一种仿生矿化纳米颗粒的制备与应用

1.本发明属于抗细菌感染材料技术领域，具体涉及一种仿生矿化纳米颗粒的制备与应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种复杂的代谢疾病，影响着全世界数百万人的健康。目前成年糖尿病患者约有2.85亿人，到2030年专家预测将增加到4.39亿人。
3.细菌感染是糖尿病溃疡最常见的并发症，也是慢性糖尿病患者组织再生不良的主要原因。糖尿病患者的高血糖状态改变了免疫反应，降低了对感染的抵抗力，再加上长时间的开放性伤口使得糖尿病伤口易于感染。研究指出，糖尿病溃疡的感染往往是复杂的，多由一些革兰阳性菌和革兰阴性菌共同参与，包括金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(e.coli)和铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)等。这些微生物的清除不完全，会导致伤口复发和持续的局部炎症。使得炎症因子长期处于高位，从而延长炎症阶段，造成慢性伤口。
4.而目前临床上对糖尿病慢性伤口的治疗包括皮肤灌注、治疗感染、控制代谢、治疗合并症和局部伤口护理等。但这些标准治疗方式对但糖尿病伤口愈合的有效治疗仍然十分有限。传统的糖尿病创面治疗主要依赖于伤口敷料，该治疗过程长，易造成继发性损伤，且对患者在心理和生理上产生不良影响。而抗生素治疗伤口是控制糖尿病溃疡感染的重要手段，但由于创面感染细菌的多样性和细菌生物膜的产生，为抗生素治疗伤口细菌感染带来了新的挑战。尽管促糖尿病组织修复治疗的技术有一些，即局部药物治疗(如，药物、多肽和生长因子)、细胞疗法(例如，干细胞和成纤维细胞)和基于纳米生物材料的治疗。但是由于糖尿病创面的病因过于复杂，这些由一种或两种物质的单一的疗法已经不足以加速伤口愈合。因此可以考虑结合伤口愈合进程的不同需求，通过多种物质在伤口发展的不同阶段释放，实现在复杂病理微环境下实现特定生物学功能的调控，对糖尿病创面感染实现有序治疗。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提出了一种仿生矿化纳米颗粒的制备与应用，通过仿生矿化策略将葡萄糖氧化酶(gox)固定于阿奇霉素(azm)杂化的fexsy纳米颗粒中，得到纳米颗粒gox@fe
x
sy/azm，该纳米颗粒作为治疗药物在创面细菌感染初期催化葡萄糖产生大量活性氧自由基(ros)提高炎症反应以求迅速杀灭感染微生物；而在后续愈合期中，材料释放的h2s与azm将共同促进巨噬细胞向修复型的m2巨噬细胞极化以有效介导高炎反应后的组织修复，实现高血糖感染创面的有序治疗。
6.为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
7.本发明提供了一种仿生矿化纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
8.s1：将葡萄糖氧化酶加入fecl2·
4h2o溶液中搅拌，再加入阿奇霉素乙醇溶液，继续搅拌，得到混合溶液；
9.s2：在混合溶液中加入nas溶液进行反应，得到黑色沉淀物，清洗干燥后即获得纳米颗粒gox@fe
x
sy/azm。
10.优选的，所述葡萄糖氧化酶、fecl2·
4h2o溶液、阿奇霉素乙醇溶液、nas溶液的质量份数比为2:5:10:3；
11.优选的，所述s1中葡萄糖氧化酶加入fecl2·
4h2o溶液中搅拌3min，再加入阿奇霉素乙醇溶液在低温下搅拌3min；
12.优选的，所述s2中将黑色沉淀用煮沸后的去离子水清洗两次后冻干得到纳米颗粒gox@fexsy/azm。
13.本发明的另一目的在于提供通过上述方法制备的仿生矿化纳米颗粒gox@fe
x
sy/azm在高血糖感染创面的有序治疗的药物中的应用。
14.本发明的有益效果是：
15.本发明制备的仿生矿化纳米颗粒gox@fe
x
sy/azm作为治疗药物能够在创面细菌感染初期催化葡萄糖产生大量ros提高炎症反应以求迅速杀灭感染微生物；而在后续愈合期中，材料释放的h2s与azm将共同促进巨噬细胞向修复型的m2极化以有效介导高炎反应后的组织修复，实现高血糖感染创面的有序治疗，并且由于所得材料对酶的固定以及azm与fe
2+
间的配位作用，使得gox与fe
2+
被有效保护，其可在室温条件下长期保存而不变质，能够为gox@fe
x
sy/azm作为治疗药物介导感染创面的有序管理提供重要保障。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为实施例1中纳米颗粒的tem表征图；
18.图2为实施例1中gox@fe
x
sy/azm的元素映射图；
19.图3为实施例1中fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm的dls图；
20.图4为实施例1中gox@fe
x
sy/azm制备过程中不同组分的红外光谱图；
21.图5为实施例1中gox和azm以及na2s的含量标准曲线图；
22.图6为实施例2中fe
x
sy与gox@fe
x
sy/azm对应的xps光谱图；
23.图7为实施例2中fe
x
sy、gox@fe
x
sy、gox@fe
x
sy/azm在0，1，2，3，4和5天的稳定性图片，其中左管为fe
x
sy，中间管gox@fe
x
sy，右管为gox@fe
x
sy/azm；
24.图8为实施例2中放置第三天fe
x
sy和gox@fexsy/azm的氧化后的粉末形态图；
25.图9是实施例2中gox@fe
x
sy/azm对gox的保护作用示意图；
26.图10是实施例3中gox@fe
x
sy/azm在ph＝7.4、6、5溶液下的电镜图；
27.图11是实施例3中gox@fe
x
sy/azm中h2s的释放曲线图；
28.图12是实施例3中azm和fe
2+
离子的释放曲线图；
29.图13是实施例4中200μg/mlgox@fe
x
sy/azm在不同反应时间下的葡萄糖浓度变化图以及不同反应时间的ph变化图；
30.图14是实施例4中不同浓度gox@fe
x
sy/azm下12小时的葡萄糖浓度变化图以及催化
葡萄糖溶液3h的ph变化图；
31.图15是实施例4中gox@fe
x
sy/azm、5μg/ml gox@fe
x
sy/azm+glu和50μg/mlgox@fe
x
sy/azm+glu的esr光谱图；
32.图16是实施例4中在不同溶液中通过fe
2+
介导的类fenton反应降解后mb的紫外可见吸收光谱和图片；
33.图17是实施例4中不同浓度的fe
2+
介导的类fenton反应降解后mb的紫外可见吸收光谱和图片；
34.图18是实施例5中不同含量fe
x
sy、azm@fe
x
sy、gox@fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm的s.aureus和e.coli培养浊度图；
35.图19是实施例5中s.aureus和e.coli在用10μg/mlpbs、fe
x
sy、azm@fe
x
sy、gox@fe
x
s和gox@fe
x
sy/azm处理后形成的菌落的图片；
36.图20是实施例5中s.aureus和e.coli在用10μg/mlpbs、fe
x
sy、azm@fe
x
sy、gox@fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm处理后形成的菌落的定量结果图；
37.图21是实施例5中通过共聚焦荧光显微镜对pbs、fe
x
sy、azm@fe
x
sy、gox@fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm孵育的s.aureus和e.coli的活/死染色分析示意图；
38.图22是实施例5中与pbs、fe
x
sy、azm@fe
x
sy、gox@fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm一起孵育的s.aureus和e.coli的sem显微图片；
39.图23是实施例6中不同处理对金黄色葡萄球菌生物膜的相应根除效果图；
40.图24是实施例6中不同处理后金黄色葡萄球菌生物膜的三维共聚焦荧光显微镜图像；
41.图25是实施例7中不同浓度的gox@fe
x
sy/azm对红细胞溶血百分比示意图；
42.图26是实施例7中cck-8法定量分析细胞raw264.7活力示意图；
43.图27是实施例7中cck-8法定量分析l929活力示意图；
44.图28是实施例7中cd86(m1标志物)和cd206(m2标志物)在不同治疗后表达的流式散图；
45.图29是实施例7中免疫荧光染色评价各组巨噬细胞表型arg-1(红色，m2巨噬细胞标记物)，inos(绿色，m1巨噬细胞标记物)，hoechst(蓝色，细胞核)示意图；
46.图30是实施例7中巨噬细胞表型arg-1(m2巨噬细胞标记物)，inos(m1巨噬细胞标记物)，hoechst(细胞核)，在raw264.7上清液中tnf-α的elisa结果图；
47.图31是实施例7中巨噬细胞表型arg-1(m2巨噬细胞标记物)，inos(m1巨噬细胞标记物)，hoechst(细胞核)，在raw264.7上清液中il-6的elisa结果图；
48.图32是实施例7中巨噬细胞表型arg-1(m2巨噬细胞标记物)，inos(m1巨噬细胞标记物)，hoechst(细胞核)，在raw264.7上清液中cd206的elisa结果图；
49.图33是实施例7中巨噬细胞表型arg-1(m2巨噬细胞标记物)，inos(m1巨噬细胞标记物)，hoechst(细胞核)，在raw264.7上清液中il-12的elisa结果图；
50.图34是实施例7中在巨噬细胞条件培养基中培养0和24小时的l929细胞的划痕测定图；
51.图35是实施例7中在巨噬细胞条件培养基中培养0和24小时的l929细胞的相对划痕面积的定量分析图；
52.图36是实施例8中小鼠经不同处理后金黄色葡萄球菌感染性创面的代表性图片；
53.图37是实施例8中不同时间点伤口愈合面积百分比的量化图；
54.图38是实施例8中铜绿假单胞菌感染小鼠皮肤或脾脏的细菌存活情况图；
55.图39是实施例8中铜绿假单胞菌感染小鼠皮肤或脾脏的细菌存活情况量化图；
56.图40是实施例8中用elisa法检测肉芽组织tnf-α水平示意图；
57.图41是实施例8中用elisa法检测肉芽组织il-6水平示意图；
58.图42是实施例8中12天时不同处理组创面组织的h&e和masson’s染色图；
59.图43是实施例8中不同处理后12d小鼠主要器官h&e染色图；
60.图44是实施例8中各组小鼠经过治疗后的组织学分析图；
61.图45是实施例8中治疗后12天db/db小鼠的血液生化和血液学检查示意图。
具体实施方式
62.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
63.实施例1
64.纳米颗粒gox@fe
x
sy/azm的合成与表征：
65.将10mg葡萄糖氧化酶加入fecl2·
4h2o(5mg/ml5ml)溶液中搅拌3min，然后加入阿奇霉素乙醇溶解(0.1g/ml500ul)低温下搅拌3min，最后加入nas(3mg/ml5ml)反应30min，得到黑色沉淀，用煮沸后的去离子水洗两次冻干得到矿化纳米颗粒gox@fe
x
sy/azm，gox@fe
x
sy/azm的tem表征如图1所示。
66.再通过同样的方法合成fe
x
sy，fexsy的tem表征如图1中a所示。为了更进一步确定gox@fe
x
sy/azm的元素成分，扫描了gox@fe
x
sy/azm分析了s、fe、c、o和n的元素分布，元素分布如图2所示。如图3所示，水合粒径(dls)显示fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm的直径分别约为125.3nm和135.9nm，当葡萄糖氧化酶(gox)包覆上fe
x
sy和阿奇霉素(azm)之后其粒径比单独的fe
x
sy纳米颗粒增加了约15nm，进一步证实了gox成功包覆上fe
x
sy和azm。如图4所示，与fe
x
sy相比，gox@fe
x
sy/azm在1537cm-1
和2969cm-1
处出现特征吸收峰，分别归属于gox的酰胺基团中c＝o拉伸振动和azm的c-h收缩，证实了gox@fe
x
sy/azm的成功合成。
67.为了进一步确认gox@fe
x
sy/azm中负载gox和azm的百分比含量，分别采用考马斯亮蓝法(bradford)和分光光度法通过标准曲线计算gox和azm的负载量分别为12.1w/w％和29w/w％，如图5所示。为更好定量由fe离子催化反应芬顿反应，通过icp测试fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm中fe的含量，结果显示fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm中fe含量分别为44.3％和17.4％。
68.实施例2
69.gox@fe
x
sy/azm对fe
2+
和gox的保护作用：
70.用x射线光电子能谱研究fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm在储存过程中的铁价态。制备的gox@fe
x
sy/azm纳米粒子的fe2p
3/2
结合能为712.3ev，相当于纯fexsy。当放置3天后fe
x
sy中约有61.64％的fexsy被氧化为fe3o4(图6中a图所示)，而gox@fe
x
sy/azm仅有22.62％的fe
x
sy被氧化为fe3o4(图6所示)。此外，将fe
x
sy、gox@fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm溶液暴露在空气中显示即使在第五天gox@fe
x
sy/azm仍没有明显的颜色变化(如图7所示)。这一现象表明，由于所得
材料对酶的固定以及azm与fe
2+
间的配位作用，使得fe
2+
能够被有效保护，保持溶液中粒子的稳定性。同时冻干的fe
x
sy和gox@fe
x
sy/azm粉末在放置15天后也显示处了类似的fe
2+
的保护作用(如图8所示)。为了进一步研究gox@fe
x
sy/azm纳米颗粒对gox的保护作用，我们将自由的gox和gox@fe
x
sy/azm放置在60℃的高温环境中通过评估gox和gox@fe
x
sy/azm消耗葡萄糖的量评估gox的活性，结果显示gox@fe
x
sy/azm能够有效防止gox在高温环境下的迅速失活(如图9所示)。
71.实施例3
72.gox@fe
x
sy/azm的体外降解与药物释放：
73.由于gox@fe
x
sy/azm可以在糖尿病创面的酸性微环境下通过反应产生h2s气体引起药物的崩解，通过gox@fe
x
sy/azm在ph＝7.4、6、5中通过电镜可以观察到药物随着ph的减低逐渐发生崩解(如图10所示)。通过测量在在同等浓度的gox@fe
x
sy/azm在不同ph条件下gox、azm和fe
2+
的累计释放量(如图11与图12所示)。
74.结果显示，随着ph的降低gox、azm和fe
2+
的释放速率明显升高，表明gox@fe
x
sy/azm的ph响应性，可针对创面进行快速的h2s气体的产生和药物释放。
75.实施例4
76.gox@fe
x
sy/azm的催化活性测试：
77.由于gox可以特异性地催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸和h2o2，生成的h2o2可被fe
2+
介导的类fenton反应催化生成对细菌杀伤的
·
oh，因此通过测量葡萄糖消耗、葡萄糖酸生成和
·
oh生成来评估gox@fe
x
sy/azm的催化能力。首先，通过血糖仪评估反应过程中葡萄糖的消耗量。随着时间的积累，gox@fe
x
sy/azm以200μg/ml孵育的葡萄糖逐渐减少(图13)。在24小时的相同反应时间内，葡萄糖浓度随着gox@fe
x
sy/azm纳米颗粒浓度的增加而降低(图14)。然后，通过检测ph变化来评估葡萄糖酸的产生。溶液在24小时内从中性(～7.4)变为酸性(～3.24)(图13)。ph值在最初的三小时内迅速下降，然后缓慢变化。在24小时的固定反应时间下，溶液的ph随着gox@fe
x
sy/azm浓度的增加而降低(图14)。
78.随后，使用自旋捕捉剂5，5-二甲基-1-吡咯啉n-氧化物(dmpo)，用esr光谱测量了
·
oh的生成。esr谱清楚地显示了dmpo-oh的特征四重信号(1：2：2：1)，表明
·
oh物种是通过gox/glu/fe
2+
介导的催化产生的(图15)。亚甲基蓝(mb)是一种可以被
·
oh降解的染料，被选为
·
oh生成的指标。如图16所示，当mb与gox@fe
x
sy/azm和glu在nahco3/co2缓冲液中孵育1h时，观察到mb吸光度显著降低，而在溶液中进行相同其它组别处理后，mb吸光度没有明显变化。接下来我们探讨不同浓度gox@fe
x
sy/azm催化产生
·
oh的能力，发现mb会随着gox@fe
x
sy/azm的浓度升高而逐渐褪色(图17)，证明了gox@fe
x
sy/azm可以通过消耗glu的方式产生
·
oh。
79.实施例5
80.gox@fe
x
sy/azm的体外抗菌活性：
81.由于葡萄糖代谢能力下降，糖尿病患者的伤口情况往往比较复杂。慢性糖尿病创面的特点是长期炎症和反复的细菌感染。金黄色葡萄球菌(s.aureus)和大肠杆菌(e.coli)感染是糖尿病创面最常见的细菌感染。因此，为了评价纳米复合材料的协同抗菌效果，对s.aureus和e.coli进行了存活实验、稀释板测定法、活/死染色和细菌形态观察。如图18所示，在高葡萄糖培养游离azm水溶性差导致azm@fe
x
sy在高糖环境中的抑菌效果有限。gox@
fe
x
sy组的抗菌活性有所提高，但在低浓度下仍有一定的局限性。然而，gox@fe
x
sy/azm在抗菌能力方面表现出显著的改善，并且在低浓度(7.5ug/ulgox@fe
x
sy/azm)下可以显著减少活细菌的数量。当gox@fe
x
sy/azm的浓度仅为7.5μg/ml就有很好的抗菌效果，因此后续实验以gox@fe
x
sy/azm的10μg/ml为优化剂量。另设空白control、fe
x
sy、azm@fe
x
sy和gox@fe
x
sy组。
82.然后使用稀释板测定法来进一步量化不同处理对s.aureus和e.coli的抗菌效果。如图19所示，对照组、fe
x
sy处理组的菌落数几乎没有变化。与azm@fe
x
sy和gox@fe
x
s组相比，gox@fe
x
sy/azm组的菌落数明显降低，说明gox@fe
x
sy/azm纳米粒子在高血糖环境下具有最好的抗菌效果，其定量结果如图20。然后，进一步采用syto9/pi活/死荧光染色方法分析不同处理方法对s.aureus和e.coli存活的影响。如图21所示，6组syto9(绿色)和pi(红色)的荧光强度与细菌存活试验结果一致。对照组、fe
x
sy处理组几乎没有观察到pi(红色荧光)染色的细菌。与azm@fexs和gox@fexsy组相比，gox@fe
x
sy/azm组的红色荧光增强，说明gox@fe
x
sy/azm纳米粒子在高血糖环境下具有快速的抗菌效果。为更加直观的观察gox@fe
x
sy/azm纳米粒子的抑菌效果，我们还采用了抑菌圈去评估药物的抑菌效果，结果显示gox@fe
x
sy/azm组比其它组显示出最大的抑菌环。
83.为了进一步研究gox@fe
x
sy/azm纳米粒子的抗菌过程，利用扫描电子显微镜观察了细菌的结构变化。如图22所示，对照组、fe
x
sy孵育的s.aureus和e.coli保持完整的细菌形态。值得注意的是，azm@fexsy和gox@fexs孵育的细菌细胞质部分形成聚集体，表明细胞受损。然而gox@fe
x
sy/azm处理后细菌膜大部分溶解，导致细菌细胞壁结构完整性的丧失。
84.综上所述，这些结果表明gox@fe
x
sy/azm通过破坏细菌细胞壁和膜完整性而与细菌发生强烈的相互作用，gox@fe
x
sy/azm纳米颗粒治疗效果显著高于任何一种单一处理。
85.实施例6
86.gox@fexsy/azm的体外的抗细菌生物膜活性：
87.通过结晶紫染色法评估不同处理对金黄色葡萄球菌生物膜的破坏作用。如图23所示，在高浓度(500μg/ml)的处理会产生显著的生物膜破坏。值得注意的是，gox@fe
x
sy/azm表最强的生物膜破坏能力。同时，应用共聚焦显微镜通过直观观察生物膜厚度和密度的变化，进一步验证了不同处理后金黄色葡萄球菌生物膜的破坏情况。如图24所示，用fe
x
sy、azm@fe
x
sy处理的细菌生物膜的结构是完整和紧凑的，这与对照相似。gox@fe
x
sy的处理在一定程度上根除了细菌生物膜。相比之下，gox@fe
x
sy/azm处理的细菌生物膜是最薄和最稀疏的。
88.实施例7
89.gox@fe
x
sy/azm免疫调节功能的体外评价：
90.为了研究gox@fe
x
sy/azm的生物学特性，生物相容性是纳米颗粒在体内使用的重要先决条件。生物安全性首先通过溶血试验和细胞毒性试验进行检测。如图25至27所示，当将gox@fe
x
sy/azm与红细胞(rbcs)共同培养。在超高实验浓度(1600μgml-1)下的溶血率仅为0.42％，表明gox@fe
x
sy/azm可忽略不计的溶血率。细胞毒性通过cck-8法测定。raw264.7和l929细胞在30μg/ml的gox@fe
x
sy/azm培养下的细胞活力保持在85％以上。表明良好的生物相容性。因此，后续实验以gox@fe
x
sy/azm的10μg/ml为优化剂量。另设空白control、fe
x
sy、azm@fe
x
s和gox@fe
x
sy组。
91.在炎症免疫微环境中，巨噬细胞在体内平衡、宿主防御和组织重塑中发挥着重要作用。根据微环境的不同，巨噬细胞可以分化为不同的亚群，例如经典激活的m1巨噬细胞和
交替激活的m2巨噬细胞，因为它们具有很高的可塑性。流式细胞术检测显示，control组的m2巨噬细胞cd206阳性细胞为9.84％，然而经过gox@fe
x
sy/azm处理的巨噬细胞m2巨噬细胞cd206阳性细胞的水平占23.9％(图28)。同时免疫荧光染色显示gox@fe
x
sy/azm处理组巨噬细胞m2标志物arg-1荧光信号显著增强图(图29)。elisa结果显示，il@zif处理巨噬细胞后，促炎细胞因子：tnf-α、il-6分泌明显减少，抗炎细胞因子cd206和il-12(p70)分泌明显升高(图30至图33)。这些结果表明了gox@fe
x
sy/azm可以诱导巨噬细胞向m2极化。
92.随后，基于巨噬细胞elisa的结果，采用巨噬细胞条件培养液体外研究了gox@fe
x
sy/azm促进细胞迁移的调节作用。划痕试验图片及其定量结果显示，gox@fe
x
sy/azm组有有效的细胞迁移能力，划痕面积缩小(图34至图35)。
93.实施例8
94.促进糖尿病皮肤创面模型愈合的生物实验：
95.在体外结果的基础上，我们进一步验证了复合纳米颗粒是否可以加速糖尿病感染性伤口的愈合过程。使用s.aureus感染的糖尿病小鼠皮肤伤口模型来评估我们的策略的抗菌效果和伤口愈合效果。s.aureus感染后24小时进行治疗。感染伤口的代表性图片(图36所示)和伤口愈合进程如图37所示，还测量了伤口面积。用gox@fe
x
sy/azm治疗的小鼠的伤口在12天后几乎消除了感染并愈合了伤口，而其他治疗则导致了不完全的恢复。fe
x
sy、azm@fe
x
sy和gox@fe
x
sy组对糖尿病创面有一定的治疗作用。此外，gox@fe
x
sy/azm治疗后，皮肤中的s.aureus的细菌数量显著减少(图37至图39)以及tnf-α和il-6等炎症因子显著降低(图40至图41)，进一步证明gox@fexsy/azm治疗伤口的细菌感染和炎症减少。
96.为了进一步研究伤口内的组织病理学变化，在第12天收集伤口，并切割切片进行h&e染色。如图42与图43所示，感染伤口中的表皮层仍然不完整。在感染伤口的伤口区域可以看到坏死细胞和大量苏木精阳性细胞。同时胶原沉积的定量测量显示，在gox@fe
x
sy/azm组中，有广泛的(黄色圆圈)和新的血管形成(黄色箭头)。然而，在gox@fe
x
sy/azm治疗组中，上皮化是完全的，伤口被一层完整的表皮覆盖。此外，与感染伤口相比，坏死细胞和苏木精阳性细胞的数量显著减少。同样，胶原沉积是伤口愈合的另一个重要因素，使用masson染色检测。显然，gox@fe
x
sy/azm组在14天的糖尿病创面区域胶原沉积密度最大。
97.之后进一步评估了治疗的安全性。我们将gox@fe
x
sy/azm涂抹于正常小鼠的皮肤上，发现gox@fe
x
sy/azm对正常的表皮没有明显的刺激性炎症反应。同时各组小鼠经过治疗后的组织学分析中没有明显的器官损伤或炎症病变(图44)。此外，血液生化和血液学检查没有显著变化(图45)。上述结果证明了gox@fe
x
sy/azm在体内的安全性和高生物相容性，显示了在未来临床应用中的巨大潜力。
98.综合上述实施例，利用仿生矿化策略将葡萄糖氧化酶(gox)固定于阿奇霉素(azm)杂化的fe
x
sy纳米颗粒中，命名为gox@fe
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sy/azm。该纳米粒可通过逆转高血糖微环境实现快速杀菌以及恢复巨噬细胞功能来加速糖尿病患者慢性伤口愈合进程。具体而言，在高血糖创面细菌感染初期，利用内源性高血糖，逆转适宜微生物生长的免疫抑制微环境和快速大量ros的积累，有效清除高血糖创面感染的细菌。在伤口愈合期，通过促进巨噬细胞向m2巨噬细胞的极化，介导恢复组织修复功能。在糖尿病患者皮肤感染病灶区，gox@fe
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sy/azm可催化内源性葡萄糖生成h2o2和葡萄糖醛酸，降低创面血糖浓度。与此同时，gox@fe
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sy/azm响应于创面的微酸环境进一步崩解质子化释放出fe
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、azm和h2s，通过芬顿反应fe
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将生成的
h2o2转化为对细菌高毒性的羟基自由基(
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oh)，与释放出来的azm共同作用，实现对细菌快速杀伤。值得注意的是，azm作为一种半衰期长的药物，其在伤口愈合后期还能发挥广谱的抗菌作用，有效避免伤口暴露所产生的二次感染。随后在细菌被杀灭后，gox@fe
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sy/azm释放出的h2s和azm进一步诱导巨噬细胞m2抗炎表型极化。m2巨噬细胞分泌丰富的再生相关细胞因子，逆转糖尿病创面感染模型的促炎微环境，促进感染皮肤的自修复功能。由于所得材料对酶的固定以及azm与fe
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间的配位作用，使得gox与fe
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被有效保护。其可在室温条件下长期保存而不变质，亦为gox@fe
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sy/azm介导感染创面的有序管理提供重要保障。体外抗菌实验和体内糖尿病小鼠皮肤感染实验结果表明，gox@fe
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sy/azm具有优异的抗感染能力和皮肤感染修复效果。该纳米粒实现了在复杂病理微环境下实现有序的生物学功能的调控，有望为研发复杂糖尿病感染创面疾病治疗提供一种全新的治疗。

技术特征：
1.一种仿生矿化纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：将葡萄糖氧化酶加入fecl2·
4h2o溶液中搅拌，再加入阿奇霉素乙醇溶液，继续搅拌，得到混合溶液；s2：在混合溶液中加入nas溶液进行反应，得到黑色沉淀物，清洗干燥后即获得纳米颗粒gox@fe
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/azm。2.根据权利要求1所述的仿生矿化纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶、fecl2·
4h2o溶液、阿奇霉素乙醇溶液、nas溶液的质量份数比为2:5:10:3。3.根据权利要求1所述的仿生矿化纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述s1中葡萄糖氧化酶加入fecl2·
4h2o溶液中搅拌3min，再加入阿奇霉素乙醇溶液4℃下搅拌3min。4.根据权利要求1所述的仿生矿化纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述s2中将黑色沉淀用煮沸后的去离子水清洗两次后冻干得到纳米颗粒gox@fe
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/azm。5.根据权利要求1至4任意一项所述方法制备的仿生矿化纳米颗粒gox@fe
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/azm在高血糖感染创面的有序治疗的药物中的应用。

技术总结
本发明属于抗细菌感染材料技术领域，具体涉及一种仿生矿化纳米颗粒的制备与应用，通过仿生矿化策略将葡萄糖氧化酶(GOx)固定于阿奇霉素(AZM)杂化的FexSy纳米颗粒中，得到纳米颗粒GOx@Fe


技术研发人员：宫腾 李艳丽 许川山 邓双飘 区凯欣 黄晓华
受保护的技术使用者：广州医科大学
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/10/19