一种碱性蛋白酶高效融合表达策略的制作方法

1.本发明属于基因工程改造技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶高效融合表达策略。


背景技术：

2.蛋白酶是指能够将蛋白质降解成小肽和氨基酸的水解酶，占整个工业酶市场的60％。而碱性蛋白酶为在中性至碱性ph 范围内具有活性的蛋白酶的统称。碱性蛋白酶在中性至碱性条件下水解蛋白质肽键、酯键和酰胺键，其最适作用ph一般为8~11。该酶种最早在猪的胰脏中发现。碱性蛋白酶广泛存在于微生物、植物和动物中。碱性蛋白酶主要应用领域包括洗涤剂、饲料、药物、皮革、大豆加工、酿酒厂、肉类嫩化、废物管理、摄影和诊断等轻工业领域。1945年，jaag等最早在地衣芽孢杆菌bacillus licheniformis 中发现了碱性蛋白酶。微生物蛋白酶大多属于胞外酶，与动植物相比，微生物来源的碱性蛋白酶具有分离纯化过程简单、生产周期短且产率高的显著特点。碱性蛋白酶具有较强的耐碱、耐热能力以及水解蛋白质的活力，主要应用在洗涤剂工业上，尤其是洗衣和餐具洗涤剂的生产中。碱性蛋白酶的生产菌种和研究对象主要是枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）及短小芽孢杆菌（bacillus pumilus），如我国目前使用的地衣芽孢杆菌b.licheniformis2709， 短小芽孢杆菌b. pumilus 289和209菌株等。产碱性蛋白酶的放线菌较少，主要来源于链霉菌。另外，某些霉菌也可以产生碱性蛋白酶。目前，我国碱性蛋白酶研究总体趋势发展较好，但国内企业仍不能实现高端碱性蛋白酶制剂的工业化生产，主要原因在于国外专利技术的垄断、国内优良的产酶菌株缺乏、酶的单位活力低、洗涤条件下酶的稳定性较差等。因此，如何提高碱性蛋白酶活力迫在眉睫。
3.在过去的30 年中，蛋白质工程已经成为开发提升酶活性的重要工具。当前利用蛋白质工程技术对碱性蛋白酶的改造主要集中在提高其热稳定性、抗氧化性以及专一性等的研究中。jaouadi等通过蛋白质工程发现5个氨基酸：leu31、thr33、asn99、phe159 和gly182 对短小芽孢杆菌b. pumilus 的sapb 的酶活性有重要影响，通过定点突变构建了12个突变体，结果发现，三重突变体l31i/t33s/n99y 的比活最高，大约为野生型酶的2倍。li 等通过对其n 末端序列-1和-2处位置进行定点诱变，以提高链霉菌角蛋白酶sfp2的表达水平，最终发现l（-1）f突变体（48935 u/mg）的比活性是野生型sfp2的9倍。石亚伟等利用蛋白质工程技术，对pb92 枯草杆菌蛋白酶进行改造，获得a188p+v262i 碱性蛋白酶突变体，相比野生型，其热稳定性以及耐碱性均有明显提高，在两种洗涤剂体系（stpp 体系和mgda 体系）进行评价，发现在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，突变体相比亲本酶具有更优良的稳定性和洗涤性能。蛋白质工程技术出现至今已近40 年，各项技术手段日渐成熟，结合大量的蛋白酶空间结构的揭示，进一步为利用在基因水平上通过氨基酸突变，提升蛋白酶的活性成为提升蛋白酶活力的重要手段。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供一种碱性蛋白酶高效融合表达策略，该策略能较大提高碱性蛋白酶ncap的表达量，为其更好的适应工业化生产奠定了基础，从而有利于碱性蛋白酶的生产。
5.本发明由如下技术方案实现的：一种碱性蛋白酶高效融合表达策略，所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白酶为尼氏芽胞杆菌（niallia circulans）的碱性蛋白酶ncap，genbank 为spu21234.1，对应于氨基酸序列seq id no:1。本发明使用apre的信号肽序列和apre的前导肽序列替换ncap中的信号肽和前导肽序列，获得新的碱性蛋白酶突变体序列，对应于氨基酸序列seq id no:2，命名为ncapf。
6.本发明还提供了一种碱性蛋白酶突变体的制备方法，包括如下步骤：步骤1：获取编码碱性蛋白酶突变体的dna分子。
7.步骤2：将步骤1获得的所述dna分子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞；步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达重组蛋白，分离纯化表达的重组蛋白。
8.在本发明的一些实施例中，步骤2所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）。
9.在本发明的一些实施例中，步骤2所述的宿主细胞为地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）。
10.本发明以碱性蛋白酶ncap为基础，提供使用apre的信号肽序列和apre的前导肽序列替换ncap中的信号肽和前导肽序列，获得新的碱性蛋白酶突变体序列，命名为ncapf。使用ncapf的表达载体构建的表达宿主，发酵碱性蛋白酶酶活为21493.11 u/ml，比野生型菌株提高了45%，极大的提高了碱性蛋白酶的表达量，为其更好的适应工业化生产奠定了基础。
实施方式
11.下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如j.萨姆布鲁克（sambrook，2001）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实例所记载的具体方法步骤。
12.以下实例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
13.碱性蛋白酶突变体的标注：采用“原来的氨基酸位置取代的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如s259k，表示位置259的氨基酸由原来的碱性蛋白酶的ser（s）替换为lys（k），位置的编号与附件序列表seqidno:1中的编号相对应。
14.对于本发明实施例中所涉及的培养基，具体配方如下：lb液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，nacl 1%；lb平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，nacl 1%，琼脂2%；溶液a：0.4g酵母提取物，0.08g酪蛋白水解物，溶于40ml水中。
15.溶液b：5g葡萄糖，溶于10ml水中。
16.溶液c：4.8gkh2po4，11.2gk2hpo4，0.16gmgso4•
7h2o，0.8g柠檬酸三钠，1.6g(nh4)2so4，溶于200ml水中。
17.溶液d：0.9g mncl2•
4h2o，1.415g硼酸，0.68 g feso4•
7h2o，13.45 mg cucl2•
2h2o，23.5 mg znso4•
7h2o，20.2mg cocl2•
6h2o，12.6 mg高钼酸钠，0.855 g酒石酸钠，溶于500ml水中。
18.溶液e：2.16gmgcl2
•
6h2o，溶于20 ml水中。
19.溶液f：147 mg cacl2溶于20 ml水中。
20.溶液g：36.5g山梨醇，溶于100 ml水中。
21.gmⅰ：10 ml溶液a，1.5 ml溶液b，25 ml溶液c，100 ul溶液d，25 ml溶液g，加灭菌水至100ml。
22.gmii：98 mlgmⅰ，1ml溶液e，1ml溶液f，混匀。
23.gmⅲ：9 mlgmⅱ，1 ml甘油。
24.种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，k2hpo41.8%；发酵培养基：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，cacl20.1~0.5%，mgso40.1~0.5%，k2hpo40.5~2%。
25.本发明实施中所述碱性蛋白酶的酶活测定方法可采用下述方法：碱性蛋白酶的酶活测定方法i：碱性蛋白酶酶活测定方法：参照gb/t23527-2009附录b福林法进行，具体反应过程如下。
26.蛋白酶在一定的温度与ph条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680 nm下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成正比例，由此可以计算产品的酶活力。蛋白酶活力定义，即蛋白酶活力为蛋白酶活力单位表示，定义为1 g固体酶粉（或1ml液体酶），在一定温度和ph值条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以μ/g（μ/ml）表示。
27.试剂和溶液（1）福林（folin）试剂（福林︰水=1︰2）；（2）42.4 g/l碳酸钠溶液；（3）0.5 mol/l氢氧化钠溶液；（4）硼酸缓冲液（ph 10.5）；（5）10.0 g/l酪蛋白溶液；（6）100 μg/ml和1 mg/ml的l-酪氨酸标准溶液；（7）6.54%三氯乙酸。
28.酶活测定（1）标准曲线的制定：配置浓度分别为0 μg/ml，10 μg/ml，20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml和50 μg/ml的l-酪氨酸标准溶液。分别取标准液各1.00 ml，各加0.4 mol/l碳酸钠溶液5.00 ml、福林试剂使用液1.00 ml，振荡均匀，置于40℃水浴中显色20 min，取出用分光光度计于波长680 nm，10 mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度a为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。
29.（2）酶活测定取预稀释适量酶液1 ml，然后加入1 ml的40℃预热10%酪蛋白，40 ℃反应10 min；然后加入2 ml三氯乙酸（浓度6.54%），混匀后室温静置10 min以终止反应。取出1ml已终止
的反应液，然后加入5 ml 42.4 g/l碳酸钠溶液，接着加入1 ml福林（folin）试剂，40℃显色反应20min；最后测定od
680
值。
30.（3）计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为μ/ml。样品的酶活力按下面的公式计算：x=a
×k×
4/10
×
n=2/5
×a×k×
n式中：x——样品的酶活力（μ/g或μ/ml）a——样品平行试验的平均吸光度k——吸光常数4——反应试剂的总体积（ml）10——反应时间10min，以1min计n——稀释倍数。
31.碱性蛋白酶的酶活测定方法ii：蛋白水解活性可以通过采用suc-aapf-pna底物的方法来确定。suc-aapf-pna是n琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且它是可以通过内切蛋白酶切割的一种封闭肽在切割后，一个游离pna分子被释放出来，并且它具有黄色颜色并且因此可以通过可见光分光光度法在波长405 nm进行测量。suc-aapf-pna底物是通过巴亨(bachem)(目录号l1400溶解在dmso中)制造。
32.待分析的蛋白酶样品被稀释在残余活性缓冲液中(100 mm tris ph 8.6)。通过转移30 μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加70μl底物工作溶液(0.72 mg/mi于100mm tris ph86中)进行该测定。将该溶液在室温混合并且在0d
405
nm经5分钟每20秒测量吸收。
33.在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的蛋白酶的活性成正比例。应该将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。
34.实施例1：碱性蛋白酶野生型ncap和突变体ncapf的构建和表达：本发明的碱性蛋白酶野生型ncap和突变体ncapf的构建可通过本领域技术人员熟知的方法构建和表达。
35.碱性蛋白酶野生型ncap的氨基酸序列为seq id no:1，根据seq id no:1的氨基酸序列，获得其优化后的核酸序列seqidno:3。 碱性蛋白酶突变体ncapf的氨基酸序列为seq id no:2，根据seq id no:2的氨基酸序列，获得其优化后的核酸序列seq id no:4，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成seq id no:3和seq id no:4。使用gibson assembly的方法将seq id no:3和seq id no:4分别连接到pbe2r载体上，用热激法转入大肠杆菌dh5α，提质粒进行测序确定，获得碱性蛋白酶重组质粒pbe2r-ncap和pbe2r
‑ꢀ
ncapf。
36.将测序正确的重组质粒pbe2r
‑ꢀ
ncap和pbe2r
‑ꢀ
ncapf分别转入感受态细胞wb600中，具体转化过程如下：用枪头挑取在lb平板上生长的wb600单菌落于2 mlgmⅰ中，培养12 h；将过夜培养的菌液加到98 mlgmⅰ中，37℃，200 rpm培养约4 h；取10 ml菌液加入90 mlgmii中，37℃，200 rpm培养约1.5 h；菌体冰水浴30 min，4000 rpm，4℃离心30 min，去上清；加10 mlgmⅲ，混匀，即为感受态细胞wb600。然后在500 μl感受态细胞中加入5 μl 重组质粒，直接将感受态细胞置于37℃，200 rpm摇床培养1.5 h，低速离心3 min，弃部分上清，均匀涂布于含40 μg/ml卡那霉素的脱脂奶粉培养基平板上，37℃恒温培养箱培养12 h。次日平板上的单菌落即为重组菌株，分别命名为wb600/pbe2r
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ncap和wb600/pbe2r
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ncapf。
重组工程菌接种于5ml lb液体培养基（蛋白胨1%，nacl 1%，酵母粉0.5%）中，37℃，200 rpm振荡培养12 h，将菌液按2%的接菌量分别转接于发酵产酶培养基中，37 ℃，200 rpm振荡培养72 h。
37.实施例2：碱性蛋白酶的分离纯化：发酵完成后，发酵液13000 r/min离心15 min，然后上清液用0.22μm膜在正压滤器上过滤去除残留枯草芽孢杆菌。取样测碱性蛋白酶酶活。以wb600/pbe2r
‑ꢀ
ncap作为对照菌株。
38.重组菌株的酶活力显著提高，重组菌株wb600/pbe2r
‑ꢀ
ncapf酶活达到了22591.50 u/ml，相比原始菌株提高了45％。
39.以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种碱性蛋白酶高效融合表达策略，其特征在于，所述碱性蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:2，其编码核苷酸序列为seq id no:4。2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带有编码序列为seq id no:4的碱性蛋白酶基因，所述重组表达载体使用的信号肽序列和前导肽序列为apre的信号肽序列和apre的前导肽序列。3.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包含如权利要求2所述的重组表达载体。4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌生产的碱性蛋白酶在工业上的应用。

技术总结
本发明属于基因工程改造技术领域，提供了一种碱性蛋白酶高效融合表达策略。所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白酶为尼氏芽胞杆菌（Niallia circulans）的蛋白酶NcAP，使用aprE的信号肽序列和aprE的前导肽序列替换NcAP中的信号肽和前导肽序列，获得新的突变体序列NcAPf。突变体NcAPf重组表达菌株发酵碱性蛋白酶酶活为22591.50 U/ml，比野生型菌株提高了45%。所述突变体生产菌株的应用将有利于降低碱性蛋白酶酶的生产成本，为其更好的适应工业化生产奠定了基础。化生产奠定了基础。


技术研发人员：汪小杰 冯娟 骆繆丹 邓子新
受保护的技术使用者：湖北佶凯星生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/10/19