基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测引物、试剂盒与方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测引物、试剂盒与方法。


背景技术：

2.副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)，原副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)，是乳酪杆菌属的一种乳酸菌，作为益生菌被人们广泛使用。乳酸菌能够产酸，调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡，一旦改变，可能会导致人体各类疾病发生，如尿路感染，已发现包括肠道和阴道在内的几个不同部位的微生物群在尿路感染的发生中起决定性作用。因此，乳酸菌对预防尿路感染有显着的帮助。然而，大量的使用乳酸菌会造成一些问题，虽然乳酸菌污染对人类健康不会产生严重威胁，但是乳酸菌会通过发酵产生乳酸、苹果酸、柠檬酸、丙酸、乙酸和短链脂肪酸等酸，严重影响食品的形态和风味，从而导致食物的保质期缩短和食物变质，尤其是在米面制品中，乳酸菌是造成其腐败的主要微生物。另外，乳酸菌耐药基因在微生物的种间转移会使其他的致病微生物产生耐药性。因此，食品中副干酪乳酪杆菌的检测是十分有必要的。
3.目前副干酪乳酪杆菌的检测方法主要有：传统培养法、免疫学检测法和分子生物学检测。传统培养法是最传统的微生物活菌检测方法，其主要依据是一个单细胞微生物可以在固体培养基上繁殖成长为一个单菌落。该检测手段通常需要稀释制样、增菌培养、分离等步骤。因此，该检测方法通常需要花费3-7天的时间，耗时长且操作繁琐，对操作人员的专业技术和培养环境的要求较高。免疫学检测法的原理是通过抗原和抗体的特异性结合对目标微生物进行检测，虽然其具有高度的特异性，但不可否认的是，免疫检测技术需要严格地进行抗原地筛选与纯化，昂贵的抗体制备也对该技术的发展产生了一定的限制。同时，在商品化检测中，复杂的样本环境容易导致检测结果的低灵敏度，从而影响检测结果的准确性。聚合酶链式反应(pcr)技术通过高温变性、低温退火及适温延伸三个步骤的反复变温循环过程实现在体外1～2h小时内复制大量的核酸片段。随后在pcr基础上又衍生出多重pcr(mpcr)、实时荧光定量pcr(qpcr)及巢式pcr等技术，目前已有文献报道了运用mpcr和qpcr技术检测副干酪乳酪杆菌。虽然pcr技术发展的相关技术具有灵敏度高、操作简单快速、特异性强和检测成本低等特点。但是目前该方法无法摆脱反应的热循环过程，需要复杂精准的变温设备。
4.交叉引物恒温扩增(crossing priming amplification,cpa)技术是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术，可以在不改变反应温度的情况下实现靶序列的快速扩增，检测周期约1小时，同时该技术检测成本低，操作简单，对操作人员的技能要求不高，可以完美地弥补现有检测技术的不足，为核酸检测的广泛应用创造了条件。cpa技术共有5条引物组成，包括1条交叉引物2a1s、2条特异引物2a和3a以及2条剥离引物4s和5a，5条引物在bst dna聚合酶的作用下进行链置换，实现dna的循环扩增。该技术的关键是需要在有限靶
序列中设计出五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响检测结果，因此高特异性引物的设计是研发的关键。
5.综上，开发一种基于交叉引物恒温扩增技术高效、便捷、灵敏的能够快速检测的副干酪乳酪杆菌phes基因的检测引物、试剂盒与方法具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于设计一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌phes基因检测引物，其灵敏度达到了5.2pg/μl，远高于现有的pcr检测技术。
7.本发明的另一目的在于提供一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌phes基因检测试剂盒。
8.本发明的再一目的在于提供一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌phes基因检测方法。该方法在检测迅速的同时具有超高的灵敏度和准确度，并且操作简便，特别适合现场检测。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.一组检测副干酪乳杆菌的cpa引物，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，其核苷酸序列分别如下所示：
11.靶点剥离引物4s：5
’‑
ggagccatccgttgaagt-3’(seq id no.1)；
12.靶点剥离引物5a：5
’‑
gtcaggaccaaggccaaa-3’(seq id no.2)；
13.靶点交叉引物2a1s：5
’‑
aatgttcgctgcccgtagcggttggattgaagtgtt-3’(seq idno.3)；
14.靶点特异引物2a：5
’‑
aatgttcgctgcccgtag-3’(seq id no.4)；
15.靶点特异引物3a：5
’‑
acattgggatgcaccatgcc-3’(seq id no.5)。
16.一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测试剂盒，包括上述检测副干酪乳杆菌的cpa引物。
17.所述试剂盒中，各检测引物的浓度优选为10μm；
18.所述的试剂盒还包括如下组分：
19.a、2
×
反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；
20.b、bst dna聚合酶；
21.c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
22.组分b中所述的bst dna聚合酶优选浓度为8u/μl的bst dna聚合酶水溶液。
23.组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
24.(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mm的氯化锰水溶液；
25.(ii)取25μl、50μm的钙黄绿素溶液与10μl、1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
26.一种根据上述试剂盒检测副干酪乳酪杆菌的非疾病诊断的实验研究方法，包括如下步骤：
27.(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并保证模板dna水溶液的od
260
/od
280
值
为1.8～2.0；
28.(2)建立检测phes基因的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应；
29.其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μl，10μm的剥离引物4s和10μm的剥离引物5a各1.5μl，10μm的交叉引物2a1s 2.5μl，10μm的特异引物2a和10μm的特异引物3a各1.25μl，dna模板1.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，加去核酸水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
30.(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如显色为黄色，说明待检样品中不含有副干酪乳酪杆菌；如显色为绿色，说明待检样品中含有副干酪乳酪杆菌。
31.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
32.(1)本发明通过选择目标菌株phes基因的特异性序列的保守区域，设计了具有高特异性的一套剥离引物、交叉引物和特异引物，建立了针对phes基因交叉引物恒温扩增的反应体系。该技术不需要任何的变温设备，扩增产物不需要进行凝胶电泳，直接根据肉眼观察反应体系颜色变化即可获得检测结果，操作便捷，检测成本低，有效实现对副干酪乳酪杆菌phes基因的检测，对缩短食品的副干酪乳酪杆菌检测时间具有重大意义，甚至可以实现食品中副干酪乳酪杆菌的现场检测。
33.(2)相较于普通pcr，本发明可以降低出现假阳性结果的概率，且在灵敏度方面具有显著优势，检测限可达5.2pg/μl水平，满足对副干酪乳酪杆菌污染食品风险的检测。
附图说明
34.图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测副干酪乳酪杆菌phes基因的凝胶电泳结果及显色结果图；其中，泳道m为dna marker，泳道(反应管)1为阳性对照，2为阴性对照。
35.图2为基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌phes基因检测特异性的实验结果图；其中，上图为凝胶电泳结果，下图为显色结果，泳道m为dna marker，泳道(反应管)1-18为副干酪乳酪杆菌l.pc，金黄色葡萄球atcc23235，金黄色葡萄球菌10071，大肠杆菌o157:h7 e019，大肠杆菌o157:h7 e020，大肠杆菌e043，大肠杆菌e044，大肠杆菌atcc43895，沙门氏菌atcc14028，沙门氏菌atcc13076，单增李斯特菌atcc19116，单增李斯特菌atcc19114，单增李斯特atcc19115，单增李斯特菌atcc15313，单增李斯特菌atcc19113，铜绿假单胞atcc27853，副溶血性弧菌atcc17802，副溶血性弧菌atcc27969，19-阴性对照。
36.图3为检测副干酪乳酪杆菌phes基因灵敏度实验结果图；其中，图a为交叉恒温扩增反应检测副干酪乳酪杆菌phes基因的灵敏度试验的电泳结果图，泳道1为52ng/μl，泳道2为5.2ng/μl，泳道3为520pg/μl，泳道4为52pg/μl，泳道5为5.2pg/μl，泳道6为520fg/μl，泳道7为阴性对照，图b为显色结果图，管1-6分别代表dna模板浓度为52ng/μl，5.2ng/μl，520pg/μl，52pg/μl，5.2pg/μl，520fg/μl，7为阴性对照。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明，本发明采用的试剂和设备为本技术领域常规试剂和设备。除非特别说明，本发明所用菌株、试剂等均可通过市售获得。
38.本发明中的大肠杆菌e019，大肠杆菌e020，大肠杆菌e043和大肠杆菌e044可参考文献(周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌vbnc状态的诱导及毒素表达量的影响研究[d].华南理工大学,2015.)获得。
[0039]
实施例1
[0040]
一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测引物设计方法，具体步骤如下：
[0041]
(1)在genbank上搜索副干酪乳酪杆菌的全部基因组序列，总共369个，搜索并获得检测靶点phes的基因序列，确保全部副干酪乳酪杆菌均携带phes基因；
[0042]
(2)在genbank上搜索副干酪乳酪杆菌phes基因序列，有617条，用多序列比对软件进行alignment分析，通过不同序列间进行多重比对，获得最高保守度的区域序列；
[0043]
(3)进一步应用primer premier等软件对所获得的区域序列进行分析，同时结合该序列所使用的测序平台与方法，进行综合容错度分析，例如sanger测序方法存在前20-30和后20-30个碱基序列可信度较低，可通过两端测通等方式进行排除；例如pacbio测序则存在碱基错对现象，可通过illumina或sanger测序等进行校对；通过以上综合分析，可进一步对序列容错度进行精确判断，从而获得phes中的高保守区域序列，用于后续引物设计。
[0044]
获得的保守区域核苷酸序列如下：
[0045]
gcaagagactttttacattaccaatgagttactcatgcgctcgcagac
[0046]
aagtccaatgcaggcgcggacaatggaaaagcacgactttaccaaagga
[0047]
ccgctgaaaatgattagccctggggtggtttatcgacgtgatgacgacgat
[0048]
gctactcatagccatcagtttcaccagatggaaggactcgtcattgacaag
[0049]
catataaccatggctgatctaaagggaaccttgttggccatgtgccaacacgtttttggtaaagatcggacaattcgcttgcggccaagttattttccatttacggagccatccgttgaagttgatgtttcctgttttcgttgcggcggtaaaggttgcccggtttgcaaatataccggttggattgaagtgttagg
[0050]
(4)根据交叉引物恒温扩增(cpa)的扩增反应原理，使用primer premier软件针对靶点phes保守区域设计引物了3套引物，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下表所示：
[0051]
引物名称序列(5
’‑3’
)4s-phes-1ggagccatccgttgaagt5a-phes-1gtcaggaccaaggccaaa2a1s-phes-1aatgttcgctgcccgtagcggttggattgaagtgtt2a-phes-1aatgttcgctgcccgtag3a-phes-1acattgggatgcaccatgcc4s-phes-2cgcttgcggccaagttat5a-phes-2cgctgcccgtagcacatt2a1s-phes-2ggatttcgtacaacactgttttcggcaaatacagag2a-phes-2ggatttcgtacaacactg3a-phes-2gatctcagtgggcgttct
4s-phes-3tcgcatagtggaacctca5a-phes-3aggcaggacgctactcaa2a1s-phes-3aacatcttcagcagtcatatacagaggggatttcgt2a-phes-3aacatcttcagcagtcat3a-phes-3cactggatgatctcagtggg
[0052]
表1根据phes基因保守区域设计得到的cpa引物
[0053]
(5)利用genbank数据库blast功能中的primer-blast工具，对所设计的外引物进行序列比对。其中，编号2和3的外引物特异性较差，这将大大增加检测结果假阳性的风险，不予考虑，最终选择特异性好的编号为1的引物作为本技术引物。
[0054]
实施例2
[0055]
一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测方法，包括以下步骤：
[0056]
(1)所需试剂：
[0057]
a.浓度均为10μm的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如实施例1中seq id no.1～5所示；
[0058]
b.配制2
×
反应储液：
[0059]
①
20
×
反应储液：含0.2m的氯化钾，0.2m的硫酸铵，160mm的硫酸镁及2％(v/v)tween 20(均为终浓度，用去核酸水配制)；
[0060]
②2×
反应储液：100μl 20
×
反应储液，500μl 3.2m甜菜碱，280μl 10mm dntps，27μl 1.5m tris-hcl，93μl去核酸水；
[0061]
c.浓度为8u/μl的bst dna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；
[0062]
d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配制浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)，然后取25μl浓度为50μm的钙黄绿素溶液与10μl 1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素与氯化锰溶液的物质的量浓度比为1:8)。
[0063]
(2)提取待检样品的dna作为模板dna：
[0064]
本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中，实验组加入副干酪乳酪杆菌dna作为模板，以去核酸水作为空白对照。
[0065]
采用细菌基因组dna快速提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司，货号n1152)提取细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od
260
/od
280
的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
[0066]
(3)建立检测phes靶点的交叉引物恒温扩增反应：
[0067]
在反应管中配制总体积为26μl的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2
×
反应储液12.5μl，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μl，交叉引物2a1s 2.5μl，特异引物2a与3a等体积混合液2.5μl，bst dna聚合酶1μl，dna模板1.0μl，用去核酸水补充体积至25μl；最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris-hcl 20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps1.4mm，bst dna聚合酶8u，剥离引物4s、5a各0.6μm，交叉引物2a1s 1.0μm，特异引物2a及3a各0.5μm。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
[0068]
(4)显色检测：
[0069]
待反应结束后，用肉眼观察反应体系的颜色变化。
[0070]
结果如图1所示，结果显示：phes靶点对应的实验组(见图1b中的左管)的颜色变为绿色，说明是含副干酪乳酪杆菌phes基因的，而空白对照组不含副干酪乳酪杆菌phes基因，该反应管(见图1b中的右管)不变色仍为橙黄色；随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，实验组呈现梯形条带，空白对照组无扩增条带，与预期结果一致(图1a)。
[0071]
实施例3
[0072]
基于交叉恒温扩增反应(cpa)检测副干酪乳酪杆菌特异性试验，包括以下步骤：
[0073]
将副干酪乳酪杆菌的基因组dna和其他菌株的基因组dna按照实施例2中的反应体系和条件建立交叉引物恒温扩增反应检测方法，进行特异性试验；其中非副干酪乳酪杆菌分别为：金黄色葡萄球atcc23235，金黄色葡萄球菌10071，大肠杆菌o157:h7 e019，大肠杆菌o157:h7 e020，大肠杆菌e043，大肠杆菌e044，大肠杆菌atcc43895，沙门氏菌atcc14028，沙门氏菌atcc13076，单增李斯特菌atcc19116，单增李斯特菌atcc19114，单增李斯特atcc19115，单增李斯特菌atcc15313，单增李斯特菌atcc19113，铜绿假单胞atcc27853，副溶血性弧菌atcc17802，副溶血性弧菌atcc27969。副干酪乳酪杆菌l.pc购自广州肽谷科技有限公司。
[0074]
设置副干酪乳酪杆菌的基因组为阳性对照，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
[0075]
结果表明：只有副干酪乳酪杆菌出现梯形条带(泳道1)，非副干酪乳酪杆菌则无。如此表明，基于交叉引物恒温扩增反应检测副干酪乳酪杆菌phes基因的引物具有较好的特异性。
[0076]
实施例4
[0077]
交叉恒温扩增反应(cpa)检测副干酪乳酪杆菌phes基因的灵敏度对比试验，包括以下步骤：
[0078]
将副干酪乳酪杆菌的基因组dna进行10倍浓度梯度稀释，分别为52ng/μl，5.2ng/μl，520pg/μl，52pg/μl，5.2pg/μl，520fg/μl。同时设置阴性对照(去核酸水)，按照实施例2中的反应体系构建交叉恒温扩增方法并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定该检测方法的灵敏度。
[0079]
电泳结果如图3a所示，结果表明：建立的针对副干酪乳酪杆菌phes靶点的交叉引物恒温扩增反应方法可检测样品中dna浓度为5.2pg/μl的副干酪乳酪杆菌。
[0080]
结论：
[0081]
从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法相较于现有的检测方法具有如下优点：
[0082]
快速、简便：通过交叉引物恒温扩增反应对目标序列快速进行扩增，在1h内就能获得检测结果，反应过程不需要进行变温，大大降低了对加热设备的要求，简化了操作过程，检测结果可直接由反应体系最终颜色读出，简单明了。
[0083]
特异性强：由于该反应的引物较多，选择的靶基因phes又是特异性较强的管家基因，所以该方法检测副干酪乳酪杆菌具有极高的特异性。
[0084]
灵敏度高:针对副干酪乳酪杆菌phes基因的检测限为5.2pg/μl，是常规pcr的100倍左右，具有极高的灵敏度。
[0085]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一组检测副干酪乳杆菌的cpa引物，其特征在于包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，其核苷酸序列分别如下所示：靶点剥离引物4s：5
’‑
ggagccatccgttgaagt-3’(seq id no.1)；靶点剥离引物5a：5
’‑
gtcaggaccaaggccaaa-3’(seq id no.2)；靶点交叉引物2a1s：5
’‑
aatgttcgctgcccgtagcggttggattgaagtgtt-3’(seq id no.3)；靶点特异引物2a：5
’‑
aatgttcgctgcccgtag-3’(seq id no.4)；靶点特异引物3a：5
’‑
acattgggatgcaccatgcc-3’(seq id no.5)。2.一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测试剂盒，其特征在于包括上述检测副干酪乳杆菌的cpa引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的各检测引物的浓度优选为10μm。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括如下组分：a、2
×
反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；b、bst dna聚合酶；c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：组分b中所述的bst dna聚合酶优选浓度为8u/μl的bst dna聚合酶水溶液。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl、50μm的钙黄绿素溶液与10μl、1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。7.一种根据权利要求2～6任一所述的试剂盒检测副干酪乳酪杆菌的非疾病诊断的实验研究方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并保证模板dna水溶液的od
260
/od
280
值为1.8～2.0；(2)建立检测phes基因的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应；(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如显色为黄色，说明待检样品中不含有副干酪乳酪杆菌；如显色为绿色，说明待检样品中含有副干酪乳酪杆菌。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的交叉引物恒温扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μl，10μm的剥离引物4s和10μm的剥离引物5a各1.5μl，10μm的交叉引物2a1s 2.5μl，10μm的特异引物2a和10μm的特异引物3a各1.25μl，dna模板1.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，加去核酸水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。

技术总结
本发明提供了一种基于交叉引物恒温扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测引物、试剂盒与方法。通过选择目标菌株pheS基因的特异性序列的保守区域，设计了具有高特异性的一套剥离引物、交叉引物和特异引物，建立了针对pheS基因交叉引物恒温扩增的反应体系。该技术不需要任何的变温设备，扩增产物不需要进行凝胶电泳，直接根据肉眼观察反应体系颜色变化即可获得检测结果，操作便捷，检测成本低，有效实现对副干酪乳酪杆菌pheS基因的检测，对缩短食品的副干酪乳酪杆菌检测时间具有重大意义，甚至可以实现食品中副干酪乳酪杆菌的现场检测。实现食品中副干酪乳酪杆菌的现场检测。实现食品中副干酪乳酪杆菌的现场检测。


技术研发人员：刘君彦 徐振波 詹淑丽 李雪杰 薛皓月 刘功良 屈春云 苏佳倩 彭凯晴
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/19