一株深海弯曲菌属菌株、培养物、菌剂及其应用

1.本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一株深海弯曲菌属菌株、培养物、菌剂及其应用。


背景技术：

2.聚-3-羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，phb)是生物可降解的高分子聚羟基脂肪酸酯，是原核生物在限制性条件下(如过量碳和低磷、氮、氧等)以聚合物的形式储存于胞内的碳源和能源。phb是3-羟基丁酸聚合体，胞内phb由一层蛋白质和磷脂层包被，为无定形态，易被降解；经有机溶剂提取的phb则以晶体聚合物的形态存在。
3.目前已从环境中分离得到多种phb降解菌，其中曲霉(aspergillus)、青霉(penicillium)、毛霉和拟青霉菌(paecilomyces)等属中的真菌，贪铜菌(cupriavidus)、丛毛单胞菌(comamonas)、假单胞菌(pseudomonas)、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas)和芽孢杆菌(bacillus sp.)等属中的细菌被广泛报道。phb的生物降解包括生物腐蚀(biodeterioration)，生物破碎(biofragmentation)和同化过程，在解聚过程中微生物产生胞外酶将phb降解成为可溶于水的小分子片段，产物通常仅是单体，或单体和二聚体，或低聚物的混合物。也有研究表明phb的降解产物为3-羟基丁酸、乙酰乙酸和少量乙酸，而在有氧条件下，大多被氧化为co2和水。在同化过程中，小分子片段通过生物膜进入到细胞中，参与到代谢循环中。
4.深海弯曲菌属(thalassolituus)是2004年首次在海洋环境中发现的烷烃降解菌，是石油烃污染海水中的优势菌属，多在十四烃或十六烷或混合石油烃为唯一碳源的培养基分离获得。
5.但是，目前没有关于深海弯曲菌属降解phb的报道。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株深海弯曲菌、菌剂及其应用，本发明的深海弯曲菌属菌株w7可以有效降解phb。
7.本发明提供了一株深海弯曲菌属(thalassolituus sp.)菌株w7，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.27013。
8.本发明还提供了一种上述方案所述深海弯曲菌属菌株w7的培养物。
9.本发明还提供了一种菌剂，包括上述方案所述的深海弯曲菌属菌株w7和/或所述的培养物。
10.优选的，所述菌剂中深海弯曲菌属菌株w7的有效活菌数为2～4
×
107cfu/ml。
11.本发明还提供了上述方案所述的深海弯曲菌属菌株w7或者所述的培养物或者所述的菌剂在降解聚-3-羟基丁酸酯中的应用。
12.优选的，所述降解聚-3-羟基丁酸酯包括以下步骤：将上述方案所述的深海弯曲菌属菌株w7或者所述培养物或者所述的菌剂和含有聚-3-羟基丁酸酯的待降解物混合，进行
降解。
13.优选的，所述降解的温度≥20℃。
14.优选的，所述待降解物的盐度≤50g/l。
15.优选的，所述待降解物的ph为5～8。
16.本发明提供了一株深海弯曲菌属(thalassolituus sp.)菌株w7，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.27013。本发明的深海弯曲菌属菌株能够分泌phb解聚酶，有效降解phb，5天phb降解率高达79.70
±
0.52％。本发明的深海弯曲菌属菌株w7可用于phb制品污染的生物修复，减少环境中phb含量，为phb制品生物降解提供了新的生物资源，对于环境治理具有重大价值，具有客观的经济效益与良好的社会效益。
附图说明
17.图1为深海弯曲菌属菌株w7在固体培养基中的菌落形态及显微镜下的细胞形态；其中，a为w7菌株的菌落形态，b和c为w7菌株的显微形态；
18.图2为深海弯曲菌属菌株w7的生理生化结果；
19.图3为深海弯曲菌属菌株w7的发育树结果；
20.图4为深海弯曲菌属菌株w7的基因序列与食碱海源弯曲菌thalassolituus alkanivorans tmpb967(ok489464)基因序列的dnaman比对结果；
21.图5为深海弯曲菌属菌株w7在不同培养条件下ph变化趋势结果；其中，a为不同盐度培养条件下ph变化趋势；b为不同初始ph培养条件下ph变化趋势；c为不同温度培养条件下ph变化趋势；
22.图6为深海弯曲菌属菌株w7在不同盐度培养条件下相对酶活力及phb降解率变化趋势结果；其中，a为不同盐度培养条件下菌株w7相对酶活力变化趋势；b为不同盐度培养条件下菌株w7降解率变化趋势；
23.图7为深海弯曲菌属菌株w7在不同初始ph培养条件下相对酶活力及phb降解率变化趋势结果；其中，a为不同初始ph培养条件下菌株w7相对酶活力变化趋势；b为不同初始ph培养条件下菌株w7降解率变化趋势；
24.图8为深海弯曲菌属菌株w7在不同温度培养条件下相对酶活力及phb降解率变化趋势结果；其中，a为不同温度培养条件下菌株w7相对酶活力变化趋势；b为不同温度培养条件下菌株w7降解率变化趋势。
25.生物保藏说明
26.深海弯曲菌属(thalassolituus sp.)菌株w7，于2023年4月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.27013。
具体实施方式
27.本发明提供了一株深海弯曲菌属(thalassolituus sp.)菌株w7，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.27013。
28.在本发明中，所述深海弯曲菌属菌株w7分离自天津海发珍品实业公司海水鱼循环水养殖系统。
29.本发明所述的深海弯曲菌属菌株w7通过以下方法分离得到：在所取水样中添加phb，于温度28℃下充气富集培养7d。取富集培养后的培养物于以phb为唯一碳源的液体培养基中培养5～6d，培养温度为28℃，培养转速为200r/min，进行phb降解菌的分离与纯化。取上述培养液经稀释后涂布接种于phb固体培养基中继续培养4～6d，在phb平板上挑取产生明显透明圈的菌落命名为w7。采用16s rrna基因测序进行分子生物学鉴定，dnaman结果表明w7的基因序列与食碱海源弯曲菌thalassolituus alkanivorans tmpb967(ok489464)的一致性为98.75％，经生理生化鉴定结合16s rrna基因的分子鉴定为深海弯曲菌属菌株，命名为深海弯曲菌属(thalassolituus sp.)菌株w7。
30.本发明的深海弯曲菌属菌株w7具有如下生物学特性：革兰氏阴性菌，无鞭毛，需氧生长。菌体呈弯曲状且形态多样，对数生长期细胞呈弯曲的弧形或少量短棒状；且在phb半固体培养基和lb半固体培养基中细菌只沿穿刺线呈明显生长，细胞大小为0.42～0.74μm
×
1.5～6.0μm。在phb固体培养基中菌落为圆形，无色透明，湿润，中央隆起，边缘整齐，直径2～3mm。
31.在本发明中，所述以phb为唯一碳源的液体培养基优选的含有人工海盐10.0g/l，nh4cl 0.2g/l和phb 1.0g/l。在本发明中，所述phb固体培养基以液体培养基为基础，再加入琼脂15.0g/l。
32.在本发明中，所述phb半固体培养基以液体培养基为基础，再加入琼脂7.5g/l；所述lb半固体培养基优选含有酵母浸粉10g/l，胰蛋白胨5g/l，琼脂10g/l。
33.在本发明中，所述深海弯曲菌属菌株w7的16s rrna基因序列如seq id no.1所示，具体为：
34.gctgcatggcggagcttaccatgcagtcgagcggtagaaagtagcttgctacttttgagagcggcggacgggtgagtaatgcgtgggaatctacctggtagtgggggacaacagttggaaacgactgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcgggggatcttcggacctcgtgctatcagatgagcccgcgtgagattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctctagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggttgtagcttaatacgctgcagctgtgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggttgtttgttaagcgagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatttcgaactggcaagctagagtacagtagagggtggcggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgggaaggaacatcagtggcgaaggcggccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctactagttgtcgggagacttgatctcttggtaacgaagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatcctgc gaactttcgagagatcgattggtgccttcgggaacgcagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttgccatcatttagttggggactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggccggtacagagggtcgcgaagccgcgaggtggagctaatctcacaaagccggtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagatagcctaaccttcgggagggcgttaccacgagtattag
gtgt。
35.本发明还提供了一种上述方案所述深海弯曲菌属菌株w7的培养物。
36.在本发明中，所述培养物优选的包括不含深海弯曲菌属菌株w7的培养上清液；所述培养上清液由所述培养液经离心得到。在本发明中，所述培养物优选的包括深海弯曲菌属菌株w7的胞外产物；所述胞外产物包括phb解聚酶。
37.本发明还提供了一种菌剂，包括上述方案所述的深海弯曲菌属菌株w7和/或所述的培养物。
38.在本发明中，所述菌剂中深海弯曲菌属菌株w7的有效活菌数优选为2～4
×
107cfu/ml，更优选为3
×
107cfu/ml。
39.本发明还提供了上述方案所述的深海弯曲菌属菌株w7或者所述的培养物或者所述的菌剂在降解聚-3-羟基丁酸酯中的应用。
40.在本发明中，所述降解聚-3-羟基丁酸酯优选包括以下步骤：将上述方案所述的深海弯曲菌属菌株w7或者所述培养物或者所述的菌剂和含有聚-3-羟基丁酸酯的待降解物混合，进行降解。
41.在本发明中，所述待降解物优选包括phb制品颗粒或者释放于环境中的phb；所述环境优选包括海水；除phb外，所述待降解物中可以不补充其他碳源。
42.在本发明中，所述待降解物的盐度优选为≤50g/l，进一步优选为10～50g/l，更优选为30g/l；本发明的深海弯曲菌属菌株在盐度30g/l条件下，达到最大相对酶活力，可有效降解海水中的phb。
43.在本发明中，所述待降解物所处水体的ph优选为5～8。
44.在本发明中，所述降解的温度优选为≥20℃，进一步优选为20～37℃，更优选为25～28℃。
45.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
46.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
47.在本发明的实施例中，以phb为唯一碳源的液体培养基配方为：人工海盐10.0g/l，nh4cl 0.2g/l和phb 1.0g/l。在本发明中，所述phb固体培养基以液体培养基为基础，再加入琼脂15.0g/l。
48.实施例1、深海弯曲菌属菌株w7的分离、筛选和鉴定
49.一、w7菌株的分离与筛选
50.样品的采集：样品来自于天津海发珍品实业公司海水鱼循环水养殖系统。
51.分离与筛选：在200ml水样中添加0.03g phb，于温度28℃下充气富集培养7d。取10ml富集后的培养液于200ml以phb为唯一碳源的液体培养基中培养5～6d，培养条件为：温度28℃，转速200r/min，进行phb降解菌的分离与纯化。取0.1ml培养液经稀释后涂布接种于phb固体培养基中继续培养4～6d。在phb平板上挑取产生明显透明圈的菌落命名为w7。
52.二、w7菌株的鉴定
53.1、形态学鉴定
54.利用点值法将w7菌株接种于phb固体培养基中培养2d，观察菌落形态；继续培养至
第5d，测量降解圈直径与菌落直径。
55.取10μl处于对数生长期的菌株于载玻片上，滴加2.5％戊二醛固定，用0.5mol/l乙酸铵洗掉外部盐分，1
×
pbs冲洗戊二醛，不同浓度梯度的乙醇脱水，在扫描电子显微镜(美国，feiapreo)下观察细胞形态。
56.菌株w7的菌落形态如图1中的a所示，显微形态如图1中的b和c所示。其中，菌株w7在phb固体培养基培养2d后的菌落为圆形，无色透明，湿润，中央隆起，边缘整齐，直径2～3mm，革兰氏阴性。培养5d后降解圈直径与菌落直径分别为1.28
±
0.08cm和0.72
±
0.08cm，比值为1.98
±
0.16(图1中的a)。在扫描电子显微镜下观察对数生长期细胞呈弯曲的弧形或少量短棒状(图1中的b、图1中的c)，未观察到鞭毛，且在phb和lb半固体培养基中细菌只沿穿刺线呈明显生长。细胞大小为0.42～0.74μm
×
1.5～6.0μm(n＝30)。
57.2、生理生化鉴定
58.将菌株w7在phb固体培养基中培养至对数生长期，接种至biolog实验中公司配制的液体培养基后于28℃培养3d，使用自动微生物鉴定系统(美国，genⅲmicrostation)genⅲmicroplate板进行生理生化特性分析。
59.biolog的显色反应及生理生化结果如图2所示。碳源利用测试结果表明，菌株w7对3-羟基-d,l丁酸、l-乳酸、丙酮酸甲酯、吐温40、丙酸和乙酸呈现较强的代谢能力，对葡糖醛酰胺和乙酰乙酸可能存在一定的代谢。化学敏感性测试表明，菌株w7可在ph 5～8、1％～8％nacl条件下生长，乳酸钠、利福霉素sv、氨曲南和丁酸钠抗性结果为阳性。
60.3、分子生物学鉴定
61.离心收集处于对数生长期的菌株w7，用天根细菌dna提取试剂盒提取总dna，利用细菌通用上游引物27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’(seq id no.2)和下游引物1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’(seq id no.3)进行pcr扩增。pcr反应体系(总体积25μl)为：12.5μl taq酶，0.5μl引物1，0.5μl引物2，11.5μl ddh2o；pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，序列在ncbi数据库中进行比对，采用mega x软件利用clustal w算法进行基因序列比对，使用最大似然法构建系统发育树，树枝上的数值为步长值，自展重复抽样次数为1000次。采用dnaman软件进行序列同源性分析。
62.深海弯曲菌属菌株w7的16s rrna基因序列如seq id no.1所示。
63.发育树结果如图3所示，通过对菌株的形态、生理生化特性和16s rdna测定分析，确定菌株w7分属深海弯曲菌属；dnaman结果如图4所示，结果表明深海弯曲菌属菌株w7基因序列与食碱海源弯曲菌thalassolituus alkanivorans tmpb967(ok489464)的同源相似性为98.75％。
64.实施例2、深海弯曲菌w7对phb的降解特性分析
65.一、不同初始ph、不同温度、不同盐度下培养的深海弯曲菌w7对phb的降解特性影响
66.将菌株w7接种至phb液体培养基中活化，接种至种子培养基至对数生长期，得到种子液。将种子液按3％(v/v)接种量接种于phb液体培养基中，于不同初始ph(分别为ph6、ph7.2和ph8，固定温度和盐度分别为28℃、30g/l)、不同温度(分别为20℃、28℃和37℃，固定初始ph和盐度分别为7.2、30g/l)和不同盐度(10g/l、30g/l和50g/l，固定初始ph和温度
分别为7.2、28℃)下培养5d。
67.1、培养液ph的测定
68.菌株w7于不同盐度、初始ph和温度条件下培养，分别于培养第0.5、1、2、3、4、5d测定培养液ph值。
69.结果如表1和图5所示，菌株w7于不同盐度、初始ph和温度条件下培养，所有菌液ph均在12h内快速降低，1d左右达到最低，1～5d整体ph趋于稳定(ph 5.5～6.0)。
70.表1深海弯曲菌属菌株w7在不同培养条件下ph变化趋势结果
[0071][0072]
2、phb解聚酶酶活力、phb降解率的测定
[0073]
将培养液分别在4℃，12000r/min下离心20min，收集上清粗酶液。
[0074]
将0.1g phb颗粒溶于10ml氯仿并与0.5g/l十二烷基硫酸钠混合，蒸馏水定容至100ml，经超声处理30min后制备成phb乳化液，于75℃下加热搅拌90min除去氯仿，得到phb乳化液。
[0075]
以phb乳化液为底物，取3ml phb乳化液，置于恒温水浴锅中，待达到相应培养温度时加入3ml相应的粗酶液；对照组其他条件不变，加入的是液体培养基中的上清液，保温40min后，用分光光度计(中国，uv-3100，美普达)在650nm波长下测混合液光吸收值(od值)。根据od值计算phb解聚酶酶活力，一个酶活单位定义为：每分钟引起光吸收值降低0.001单位所需的酶量。
[0076]
混合液离心取沉淀，将沉淀置于60℃烘箱烘干后，加入2ml 98％浓硫酸，沸水浴1h，迅速冷却至室温，用5mm稀硫酸稀释50～200倍。利用hplc配备aminex hpx-87h离子排阻有机酸柱(300
×
7.8mm)，通过phb标准曲线计算测定沉淀物中phb的含量，再利用差减法计算phb降解率。hplc条件：洗脱剂为5mm稀硫酸，流速为0.7ml/min，上样量为20μl，柱温65℃，在210nm处检测。标准曲线如式(1)所示。
[0077]
y＝39416x-365754，r2＝0.9944
ꢀꢀ
式(1)。
[0078]
在不同盐度培养条件下，结果如表2和图6所示，3d时盐度30g/l和10g/l到达最大解聚酶活性，盐度50g/l时最大相对酶活力在4d时出现，随着培养时间的继续延长，菌株酶活力呈现不断下降的趋势(图6中的a)。0～0.5d phb降解率快速升高，0.5～2d降解率增加缓慢。2d后，phb降解率逐渐增加。结束时盐度30g/l条件下的phb降解率最大。(图6中的b)
[0079]
表2深海弯曲菌属菌株w7在不同盐度培养条件下相对酶活力及phb降解率变化趋势结果
[0080][0081]
在不同初始ph培养条件下，结果如表3和图7所示，phb解聚酶活性没有显著性差异(图7中的a)。0～0.5dphb降解速率较高，0.5～2d酶活性较低，phb降解率增加缓慢。2d后，phb降解率逐渐增加(图7中的b)。其中初始ph 7.2降解率最高，ph 6最低。
[0082]
表3深海弯曲菌属菌株w7在不同初始ph培养条件下相对酶活力及phb降解率变化趋势结果
[0083][0084]
在不同温度培养条件下，结果如表4和图8所示，37℃的相对酶活力在第3d达到最高，20℃最低(图8中的a)。0～0.5d phb降解率快速升高，0.5～1d phb降解率增加缓慢，2d后，phb降解率逐渐增加，4d时达到最大降解率。其中，在37℃、28℃下，降解率较高，在20℃下降解率较低，但在37℃、28℃下，二者降解率没有显著性差异(图8中的b)。第5d时降解率降低，可能是由于菌株在某种条件下重新合成phb。第5d时降解率降低，不同批次培养的实验菌株phb解聚酶活性和降解率有所差异。
[0085]
表4深海弯曲菌属菌株w7在不同温度培养条件下相对酶活力及phb降解率变化趋势结果
[0086][0087]
结论：在28℃盐度30g/l条件下培养，深海弯曲菌w7分泌的phb解聚酶达到最大相对酶活力，最大phb降解率达到79.70
±
0.52％。
[0088]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一株深海弯曲菌属(thalassolituus sp.)菌株w7，其特征在于，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.27013。2.权利要求1所述深海弯曲菌属菌株w7的培养物。3.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的深海弯曲菌属菌株w7和/或权利要求2所述的培养物。4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中深海弯曲菌属菌株w7的有效活菌数为2～4
×
107cfu/ml。5.权利要求1所述的深海弯曲菌属菌株w7或者权利要求2所述的培养物或者权利要求3或4所述的菌剂在降解聚-3-羟基丁酸酯中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述降解聚-3-羟基丁酸酯包括以下步骤：将权利要求1所述的深海弯曲菌属菌株w7或者权利要求2所述培养物或者权利要求3或4所述的菌剂和含有聚-3-羟基丁酸酯的待降解物混合，进行降解。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述降解的温度≥20℃。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述待降解物的盐度≤50g/l。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述待降解物的ph为5～8。

技术总结
本发明提供了一株深海弯曲菌属菌株、培养物、菌剂及其应用，属于微生物菌剂技术领域。本发明的深海弯曲菌属(Thalassolituus sp.)菌株W7，保藏编号为：CGMCC No.27013。本发明的深海弯曲菌属菌株W7能够分泌聚-3-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶，有效降解PHB，5天PHB降解率高达79.70


技术研发人员：隋丽英 王玉蝶 李科 刘良森 高美荣
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/10/19