小分子多肽Elabela在糖尿病溃疡创面愈合中的应用

小分子多肽elabela在糖尿病溃疡创面愈合中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及小分子多肽elabela在糖尿病溃疡创面愈合中的应用。


背景技术：

2.根据who数据，糖尿病患病率在过去40年里增长4倍，已成为最常见的慢性病之一。全球15％的糖尿病患者会出现足部并发症，是截肢乃至死亡的重要原因。持续炎症微环境损伤血管内皮细胞导致内皮细胞通过血管生成过程恢复再生微血管的能力降低是糖尿病足伤口难以愈合的关键原因之一。内皮功能障碍的发生先于糖尿病相关的微血管、大血管并发症。elabela(ela)是近年来发现的被推断为血管紧张素同源受体apj的第二大内源性配体，其自发现其具有强大的促血管生成效应，可通过多种途径促进内皮发育和血管新生。


技术实现要素：

3.本发明第一方面的目的，在于提供elabela在制备促进糖尿病溃疡创面愈合的药物中的应用。
4.本发明第二方面的目的，在于提供elabela在提高细胞迁移能力和/或制备提高细胞迁移能力的药物中的应用。
5.本发明第三方面的目的，在于提供elabela在提高细胞血管形成能力和/或制备提高细胞血管形成能力的药物中的应用。
6.本发明第四方面的目的，在于提供一种非诊断或治疗目的的提高细胞迁移能力的方法。
7.本发明第五方面的目的，在于提供一种非诊断或治疗目的的提高细胞血管形成能力的方法。
8.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
9.本发明第一个方面，在于提供elabela在制备促进糖尿病溃疡创面愈合的药物中的应用。
10.优选地，所述药物为降低炎症因子表达水平的药物。
11.优选地，所述炎症因子包括il-6和/或tnf-α。
12.优选地，所述药物为提高细胞迁移能力的药物；进一步所述细胞为内皮细胞。
13.优选地，所述药物为提高细胞血管形成能力的药物。
14.优选地，所述药物为提高内皮细胞的小管形成能力的药物。
15.优选地，所述药物为降低dna损伤产物8-ohdg的表达水平的药物。
16.优选地，所述药物包括片剂、囊剂、粒剂、滴丸剂、乳剂、液剂、贴剂、膏剂和注射剂。
17.优选地，所述药物中elabela的有效剂量为3～10μg/g；进一步为5～8μg/g。
18.本发明第二个方面，在于提供elabela在提高细胞迁移能力和/或制备提高细胞迁移能力的药物中的应用。
19.优选地，所述细胞包括内皮细胞。
20.优选地，所述elabela的浓度为3～10μmol/l；进一步为5～8μmol/l。
21.本发明第三个方面，在于提供elabela在提高细胞血管形成能力和/或制备提高细胞血管形成能力的药物中的应用。
22.优选地，所述细胞包括内皮细胞。
23.优选地，所述elabela的有效剂量为3～10μmol/l；进一步为5～8μmol/l。
24.本发明第四个方面，在于提供一种非诊断或治疗目的的提高细胞迁移能力的方法，将细胞与elabela接触，所述细胞为内皮细胞。
25.优选地，所述elabela的有效剂量为3～10μmol/l；进一步为5～8μmol/l。
26.优选地，所述细胞为人脐静脉内皮细胞。
27.本发明第五个方面，在于提供一种非诊断或治疗目的的提高细胞血管形成能力的方法，将细胞与elabela接触，所述细胞为内皮细胞。
28.优选地，所述elabela的有效剂量为3～10μmol/l；进一步为5～8μmol/l。
29.优选地，所述细胞为人脐静脉内皮细胞。
30.本发明的有益效果是：
31.本发明通过体内实验(小鼠构建的全层皮肤缺损模型)和体外实验证明了elabela在糖尿病伤口愈合中的积极作用，具体的，elabela明显促进了糖尿病小鼠的伤口愈合，降低炎症因子(il-6、tnf-α)和dna损伤产物8-ohdg的表达，减少了炎性渗出，同时还可提高内皮细胞的迁移能力以及促进内皮细胞的小管形成，为糖尿病溃疡创面的治疗提供候选药物。
附图说明
32.图1为动物建模流程示意图。
33.图2为elabela对糖尿病溃疡创面愈合的验证实验结果；其中，a为糖尿病小鼠(db/db)、对照鼠(db/m)的伤口局部定点拍摄图片及伤口愈合面积分析(n＝5)；b为小鼠血清中的炎症因子(il-6、tnf-α和8-ohdg)的表达水平；c为划痕愈合实验同一部位的0h和24h的拍摄照片及面积分析；d为transwell实验下室细胞结晶紫染色代表图片及细胞数目分析；e为内皮细胞的体外血管形成实验及成管数分析，图中，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.005，****代表p＜0.001。
具体实施方式
34.现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
35.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
36.本发明的实验数据均为从三个独立的重复实验中获得的平均值
±
标准差，使用graphpad prism 9.0分析数据，通过正态性检验确认正态分布，student’s-t检验用于两组之间数据的比较。多于两组的比较通过tukey检验和one-way anova方差分析进行检查，p值《0.05被认为具有统计学差异。
37.本发明所使用的elabela，购买自吉尔生化公司(上海)，#585575。
38.实施例1elabela促进糖尿病小鼠伤口愈合的体内实验
39.首先构建糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型：db/m小鼠共5只(9周，20～30g，雄性)，db/db小鼠10只(9周，45～55g，雄性)购自深圳市拓普生物科技有限公司(中国深圳)。动物实验是按照实验动物的护理和使用指南进行的。本方案已获得中山大学附属第八医院伦理委员会批准(no.2022-051-01)。小鼠经适应性喂养一周后，用于构建全层皮肤缺损模型。1％戊巴比妥麻醉小鼠，去除皮肤表面的毛发，在小鼠背部中央做一个1.0cm的圆形切口。采用无菌纱布包扎伤口，每只小鼠单独圈养。
40.干预：db/db小鼠被随机分配到造模对照组(db/db)和造模加药组(db/db+ela)组，每组五只小鼠。db/m小鼠作为对照组。如动物建模流程示意图(图1)所示，造模加药组(db/db+ela)于第1、3、5、7、9、11、13天接受皮下创缘周围多点注射给药，剂量为5μg/g/d，对照组(db/m)和造模对照(db/db)组接受相同剂量的pbs溶液注射。在指定时间点对伤口进行拍照以记录愈合进程，电子天平称量记录小鼠体重数据，血糖仪检测记录小鼠血糖值。第21天，切取伤口边缘0.1cm全层皮肤组织，-80℃保存。
41.如图2中a所示，对照db/m非糖尿病小鼠伤口于第14天基本完全愈合，而db/db组小鼠伤口周围渗出物多，第21天仍有明显未愈合区域，而造模加药组的伤口愈合整体速度明显快于db/db组，如折线图所示，在第21天，伤口愈合基本达到100％，以上实验表明，elabela能够促进糖尿病小鼠的伤口愈合。
42.进一步通过elisa的方法检测给药第21天的小鼠血清中的炎症因子(il-6、tnf-α)以及dna损伤产物8-ohdg的表达，从图2中b可以看出，对照组的炎症因子以及dna损伤产物8-ohdg水平最低，而相对于糖尿病小鼠，造模加药组的炎症因子和8-ohdg水平显著降低，存在显著差异(p《0.05)。
43.实施例2人脐静脉内皮细胞的伤口愈合、迁移实验
44.细胞预处理：原代人脐静脉内皮细胞(huvecs)购自icell bioscience(中国上海)，培养在含5.5mmol/l葡萄糖(sciencell，美国)的ecm培养基中，在5％ co2、37℃的培养箱中生长。细胞传代，第二至第七代用于实验。随机将huvecs平均分为3组，空白组(bl)、高糖加药组(hg+ela)和高糖组(hg)。将空白组(bl)细胞在5.5mmol/l葡萄糖的ecm培养基中生长，hg组和ela组细胞则在30mmol/l葡萄糖(sigma，日本)的ecm培养基中生长，并用elabela(终浓度为5μm)处理细胞48h，备用。
45.伤口愈合实验：每个铺板孔中加入1
×
106个经过不同预处理后的细胞。直到细胞密度达到90％时，用10μl移液器吸头制作伤口。用pbs去除漂浮细胞后，将细胞置于1％血清培养基中生长。使用倒置显微镜分别在0小时和24小时记录伤口。使用image j分析伤口面积。计算伤口闭合率：伤口闭合(％)＝[(area0 h
–
area24 h)/area0 h]
×
100％。
[0046]
结果如图2中c所示，24小时的高糖(hg)组内皮细胞划痕愈合率约为17.5％，远远低于高糖加药组的22.75％，提示高糖显著抑制了内皮细胞的划痕愈合能力，可以部分被elabela逆转。
[0047]
细胞迁移实验：采用孔径为8.0μm的24孔板(美国康宁公司)的transwell小室。将5
×
105个悬浮于1％血清培养基的细胞置于上室中，24小时后去除上清液。在室温下用4％多聚甲醛清洗和固定小室，然后用0.1％结晶紫溶液染色20分钟。然后用棉签轻轻擦拭上室细胞。拍摄了三个随机选择且不重叠的区域。使用image j计算下室细胞以进行统计分析。
[0048]
结果如图2中d所示，与对照组相比，高糖(hg)培养细胞48h，下室的内皮细胞数量显著减少，而hg+ela组的细胞数量显著多于高糖组，提示内皮细胞的迁移能力部分被elabela逆转。
[0049]
血管形成实验：matrigel(corning，usa)用于评估huvec的血管生成。实验试剂和耗材在4℃下预冷。基质胶用pbs稀释(基质胶:pbs＝1:1)，然后每孔加入50μl稀释混合物至96孔板。孵育1小时后，每孔铺2
×
104个不同预处理的细胞。孵育6小时后，使用倒置显微镜(olympus，japan)拍摄内皮细胞的管形成。使用imagej以及管的长度对总数进行量化。数据为从三个独立的重复实验结果。多组的比较通过tukey检验和one-way anova方差分析进行检查。p值《0.05被认为具有统计学意义。
[0050]
结果如图2中e所示，在第6小时对于小管进行固定，拍照，结果显示对照组内皮细胞可以形成广泛、密集的大小管型，而hg组几乎没有大管型，小管管型罕见，而elabela给药外源性的恢复了部分内皮细胞的小管形成能力，统计学计数具有显著统计学意义(p《0.05)。
[0051]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.elabela在制备促进糖尿病溃疡创面愈合的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为降低炎症因子表达水平的药物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括il-6和/或tnf-α。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为提高细胞迁移能力的药物。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为提高细胞血管形成能力的药物。6.elabela在提高细胞迁移能力和/或制备提高细胞迁移能力的药物中的应用。7.elabela在提高细胞血管形成能力和/或制备提高细胞血管形成能力的药物中的应用。8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述细胞包括内皮细胞。9.一种非诊断或治疗目的的提高细胞迁移能力的方法，其特征在于，将细胞与elabela接触，所述细胞为内皮细胞。10.一种非诊断或治疗目的的提高细胞血管形成能力的方法，其特征在于，将细胞与elabela接触，所述细胞为内皮细胞。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，公开了小分子多肽Elabela在糖尿病溃疡创面愈合中的应用，具体公开了Elabela在制备促进糖尿病溃疡创面愈合的药物中的应用。本发明通过体内实验(小鼠构建的全层皮肤缺损模型)和体外实验证明了Elabela在糖尿病伤口愈合中的积极作用，具体的，Elabela明显促进了糖尿病小鼠的伤口愈合，降低炎症因子(IL-6、TNF-α)和DNA损伤产物8-OHdG的表达，减少了炎性渗出，同时还可提高内皮细胞的迁移能力以及促进内皮细胞的小管形成，为糖尿病溃疡创面的治疗提供候选药物。物。


技术研发人员：王彤 洪莹晖 陈旭翔 吴海东 段晓莹
受保护的技术使用者：中山大学附属第八医院（深圳福田）
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/19