mol ther nucleic acids.2019；15:26-35)以去除或者降低mrna中的dsrna污染物的含量，并利用dsrna特意性抗体j2(scicons,10010500)来确定rna中dsrna的含量，纤维素层析后可见mrna中的dsrna降低(图2a)。
47.2)200pg cas9 mrna显微注射到斑马鱼胚胎中，6小时后提取胚胎的总rna(取30枚胚胎到1.5ml ep管中并去掉水分，加入200μl trizol使胚胎裂解，随后用200μl枪尖充分吹吸以确保胚胎充分裂解；加入200μl的酚氯仿并涡旋以去除水相中的蛋白杂质，4℃离心机12000g离心15min，吸取上清至干净的ep管中，加入等体积的异丙醇，1/10体积的醋酸铵以沉淀rna；4℃离心机12000g离心15min，去除水相，加入700μl-20预冷的70％乙醇并4℃离心机12000g离心15min，随后去掉上清，室温静置5min后加入ddh2o以溶解rna沉淀)，并进行反转录(transgene,at301)以获得cdna，随后进行qpcr(所用到的qpcr试剂(mei5,mf787-01)，扩增引物如表1所示，及仪器(longgene)及程序可参照标准实验步骤定量分析，随后利用2-δδct
法(所有组的值除以内参值后获得表达水平，随后注射组的值除以未注射组的值即为相对表达水平)来标定mrna的表达水平，以确定isg15,phlda3表达水平升高明显(图2b)，可以作为检测体外转录mrna的dsrna污染物的标志物(在后续的检测中，二者选其一即可)。
48.表1 qpcr所用引物
49.名称序列isg15 qpcr-ftgacgatgcagctgactgtaisg15 qpcr-rcaacttcatgccagactcgaphlda3 qpcr-fttcgagcagatgaccactctphlda3 qpcr-rctcaaagttcgacgtcacctcdkn1a qpcr-fatggcggcgcacaagcggatcdkn1a qpcr-rcactagacgcttcttggcttcasp8 qpcr-fttctgcgactggatgagcaacasp8 qpcr-rtccatatcagtgcctgttcggapdh qpcr-fttgccgttcatccatctttggapdh qpcr-rtgctgtaaccgaactcattgtc
50.结果显示，确定dsrna的具体剂量可以评估mrna的污染程度，基因标记物在上调1.5倍可以判定该mrna具有污染性。
51.进一步，以isg15为检测靶标对dsrna污染物的评估，如上所述，简述为向斑马鱼胚胎中梯度注射如上所示的dsrna(3pg，5pg，7pg)，并在6小时后进行rt-qpcr来确定isg15mrna的表达情况。isg15 mrna的表达水平随着dsrna的注射剂量提升而升高，当注射剂量在7pg时，isg15的表达水平升高到未注射胚胎的1.5倍以上，并且有统计学显著性差异(图3)。
52.对于需要检测是否存在dsrna污染的mrna，在体外合成后可以注射200pg mrna到斑马鱼胚胎中，培养至6小时后提取rna进行rt-qpcr，检测注射组的isg15 mrna的表达水平是否高于为注射组mrna的1.5倍，如果低于1.5倍，可以认为此mrna是无毒的，可以进行下一步实验，如果isg15 mrna高于1.5倍甚至更高，则需要注意mrna可能在后续的实验中会造成实验毒性影响。
53.实施例3利用luciferase报告mrna检测双链rna污染
54.同样的，mrna中的dsrna毒性影响会造成胚胎的翻译抑制，因此利用luciferase报告基因来检测mrna污染也是可行的方案。相比于rt-qpcr，luciferase检测可以直接通过检测荧光素的荧光强度来直接判断翻译抑制水平，在时间成本上可能更短。
55.1)，在注射luciferase mrna(将质粒addgene-128046序列中的luciferase克隆到pcs2质粒的bamhi和clai位点)前我们对其mrna进行了污染监测，其mrna并不会引起isg15的高表达，表明在转录luciferase mrna过程中不倾向于产生dsrna污染物。
56.2)，同样地，共同注射dsrna(5pg，10pg)和luciferase mrna到斑马鱼胚胎中，在6小时后对胚胎进行luciferase表达水平检测(具体参照试剂盒dual luciferase reporter gene assay kit(yeasen，d3001050)的标准步骤进行测定)。
57.3)，在管式发光仪上读取的数值直接标定翻译效率。胚胎在注射5pg dsrna后其翻译水平达到了正常值的30％(图4)，说明注射5pg dsrna会引起明显的翻译抑制，可以确定注射5pg dsrna能够对胚胎造成毒性污染，检测灵敏度与rt-qpcr检测方法相当。
58.4)，对于需要检测是否存在dsrna污染的mrna，在体外合成后可以注射200pg mrna和50pg luciferase mrna到斑马鱼胚胎中，并在6小时检测luciferase的表达水平，如果翻
译抑制水平在正常值的80％以上，可以认为此mrna是无毒的，如果翻译抑制水平低于正常的80％甚至更低，则需要注意mrna可能在后续的实验中会造成实验毒性影响。
59.结果如图4所示，说明用luciferase报告mrna的灵敏性与检测isg15的表达相当或更好。
60.实施例4检测利用dsrna污染检测标记物和luciferase报告mrna来检测tol2 tp,nanog,gfp在体外转录过程中dsrna污染情况
61.评估ivt mrna中dsrna污染程度是本方法最为重要的一环，为此选取了斑马鱼的内源基因nanog和两个外源工具基因tol2 tp,gfp作为检测标准。
62.1)，在体外分别合成了这三种mrna，并注射200pg mrna到斑马鱼胚胎中，在6小时提取30枚胚胎的总rna，并进行rt-qpcr检测isg15的表达水平。通过利用2-δδct
法计算得出，tol2 tp和nanog mrna注射会引起isg15的高表达，其表达水平相比于未注射组上调了大约4.5，6.5倍(图5)，上调比率远高于界定值1.5，因此ivt tol2 tp和nanog mrna中存在dsrna污染，实验人员在进行下一步实验时需要引起注意避免造成实验假象。而注射gfp mrna不会引起isg15的明显高表达，其表达水平相比于未注射组并未出现明显的变化，因此ivt gfp mrna中不存在或者存在极低dsrna污染。
63.2)，同样地，在注射三种ivt mrna组中，利用rt-qpcr检测另一dsrna污染标记物phlda3的表达水平，通过利用2-δδct
法计算得出，tol2 tp和nanog mrna注射会引起phlda2的高表达，其表达水平相比于未注射组上调了大约3.5，5.3倍(图6)，上调比率远高于界定值1.5，因此ivt tol2 tp和nanog mrna中存在dsrna污染，实验人员在进行下一步实验时需要引起注意避免造成实验假象。而注射gfp mrna不会引起phlda3的明显高表达，其表达水平相比于未注射组并未出现明显的变化，因此ivt gfp mrna中不存在或者存在极低dsrna污染。
64.3)，在体外分别合成了这三种mrna，并分别注射200pg mrna与50pg luciferase mrna到斑马鱼胚胎中，在6小时利用荧光素酶检测试剂盒检测luciferase的表达水平。发现tol2 tp和nanog mrna的注射会引起luciferase表达降低，其表达水平相比于仅注射luciferase mrna组下调到10％以下，下调比率低于界定值80％，因此ivt tol2 tp和nanog mrna中存在dsrna污染，实验人员在进行下一步实验时需要引起注意避免造成实验假象。而注射gfp mrna不会引起luciferase的明显低表达，其表达水平相比于未注射组并未出现明显的变化，因此ivt gfp mrna中不存在或者存在极低dsrna污染。
65.4)基于rt-qpcr检测和luciferase报告检测发现，其两者都能很好的反映出ivt mrna中dsrna污染，检测结果与利用本领域j2抗体体外检测dsrna方法的结果一致，说明本技术的方法可以作为一种高通量而且简便的体内检测方法应用在基因功能研究和rna治疗技术中，为进一步开展ivt mrna相关实验提供了最初始的保障。
66.前述内容出于解释目的描述了一些示例性实施方案。尽管前面的讨论已经给出了具体的实施方案，但是本领域技术人员将认识到，可以在形式和细节上做出改变，而不脱离本发明的更广泛的精神和范围。因此，说明书和附图应当以说明性的而不是限制性的意义考虑。因此，该详细描述不应以限制性意义理解，并且本发明的范围仅由所包括的权利要求书以及这些权利要求书所享有的等同方案的全部范围来限定。

技术特征：
1.一种斑马鱼早期胚胎在体外转录mrna的dsrna污染物检测中的应用，其特征在于所述应用为针对斑马鱼早期胚胎中的p53靶基因，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等的表达水平进行定量检测，通过结果判定检测ivt mrna中是否存在过多的dsrna污染物。2.如权利要求1所述的一种斑马鱼早期胚胎在体外转录mrna的dsrna污染物检测中的应用，其中定量检测的步骤为：检测p53下游靶基因1)以100pg/胚胎的剂量显微注射ivt mrna到斑马鱼1细胞期胚胎，30枚胚胎以上，未注射的胚胎作为对照；2)在6hpf(受精后6小时)时提取胚胎的总rna，进行反转录得到cdna；3)利用qpcr比较未注射和注射胚胎的p53靶基因的表达水平，以持家基因gapdh的表达作为内参，注射组胚p53靶基因相对表达量上调小于1.5倍为质量合格；其中，进一步的，所述p53靶基因选自isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a中的一种或多种。或者为：检测luciferase报告mrna的翻译水平1)混合注射100pg/胚胎ivt mrna和50pg/胚胎luciferase报告mrna到斑马鱼1细胞期胚胎，30枚胚胎以上；2)单独注射50pg/胚胎luciferase报告mrna的胚胎作为对照。实验设置三组重复；3)在6hpf(受精后6小时)时裂解胚胎，进行荧光素酶报告基因检测。实验组荧光素酶活性下降到对照的80％以下且有显著性差异，则认为有过度的dsrna污染。3.isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a中的一种或多种组合物作为dsrna污染物的评估标志物中应用。4.如权利要求3所述的应用，所述应用在斑马鱼早期胚胎中对表达水平进行定量检测，通过结果判定检测ivt mrna中是否存在过多的dsrna污染物；具体步骤为：1)以100pg/胚胎的剂量显微注射ivt mrna到斑马鱼1细胞期胚胎，30枚胚胎以上，未注射的胚胎作为对照；2)在6hpf(受精后6小时)时提取胚胎的总rna，进行反转录得到cdna；3)利用qpcr比较未注射和注射胚胎的p53靶基因的表达水平，以持家基因gapdh的表达作为内参，注射组胚p53靶基因相对表达量上调小于1.5倍为质量合格；其中，进一步的，所述p53靶基因选自isg15、phlda3、casp8和cdkn1a中的一种或多种，以及响应p53信号通路激活上调的基因的一种或多种。5.一种luciferase报告mrna在体外转录mrna的dsrna污染物检测中的应用。6.如权利要求5所述的应用，所述应用在斑马鱼早期胚胎中对表达水平进行定量检测，通过结果判定检测ivt mrna中是否存在过多的dsrna污染物；具体步骤为：1)混合注射100pg/胚胎ivt mrna和50pg/胚胎luciferase报告mrna到斑马鱼1细胞期胚胎，30枚胚胎以上；2)单独注射50pg/胚胎luciferase报告mrna的胚胎作为对照。实验设置三组重复；3)在6hpf(受精后6小时)时裂解胚胎，进行荧光素酶报告基因检测。实验组荧光素酶活性下降到对照的80％以下且有显著性差异，则认为有过度的dsrna污染。

技术总结
本发明提供一种dsRNA污染物的评估标志物及其利用斑马鱼早期胚胎进行快速灵敏的体内检测的方法。研究证实，dsRNA通过PKR-eIF2α非依赖的方式引起全局蛋白质翻译抑制，并导致p53的激活。在缺乏IFN配体的情况下，p53强烈上调了包括干扰素刺激基因在内的大量基因的表达，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等。上述标志物的表达水平，可以帮助检测IVT mRNA中是否存在过多的dsRNA污染物。同时，dsRNA在斑马鱼早期胚胎中对luciferase报告mRNA翻译的抑制也可以作为检测标准。通过上述检测方法，快速，而且可以实现高灵敏性，可以检测到低至1-3.5ng/μl的1kb长度的dsRNA的效果。3.5ng/μl的1kb长度的dsRNA的效果。3.5ng/μl的1kb长度的dsRNA的效果。


技术研发人员：邵明 黄俊 陆通 陈嫒君
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/10/19