一种以血液中GALNT9为标志物诊断帕金森病试剂盒

一种以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种诊断帕金森病试剂盒，尤其是一种以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒。


背景技术：

帕金森病(parkinson
’ꢀ
diseases，pd) 是仅次于阿尔兹海默症的全球第二种最常见的神经退行性疾病，患病率逐年升高。持续增长的pd发病率使该病为全球所关注，但是pd的病因至今仍尚不明确。目前，对于帕金森病特异性生物标志物的探索集中于实验动物、尸脑组织和脑脊液中，限制了其在临床上的应用。因此，pd临床诊断依赖于运动症状的出现，然而，只有当多巴胺能神经元减少 50%以上及多巴胺含量减少80% 以上时，才会导致黑质-纹状体之间联系通路的平衡功能严重失调而产生的临床症状。因此，临床经验有限的从业者对帕金森病的诊断错误率可能高达25%(miller and o'callaghan, 2015)。
3.多肽n-乙酰半乳糖胺转移酶9（galnt9）是催化蛋白质粘蛋白型o-糖基化的起始酶(guda k, 2009)，迄今为止未见galnt9作为帕金森病生物标志物的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒。
5.本发明的技术解决方案是：一种以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒，其特征在于：含有定量检测人血液中galnt9的pcr引物。
6.所述定量检测人血液中galnt9的pcr引物的dna序列如下：上游引物：ctcgagaggcggaaggcaagtatga；下游引物：aagcttatgaagaccacggagacctg。
7.本发明是发现了帕金森病患者血液中galnt9表达水平显著降低，进而发明了以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒。以容易获得的、无创的、信息丰富的患者血液样品为生物样本，采用实时定量pcr检测galnt9的方法，对帕金森病进行诊断。不仅诊断方法简单、成本低、效率高，而且取样方便、对机体损伤小且诊断的灵敏度及准确率高，有效降低了帕金森病的误诊率。
附图说明
8.图1为本发明实施例mptp诱导的pd小鼠动物模型相关实验结果图。
具体实施方式
9.本发明的一种以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒，含有定量检测人血液中galnt9的pcr引物，所述定量检测人血液中galnt9的pcr引物的dna序列如下：上游引物：ctcgagaggcggaaggcaagtatga；
下游引物：aagcttatgaagaccacggagacctg。
10.实验：1．mptp小鼠模型的构建c57/bl雄性小鼠30只，8~10周龄，体重20~25g，随机分组：pd模型组15只，对照组15只。pd模型组小鼠每3.5天腹腔注射mptp（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）水溶液（2.5mg/ml，溶于生理盐水），10ml/kg共注射10次；对照组则在同一时间注射等体积的生理盐水。同时进行如下操作：
①ꢀ
观察并记录小鼠出现静止性震颤的时间；
②ꢀ
行为学检测：最后一次注射后的第1和第3天分别进行行为学测试，包括爬杆所需时间和悬挂持续时间；
③ꢀ
在最后一次注射的7日后，对小鼠进行眼球取血。之后5只小鼠采用乙醚麻醉，打开胸腔后分别以0.9 %的生理盐水灌流清洗及4 %多聚甲醛固定组织 (in pbs; 50 mmol/l of nah2po4; 5 mmol/l of kcl; 1.5 mmol/l of mgcl2; and 80.1 mmol/l of nacl; ph 7.4)，分离出小鼠中脑组织并制备成石蜡切片。余下10只小鼠，脱颈处死后，分离小鼠全脑并仔细将脑组织中的纹状体结构剥离出来。
11.③‑
1，对脑组织石蜡切片，以抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, th）单克隆抗体为探针做免疫组化分析黑质致密部的th表达量；
③‑
2制备纹状体的组织裂解液上清，以冷丙酮去除上清内的高峰度蛋白质，应用c
18
（3.9mm
×
150mm）反相色谱柱分析多巴胺（da）和5-羟色胺（5-ht）的浓度变化。
12.③‑
3对脑组织石蜡切片，以抗α-synuclein单克隆抗体为探针做免疫组化分析，对帕金森疾病的标志性分子α-synuclein在脑组织内聚集的检测。
13.结果如图1所示，图1中a-c, 运动症状的统计学分析，方法为方差齐的t-检验; *, p《0.05.其中 a，爬杆所需时间的统计学分析；b，悬挂持续时间的统计学分析；c，应用kaplan-meier 方法及log rank检验对非静止性震颤的统计学分析；d，hplc测定的da浓度的统计学分析*, p《0.05；e，hplc测定的5-ht浓度的统计学分析，*, p《0.05；f，抗酪氨酸羟化酶单克隆抗体在黑质致密部的免疫组化分析；g，黑质致密部内酪氨酸羟化酶免疫组化结果的统计学分析，*, p《0.05。
14.pd模型小鼠行为学变化的观察：pd模型组小鼠在第4次给药后开始，每次注射完毕3min内出现肢体僵直、竖尾、竖毛、呼吸急促，随后出现平衡障碍，身体剧烈震颤，暴躁等现象，20min后恢复，但整体活动减少，对外界刺激反应低下。模型组小鼠在第一次打药后的第12天开始出现非静止性震颤，随着造模时间延长，出现此症状的小鼠逐渐增多（图1-c）。对照模型组无明显异常变化。
15.爬杆：此为评估小鼠前肢力量，检测的时间分别为最后一次注射之后的第一天和第三天。与对照组相比，模型组小鼠的爬杆时间显著增多 (pd组：day 1: 11.56
±
3.20秒，p《0.05；day 3：14.44
±
6.01秒，p《0.05；对照组：day 1：8.31
±
2.58秒, day 3：8.06
±
3.61秒) (图1-a)。
16.悬挂：此为评估小鼠前肢的失误，检测的时间也分别为最后一次注射之后的第一天和第三天。与对照组相比，模型组小鼠悬挂的持续时间显著缩短 (pd组：day 1：47.69
ꢀ±ꢀ
23.38秒，p《 0.05；day 3：43.31
ꢀ±ꢀ
18.59秒，p《 0.05；对照组：day 1：86.38
ꢀ±ꢀ
39.40秒；
day 3：91.77
ꢀ±ꢀ
62.44秒) (图1-b)。上述的行为学观察可知pd模型小鼠已具有行为学上的损伤以及非静止性震颤等pd患者所具有的临床症状。
17.小鼠脑组织中pd疾病标志性生化分子的检测：纹状体中多巴胺、5-ht和黑质致密部酪氨酸羟化酶的含量均显著下降。hplc 分析表明纹状体中da的含量显著性降低 (pd：17.82
±
10.06 μmol/l，control：58.57
±
8.73 μmol/l；p=0.006) (图1-d)；纹状体中的5-ht含量也是显著性降低 (pd：3.19
±
2.10 μmol/l，control：10.80
±
3.21 μmol/l，p=0.012)；黑质致密部的酪氨酸羟化酶的免疫组化分析及其结果的统计学分析表明，在pd模型鼠的脑组织黑质致密部酪氨酸羟化酶的表达量显著性降低(the ratio of iod to area，pd：0.095
±
0.002；control：0.052
±
0.004；p《0.01，图1-g和图1-f)。黑质致密部的th染色更加印证了pd模型小鼠具有帕金森疾病的典型特征，即黑质致密部的多巴胺能神经元功能受损，致使酪氨酸羟化酶表达减少，以至于输送到纹状体的da减少，产生了帕金森症状。
18.综上分析，mptp处理的小鼠具有典型的帕金森样病变特征，包括行为学上的改变以及典型的pd样生化指标的变化，说明mptp小鼠模型构建成功。
19.2.血清中galnt9检测方法2.1 血液中mrna的提取和cdna的制备（1）移取血液样品100-200μl加入到一个全新的无菌微量离心管内；（2）加入rna-solv reagent 1ml到离心管中，充分涡旋振荡混匀，在室温下静置孵育3min。
20.（3）然后加入200μl氯仿到微量离心管中，涡旋振荡15s以充分混匀，静置于冰上孵育10min。
21.（4）将样品于4℃，12,000g进行离心15min。离心后的混合液会出现分层，一共分为三相：依次为上层的水相，中间相和下层的苯酚-氯仿相，其中rna位于水相中。
22.（5）转移（4）中的上层水相（不超过80%）加入到无rnaase的无菌微量离心管中，然后加入相同体积的70%乙醇，充分涡旋将其混匀。
23.（6）将hibind rna micro elute column（收集柱）置于2ml收集管中，并转移上述步骤（5）中的混合液体到收集柱中，每次转移最大体积为800μl，置于室温下采用10,000g离心30s，并将收集管中的滤液弃掉。
24.（7）连续加载（5）中的混合液于收集柱中，并重复上述步骤（6），直至（5）中的混合液均从收集柱中滤过。
25.（8）加入rwc buffer 500μl洗涤收集柱，置于室温10,000g离心30s，并弃滤液。
26.（9）把收集柱转移到一个2ml的全新收集管中，再加入rna wash buffer
ꢀⅱ
（含有乙醇）500μl洗涤收集柱，置于室温10,000g离心30s，并将滤液弃去。
27.（10）室温下采用10,000g，再次离心空收集柱2min，完全干燥hibind收集柱基质。
28.（11）将收集柱置于全新的1.5ml无菌收集管中，加入30μl水（depc已处理过）到收集柱基质上，置于室温下采用10,000g离心1min，洗脱rna，并做好标记保存。
29.（12）新鲜配制rna扩增的反应体系，首先配制反应混合液在冰上进行，以去除所提取样品中的内源性基因组dna，具体反应体系如表1，并采用pcr扩增仪进行rna变性、退火反应。其中，rna变性、退火的反应条件：30℃10min，65℃5min，4℃恒温保持。
30.表1
31.（13）配制如表2所示的rna反转录反应体系，合成cdna。合成cdna的反应条件：42℃30min，95℃5min，4℃恒温保持。
32.表2
33.2.2血液中galnt9基因水平的real-time pcr检测以制备好的mrna反转录产物cdna作为模板，进行real-time pcr反应。
34.根据小鼠galnt9的cds序列设计并合成real-time pcr反应引物，如表3，该引物通过primer blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）验证后表明其具有特异性。
35.表3
36.根据人galnt的cds序列设计检测人血液中galnt9的pcr引物如表4， primer blast验证表明其具有特异性。
37.表4
38.3. 对于对照组及模型组小鼠进行血液中galnt9的real-time pcr检测将分别从对照组和模型组（mptp）小鼠眼球抽取的血液，按照步骤2的方法进行real-time pcr检测，结果如表5所示。
39.表5
40.结果表明：和正常小鼠（8.85
±
1.81）相比，在mptp处理的模型小鼠（11.55
±
1.72）中galnt9的
△
ct值显著升高，具有统计学意义，说明了galnt9在具有帕金森样病变的模型小鼠的血液中呈现降低表达。
41.5. 对于人体血液中galnt9进行检测：5.1人群样本信息的统计分析资料来源于医院，采用excel以及spss 21.0对pd患者以及对照人群进行性别分布和年龄分布等基本信息的统计分析，数据真实可靠。
42.5.2 采用上述血清中galnt9的real-time pcr检测方法，检测帕金森病患者及其对等人群的血液中galnt9的表达。
43.结果：本发明实施例被测对象的年龄、性别及构成比的结果如表6所示。可以看出，在66例调查对象中，pd患者共34例，对照人群共32例。在pd患者中，男性有18例，女性有16例，男性患者高出女性患者；从年龄分布来看，pd患者和对照组中处于65岁及以下的人群分别占41.2%和39.4%，65岁以上的人群分别占58.8%和59.6%，主要集中在65岁以上人群。其中pd患者的平均年龄为68.8岁，对照组的平均年龄为67.09岁，二者的平均年龄接近。
44.表6
45.在对照人群和帕金森病患者的人体血液中galnt9表达水平的real-time pcr 测定的
△
ct值如表7所示。
46.表7
47.表达分析的结果表明：正常组δct值范围：4.44-11.81；pd：10.78-18.53，因此，可以确定人体血液中galnt9表达水平的real-time pcr 测定的
△
ct值11.81以上（不含11.81）即为pd患者，而测定的δct值10.78-11.81（含11.81）为pd高风险人群，可对高风险人群结合临床症状进一步排查，大大降低了帕金森病的误诊率。
48.综上分析，在pd模型小鼠以及pd患者血液样本中，均表明galnt9的表达水平降低和pd疾病相关，定量检测galnt9的pcr引物可应用于制备诊断帕金森病试剂盒。

技术特征：
1.一种以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒，其特征在于：含有定量检测人血液中galnt9的pcr引物。2.根据权利要求1所述的以血液中galnt9为标志物诊断帕金森病试剂盒，其特征在于所述定量检测人血液中galnt9的pcr引物的dna序列如下：上游引物：ctcgagaggcggaaggcaagtatga；下游引物：aagcttatgaagaccacggagacctg。

技术总结
本发明公开一种以血液中GALNT9为标志物诊断帕金森病试剂盒，含有定量检测人血液中GALNT9的PCR引物。通过发现了帕金森病患者血液中GALNT9表达水平显著降低，以容易获得的、无创的、信息丰富的患者血液样品为生物样本，采用实时定量PCR检测GALNT9的方法，对帕金森病进行诊断。不仅诊断方法简单、成本低、效率高，而且取样方便、对机体损伤小且诊断的灵敏度及准确率高，有效降低了帕金森病的误诊率。有效降低了帕金森病的误诊率。有效降低了帕金森病的误诊率。


技术研发人员：张文利 马莉 丁文勇 彭圆雯
受保护的技术使用者：大连医科大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/10/19