一种用于预防刚地弓形虫感染的纳米材料多表位疫苗及其制备方法和应用

1.本发明属于生物兽药技术领域，尤其涉及一种用于预防刚地弓形虫感染的纳米材料多表位疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.刚地弓形虫又名弓形虫(toxoplasma gondii)，隶属于真球虫目，是一种常见的细胞内寄生虫。刚地弓形虫宿主广泛，几乎能够感染包括人在内所有的温血脊椎动物，如猪、牛、马、啮齿动物等，给人类及家畜造成巨大的经济损失。弓形虫感染包括通过先天性感染和后天性感染，其感染阶段可分为三个时期：速殖子阶段，缓殖子阶段和子孢子阶段。其疫苗的研制对于先天性感染的阻断及获得性感染的预防，均具有重要的意义。
3.随着免疫学的发展，利用具有保守性高和免疫原性强的弓形虫抗原表位来研制弓形虫疫苗，己成为开发弓形虫疫苗的新思路。目前，学者们鉴定出了多种在弓形虫生活史不同时期中稳定表达的蛋白。其中，tgsag1稳定表达于速殖子时期，对宿主细胞的粘附和侵袭过程至关重要，是一种重要的弓形虫表面抗原。2006年heber等人鉴定其优势抗原表位序列为tgsag1(238-256)。tggra7在速殖子和缓殖子感染阶段均有表达，能刺激宿主产生强烈的细胞免疫和体液免疫，是良好的疫苗候选抗原。2012年cong等人发现tggra7(20-28)作为cd8+t细胞表位，可以显著激发小鼠提高机体内tnf-γ含量，并降低小鼠脑包囊的数量。tgmic3表达于弓形虫感染的各个阶段，免疫宿主后能产生持久的免疫保护力，是mic家族中最常用的疫苗候选抗原。但目前还没有关于tgmic3优势抗原表位的报道。as15肽是grover等人发现的一种弓形虫cd4+t细胞表位，可发挥重要的免疫调节作用，保护动物免受部分弓形虫感染。然而，现有的多表位疫苗通常免疫原性较低，因此在引发保护性免疫方面效果较差。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于预防弓形虫感染的纳米材料多表位肽疫苗，该疫苗能够安全有效抵抗弓形虫的急性感染，从而控制弓形虫的传播。
5.本发明的另一目的是提供一种以profilin蛋白为tlr配体的plga纳米颗粒的共递送体系，该体系可作为预防啮齿动物、猪、马感染药物的载体，从而实现药物的高效递送，并提高机体的免疫应答能力。
6.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
7.一方面，本技术提供了一种用于预防刚地弓形虫感染的疫苗，所述疫苗包括：质量比为(1:10)～(10:1)的聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白；
8.所述重组多表位肽的优势抗原表位包含sag1
(238-256)
、mic3
(109-128)
、gra7
(20-28)
、mic3
(27-35)
、as15肽、mic3
(368-381)
中的任意两种或多种。
9.在一种实施方式中，所述多表位肽采用将优势抗原表位以sag1
(238-256)
、mic3
(109-128)
、gra7
(20-28)
、mic3
(27-35)
、as15肽、mic3
(368-381)
的顺序通过柔性连接肽连接获得。
10.在一种实施方式中，所述柔性连接肽为sapgtp。
11.在一种实施方式中，所述聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的质量比为(1:5)～(5:1)，优选(1:3)～(3:1)，更优选1:1。
12.在一种实施方式中，所述疫苗的注射剂量为20μg，其中聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的剂量为10μg：10μg。
13.可选的，本技术中的聚乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，plga)可选用市售商品，例如乳酸和羟基乙酸的质量比例为50％：50％规格的plga。
14.在一种实施方式中，所述聚乳酸乙醇酸共聚物与所述多表位肽或所述profilin蛋白的包被比例为100:(0.1～1)，优选为100:0.5。
15.在一种实施方式中，聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和/或聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的粒径为300～1500nm，优选为500～1000nm。
16.另一方面，本技术提供了一种上述用于预防刚地弓形虫感染的疫苗的制备方法，包括：
17.步骤1)、分别制备聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的冻干粉；
18.步骤2)、按质量比例混合复配即得。
19.在一种实施方式中，所述步骤1)中聚乳酸乙醇酸共聚物包被的重组多表位肽或乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的制备方法如下：
20.步骤a)、将聚乳酸乙醇酸共聚物溶于油性溶剂中，加入表面活性剂，作为油相，向油相中加入多表位肽或profilin蛋白；
21.步骤b)、配制聚乙烯醇的水溶液作为水相，将步骤a)获得的油相和水相混合，形成初乳；
22.步骤c)、将步骤b)获得的初乳加入至聚乙烯醇的水溶液中，获得复乳；
23.步骤d)、去除所述复乳中的溶剂，离心获得沉淀，洗涤干燥获得冻干粉。
24.在一种实施方式中，所述步骤a)中聚乳酸乙醇酸共聚物和所述多表位肽或所述profilin蛋白的质量比为100:(0.1～1)；和/或，
25.所述步骤b)中的聚乙烯醇的水溶液的质量浓度为0.1％～1％，所述步骤c)中的聚乙烯醇的水溶液的质量浓度为4％～8％；和/或，
26.所述步骤b)中采用超声法制备初乳，参数为：180w，20％功率，1s超声，1s间隔，共5min；和/或，
27.所述步骤c)中采用超声法制备复乳，参数为：180w，50％功率，1s超声，1s间隔，共20min。
28.优选的，所述的plga纳米颗粒包被的多表位肽或profilin蛋白采用以下方法制备获得：
29.分别配制0.5％、2％聚乙烯醇溶液，取100mg的plga溶于10ml二氯甲烷，加入司盘-80至浓度为0.8％，作为油相。取500μl 1mg/ml多表位肽或profilin蛋白的蛋白液加入油相中。将上述油相和水相充分混合，超声破碎，形成初乳；将初乳逐滴滴加到50ml 2％聚乙烯
醇中，再次于冰上超声破碎，得到复乳。挥发去除复乳中的有机溶剂，高速离心分离沉淀，将成品在30ml超纯水中洗涤5次。减压干燥后即可得plga纳米粒冻干粉。
30.在一种实施方式中，所述多表位肽或所述profilin蛋白采用以下方法制备获得：
31.将编码所述多表位肽或所述profilin蛋白的基因导入载体中获得重组载体，将所述重组载体转化至底盘菌株中获得重组菌株，培养所述重组菌株诱导其表达所述多表位肽或所述profilin蛋白，收集所述多表位肽或所述profilin蛋白并纯化。
32.优选的，所述载体可以是现有技术中的常规载体，优选为质粒；所述底盘菌株可以是现有技术中的常用底盘菌株，优选为大肠杆菌。
33.优选的，所述的多表位肽采用以下方法制备获得：
34.将优势抗原表位按照sag1
(238-256)
、mic3
(109-128)
、gra7
(20-28)
、mic3
(27-35)
、as15肽、mic3
(368-381)
的顺序连接起来，多基因片段之间通过柔性连接肽“sapgtp”连接各抗原表位。由生物公司合成目的基因，并将其连接在pet-28a(+)载体上，获得能够表达所述多表位肽的重组质粒。将能够表达多表位肽的重组质粒转化到bl21大肠杆菌中，在含有氨苄抗性的lb液体培养基中扩大培养，加入iptg至终浓度为0.8mmol/l，诱导表达多表位肽。离心收集菌体，低温超声破碎，经0.22μm的滤器过滤后再通过ni亲和层析柱，用不同梯度咪唑洗涤。收集洗脱液，经sds-page检测纯化效果。纯化后的多表位肽经过透析，采用western blot方法检测蛋白活性。
35.优选的，所述的profilin蛋白采用以下方法制备获得：
36.由生物公司合成目的基因，并将其连接在pet-28a(+)载体上，获得能够表达profilin蛋白的重组质粒。将能够表达profilin蛋白的重组质粒转化到bl21大肠杆菌中，在含有氨苄抗性的lb液体培养基中扩大培养，加入iptg至终浓度为0.8mmol/l，诱导表达重组profilin蛋白。离心收集菌体，低温超声破碎，经0.22μm的滤器过滤后再通过ni亲和层析柱，使用不同梯度咪唑洗涤。收集洗脱液，经sds-page检测纯化效果。纯化后的多表位肽经过透析，采用western blot方法检测蛋白活性。
37.另一方面，本技术提供了所述疫苗在制备用于预防刚地弓形虫感染的生物制品中的应用。
38.为了提高多表位肽的免疫保护效果，本发明利用聚乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，plga)纳米佐剂包封多表位肽和一种tlr11配体(profilin蛋白)。本发明基于多表位肽疫苗，由于其直接利用多种抗原优势表位制备，因此具有化学稳定性强、无致癌潜力的优势，是减毒活疫苗的安全替代品；可通过生物信息学工具模拟，实现疫苗制备的高效性。
39.本技术提供的疫苗，plga纳米颗粒可保护抗原免受酶降解，延长其体循环时间并增加向免疫细胞呈递的可能性。profilin蛋白是弓形虫体内的一种肌动蛋白调制器，参与弓形虫的滑行运动。同时，profilin也是一种tlr11配体，可以与巨噬细胞和抗原呈递细胞上的tlr11结合，产生具有感染效应的il-6和il-12，进而触发体内ifn-γ的产生。由于啮齿动物、猪、马中均可表达编码tlr11的功能基因，因此profilin蛋白作为免疫调节剂具有广泛的应用前景。此外，有研究表明，抗原与tlr配体通过plga纳米颗粒的共递送可导致树突状细胞(dc)的选择性刺激以产生自然杀伤(nk)细胞活化细胞因子。可以推测，将多表位肽与tlr11配体profilin蛋白通过plga纳米颗粒递送也可选择性增强免疫保护效果。因此，基
于plga纳米递送体系和profilin蛋白构建的新型多表位肽纳米疫苗，可提高多表位肽免疫保护力，有效解决多表位肽免疫原性低的问题，对于限制弓形虫在啮齿动物、猪、马等动物中传播具有重要意义。
40.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
41.(1)目前利用plga纳米材料共递送profilin蛋白和多表位肽疫苗，多数对刚地弓形虫的防控效果较差，本发明填补了plga纳米材料用于刚地弓形虫多表位肽疫苗研究的空白。
42.(2)tgsag1、tggra7、tgmic3是刚地弓形虫重要的抗原蛋白，基因保守，在速殖子阶段、缓殖子阶段和子孢子阶段均可以稳定表达。本发明串联tgsag1、tggra7、tgmic3的优势抗原表位，构建抗弓形虫新型多表位肽，并进行人工重组制备。
43.(3)本发明对报道的plga纳米材料的包被工艺进行了改进，制备了粒径为500-1000nm的纳米颗粒。
44.(4)profilin蛋白是刚地弓形虫的重要组成部分，可以发挥免疫调节作用。本发明将profilin蛋白作为一种免疫调节剂进行人工重组制备，由plga纳米材料包封，用于提高多表位肽疫苗免疫保护效果。
45.(5)本技术中用于预防刚地弓形虫plga纳米材料包封的profilin蛋白可用于制备预防啮齿动物、猪、马感染的药物的载体。
46.(6)本技术中所述的用于预防刚地弓形虫plga纳米材料共递送profilin蛋白和多表位肽疫苗可用于慢性、急性及先天性刚地弓形虫感染的免疫保护。
附图说明
47.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
48.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
49.图1为为多表位肽构建示意图；
50.图2为多表位肽的三级结构示意图；
51.图3为多表位肽与h-2-dd分子对接与验证示意图，图中，a、mep和h-2-dd分子对接示意图；b、general为多表位肽总体拉氏图，gly为甘氨酸拉氏图，pre-pro为脯氨酸前残基拉式图，pro为脯氨酸拉式图；
52.图4为pet-28a(+)-mep的诱导表达示意图，图中，m、蛋白marker；1-4、诱导后0、2、4、6h蛋白表达水平；5、超裂后上清；6、超裂后沉淀；
53.图5为pet-28a(+)-mep重组蛋白的纯化示意图，图中，m、蛋白marker；1-2、挂柱前后的pet-28a(+)-mep蛋白；3-4、60mmol/l咪唑洗脱液；5-6、80mmol/l咪唑洗脱液；7-8、120mmol/l咪唑洗脱液；9-14、250mmol/l咪唑洗脱液；
54.图6为western-blot检测pet-28a(+)-mep重组蛋白表达示意图，图中，m、蛋白marker；mep、pet-28a(+)-mep；
55.图7为小鼠免疫rmep或cfa-rmep前后抗体水平的变化示意图；
56.图8为小鼠免疫rmep或cfa-rmep前后脾淋巴细胞增殖水平的变化示意图；
57.图9为小鼠免疫rmep或cfa-rmep前后相关细胞因子水平变化示意图；
58.图10为plga纳米颗粒的表征示意图；
59.图11为小鼠免疫纳米颗粒疫苗前后抗体水平变化示意图；
60.图12为小鼠免疫纳米颗粒疫苗前后脾淋巴细胞增殖水平的变化示意图；
61.图13为小鼠免疫纳米颗粒疫苗前后相关细胞因子水平变化示意图；
62.图14为小鼠腹腔感染1000个rh弓形虫速殖子后生存曲线图。
具体实施方式
63.为了更清楚的阐释本技术的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本技术更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本技术可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本技术发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
64.如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
65.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
66.下述实施例中所涉及的材料如下：
67.(1)刚地弓形虫rh虫株：由本实验室保存。
68.(2)实验动物：6-8周龄的spf级babl/c小鼠，购自浙江省医学科学院实验动物中心。
69.(3)质粒与菌株：克隆载体pet-28a(+)vector购于捷瑞生物公司。mep基因由捷瑞生物公司合成。大肠杆菌bl 21感受态菌株购于takara公司。
70.(4)工具酶及试剂：ni-nta亲和色谱购于北京韦氏博慧科技有限公司。考马斯亮蓝染液、hrp标记的山羊抗小鼠igg抗体购于杭州弗德生物科技有限公司。抗his标签鼠源单克隆抗体购于sigma公司。显色液购于北京索莱宝科技有限公司。plga购于山东岱罡生物有限公司。反转录试剂盒、la taq酶、dna marker购于takara公司。qpcr试剂盒购于南京诺唯赞。
71.(5)仪器：pcr仪(卡尤迪生物)，智能生化培养箱(宁波江南仪器厂)，震荡培养箱(上海知楚仪器)，凝胶成像仪(上海培清科技)，核酸电泳仪(北京六一科技)，蛋白电泳仪(美国bio-rad)，超声波裂解仪(宁波新芝科技)，酶标仪(青岛圣洁仪器系统有限公司)。
72.实施例1刚地弓形虫多表位肽的设计、制备与免疫原性评估
73.一、优势抗原表位的预测
74.利用bcpreds服务器(http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict.html)分析tgmic3蛋白的b细胞线性表位，得到预测分数最高的序列“sktmcgpggcgefcssnwif”。
75.利用iebd服务器(http://tools.iedb.org/mhci/)分析tgmic3蛋白的cd8+t细胞表位，选择mhc i分子类型为h-2-kd，h-2-dd，h-2-ld，得到预测分数最高的序列为“lpiqksvql”。
76.利用iebd服务器分析tgmic3蛋白的cd4+t细胞表位，选择mhc ii分子类型为h-2-i，得到预测分数最高的序列为“hdtttyvarrrypa”。
77.二、多表位肽的设计
78.将多肽按照以下顺序连接起来sag1(238-256)，mic3(109-128)，gra7(20-28)，mic3(27-35)，as15，mic3(368-381)，见表1。多基因片段之间通过柔性连接肽“sapgtp”连接各抗原表位，见图1。
79.表1表位序列与类型
80.表位来源表位序列表位类型sag1
(238-256)
cneksfkdilpkltenpwqb cellmic3
(109-128)
sktmcgpggcgefcssnwifb cellgra7
(20-28)
lpqfataatmhcⅰmic3
(27-35)
lpiqksvqlmhcⅰas15aveihrpvpgtappsmhcⅱmic3
(368-381)
hdtttyvarrrypamhcⅱ81.三、嵌合多表位肽的生物信息学分析
82.利用protparam服务器对多表位肽理化特性分析，结果表明多表位肽相对分子质量(kda)为12.04361，理论等电点(pi)为8.83，亲水性平均值(gravy)为-0.424。利用vaxijen v2.0分析多表位肽的抗原性，结果表明当以大肠杆菌为表达系统时，多表位肽抗原性总体评分为0.4680(抗原阈值为0.4)。利用algpred2服务分析多表位肽的致敏性，预测多表位肽为非过敏原。利用psipred服务器预测二级结构。其局部空间结构如下：有13个氨基酸构成α螺旋，18个氨基酸构成β折叠，和85个氨基酸构成无规则卷圈。利用alphafold2软件预测多表位肽的三级结构，利用pymol软件进行可视化分析，结果表明嵌合的抗原表位均呈现在多肽表面，见图2。
83.利用zdoock服务器将多表位肽与h-2-dd进行分子对接，pymol软件进行可视化分析，见图3a。利用pyrama服务器绘制拉式图，结果表明其氨基酸构象几乎均在合理范围内，见图3b。利用hawkdock服务器进行分子对接及验证，得到结合自由能为-34.69kcal/mol，说明多表位肽与mhc分子结合后处于低能量的稳定状态。
84.四、多表位重组肽mep的表达与纯化
85.目的dna片段由捷瑞生物公司合成，并将其连接在pet-28a(+)载体上。取重组质粒转化到bl21感受态大肠杆菌中，于含氨苄青霉素抗性的lb平板上过夜培养。挑取单个菌落于在lb液体培养基中，在37℃、220r/min的环境下培养。待菌液d 450nm达到0.7左右时，加入iptg至终浓度为0.8mmol/l，于220r/min、37℃环境下分别于0h、2h、4h、6h取出500μl样品。诱导菌液离心后弃去上清，将沉淀重悬于预制的pbs中，冰上超声破碎，离心后分离出上清样品和沉淀样品。样品煮沸后进行sds-page检测，由图4可知，在加入iptg诱导表达6h时，菌液蛋白含量达到最高水平。
86.在超声裂解后，重组蛋白出现在上清样品中，这说明重组多表位肽可溶于pbs。将扩大培养后的菌液，冰上超声破碎，取上清液过ni离子亲和层析柱，用60、80、120、250、500mmol/l咪唑的缓冲液洗脱。收集洗脱液。经sds-page检测纯化效果。由图5可知，在咪唑洗脱液浓度为250mmol/l时，在分子量为20kda处出现分子量正确且相对单一的条带。
87.五、western blot检测重组多表位肽的免疫学活性
88.蛋白透析后经sds-page后转膜，用5％脱脂奶封闭1.5h；用鼠源his单抗作为一抗，过夜孵育，用tbst清洗5次，5min/次。加入羊抗鼠igg-hrp作为二抗，室温孵育2h，用tbst洗
涤，滴加显色液进行显色并拍照。由图6可知，带有的his标签蛋白的多表位重组蛋白可以被相应的单克隆抗体识别，这说明纯化后的多表位重组肽即为所需目的蛋白。
89.六、重组多表位肽的免疫原性评估
90.1、试验设计
91.本项目试验研究中所有方案均符合浙江大学动物福利相关规定。将6-8周龄balb/c小鼠随机分成3组，cfa-rmep组，pbs组和rmep组。每组小鼠10只，分别在小鼠皮下多点接种100μg重组多表位肽、100μg与弗氏佐剂以1：1混合乳化后的重组多表位肽、100μl的pbs缓冲液，疫苗分别在第0天、第14天、第21天、第21天进行4次接种。分别在第0天、第7天、第14天、第21天、第27天通过小鼠断尾采血以测定相关抗体效价细胞因子。
92.2、抗体效价评估
93.小鼠通过断尾法采集100μl的血液样品，置于37℃培养箱中放置1h，在4℃冰箱静置过夜后，收集析出的血清。将析出血清3000r/min离心后，取1μl上层血清与150μl 5％脱脂奶充分混合混匀，置于-20℃冰箱备用。用包被缓冲液将弓形虫裂解蛋白稀释至20μg/ml，在96孔板中每孔加入100μl稀释液，4℃中孵育过夜。待裂解抗原完全结合到固相载体后，弃去包被液，用230μl pbst溶液洗涤5次。向每个孔加入100μl 5％脱脂牛奶(pbst配置)，于37℃孵育2小时。弃去封闭液，pbst溶液同上洗涤，并拍干。向每个孔中加入100μl稀释后的血清，37℃孵育1h。将血清弃去，pbst溶液同上洗涤，并拍干。每孔加入100μl 1:5000稀释的鼠二抗，37℃孵育45min。弃去二抗，再次洗涤，拍干96孔板。添加100μl底物显色液，37℃避光15min,加入100μl 2m硫酸溶液终止反应。于450nm吸光度处在模型微孔板elisa读数器中读数3次。以d450 nm值表示最终结果，见图7。在第三周和第四周，cfa-rmep小组的抗体水平显著提高，高于pbs对照组。
94.3、脾淋巴细胞增殖实验
95.最后一次免疫后两周处死每组小鼠中5只小鼠。取出脾脏，制备脾淋巴细胞悬液。在超净操作台上，先将小鼠置于75％乙醇中浸泡5min，再用无菌镊子和剪刀取出脾脏，将脾脏放到200目细胞滤网上，用剪刀剪碎，滴加预冷pbs缓冲液，使滤网上的脾脏组织充分碾压。收集滤液后在4℃，1500rpm离心10min去上清，加入2-3ml红细胞裂解液，冰上静置5min。用无菌pbs液洗涤。用细胞培养液重悬细胞，吹打混匀后得到脾细胞悬液，取10μl细胞计数，并观察细胞活力水平。调整密度上述制备的脾细胞悬液，相应的加入15μg/ml的重组蛋白刺激脾细胞,另外以15μg/ml cona溶液、lps溶液和mep溶液作为阳性对照，加入pbs作为阴性对照。使用mtt分析试剂盒评估细胞的增殖。如图8所示，在cona、lps溶液和mep溶液的刺激下，经cfa-rmep组免疫后的小鼠淋巴细胞增殖速率明显高于rmep组和lps组；而rmep组和lps组无显著差别。
96.4、小鼠脾脏淋巴细胞相关细胞因子评估
97.收集小鼠脾脏淋巴细胞，提取总rna，逆转录为cdna，qpcr分析不同细胞因子的转录水平。根据ncbi数据库检索相关细胞因子，根据primer 5设计特异性引物，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。qpcr体系如下：
98.体系20μlcdna1μlprimer f0.6μl
primer r0.6μlthunderbird sybr qpcr mix12.5μlddh2o10.3μl
99.荧光定量pcr反应程序：50℃3min，95℃1min一个循环，95℃15s，60℃15s，72℃30s，40个循环，最后一个循环分析熔解曲线。设置三个qrt-pcr样品重复，取ct值然后进行分析。计算方法采用ct值比较法，数据用单因素方差分析(one-way anova)，*：p≤0.05，**：p≤0.01，***：p≤0.001。最终结果见图9，结果表明cfa-rmep组细胞因子il-2，il-4，il-8，il-12，ifn-γ水平均显著提高，说明多表位肽在适当的佐剂下可以激发机体产生更高水平的免疫保护。
100.实施例2plga纳米颗粒的制备与表征
101.1、双乳液挥发法制备plga纳米颗粒
102.称取100mg的plga溶于10ml二氯甲烷作为油相，加入司盘-80至浓度为0.8％，使用注射器将500μl目的蛋白液加入油相中，立即在冰上超声破碎(180w，20％功率，1s超声，1s间隔)5min，直至形成白色的初乳。将初乳中加入到50ml 2％聚乙烯醇中，再次于冰上超声破碎(180w，50％功率，1s超声，1s间隔)20min，得到复乳。将液体倒入到200ml 0.5％聚乙烯醇中，磁力搅拌器过夜搅拌，挥干有机溶剂。将成品在30ml超纯水中洗涤5次。使用减压干燥仪器减压干燥，即可得plga纳米粒。
103.2、rmep-plga纳米颗粒的表征
104.取适量减压干燥前的纳米悬液在透射电镜专用铜网孵育3min，磷钨酸负染3min，通过透射电子显微镜观察颗粒形态；plga纳米颗粒喷金处理后通过扫描电子显微镜观察。电镜下纳米粒呈圆球状，表面光滑，大小均一，未出现大面积团聚，见图10a和图10b。
105.精密称取冷冻干燥后plga纳米颗粒质量，将plga纳米颗粒溶于0.1mol/l naoh和1％ sds溶液中，振荡后离心，取上清液，用bca法测定蛋白总量；按公式测定包封率(ee)，公式为ee＝(m包/m药)
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100％。m包为纳米粒中包裹的药物质量(mg)；m药为投入的总药质量(mg)，测得其平均包封率为54.42％。通过dls得到多分散系数(pdi)平均值为0.203，低于阈值0.3；其粒径分布如图10c。
106.实施例3弓形虫plga多表位疫苗的免疫效果评估
107.1、弓形虫plga多表位疫苗免疫试验设计
108.本项目试验研究中所有方案均符合浙江大学动物福利相关规定。将6-8周龄balb/c小鼠随机分成9组，每组小鼠15只，分别在小鼠皮下多点接种20μg相应的重组蛋白或100μl的pbs缓冲液，疫苗每隔两周加强一次，一共进行3次接种。分组如下：
[0109][0110]
2、弓形虫plga多表位疫苗免疫后抗体效价评估
[0111]
实验方法参阅实施例1中“抗体效价评估”部分。所得结果如图11所示，plga-rmep和plga-rmep+plga-rprofilin都能激发机体产生相应抗体，且的igg水平曾递增趋势，在第七周检测时抗体水平达到最大值。
[0112]
3、弓形虫plga多表位疫苗免疫后脾淋巴细胞增殖实验
[0113]
实验方法参阅实施例1中“脾淋巴细胞增殖实验”部分。所得结果如图12所示，在cona、lps溶液和mep溶液的刺激下，plga-rmep和plga-rmep+plga-rprofilin组免疫后的小鼠淋巴细胞增殖速率明显上高；而相应的plga-rprofilin组和pbs组无显著差别。
[0114]
4.弓形虫plga多表位疫苗免疫后细胞因子评估
[0115]
实验方法参阅实施例1中“小鼠脾脏淋巴细胞相关细胞因子评估”部分。所得结果如图13所示，th-1免疫应答激活的细胞因子(ifn-γ)和代表th-2免疫应答激活的细胞因子(il-4、il-10)在脾淋巴细胞mrna表达水平显著上调，这表明plga材料的重组多表位刺激诱导th-1/th-2混合免疫反应。
[0116]
5、急性攻毒实验
[0117]
在第三次免疫后两周，每组取5只balb/c小鼠腹腔注射1000个弓形虫rh株速殖子，每日观察小鼠的精神状况，记录小鼠的存活时间，绘制生存曲线，所得结果如图14所示，相较于其他对照组plga-rmep+plga-rprofilin组平均生存时间最长，小鼠最久可存活15天。表明该疫苗能够为机体提供部分免疫保护力。
[0118]
以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。

技术特征：
1.一种用于预防刚地弓形虫感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括：质量比为(1:10)～(10:1)的聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白；所述多表位肽的优势抗原表位包含sag1
(238-256)
、mic3
(109-128)
、gra7
(20-28)
、mic3
(27-35)
、as15肽、mic3
(368-381)
中的任意两种或多种。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述多表位肽采用将优势抗原表位以sag1
(238-256)
、mic3
(109-128)
、gra7
(20-28)
、mic3
(27-35)
、as15肽、mic3
(368-381)
的顺序通过柔性连接肽连接获得。3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述柔性连接肽为sapgtp。4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的质量比为(1:5)～(5:1)，优选(1:3)～(3:1)，更优选1:1。5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和/或聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的粒径为300～1500nm，优选为500～1000nm。6.一种如权利要求1-5任一所述的用于预防刚地弓形虫感染的疫苗的制备方法，其特征在于，包括：步骤1)、分别制备聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽和聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的冻干粉；步骤2)、按质量比例混合复配即得。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中聚乳酸乙醇酸共聚物包被的多表位肽，或聚乳酸乙醇酸共聚物包被的profilin蛋白的制备方法如下：步骤a)、将聚乳酸乙醇酸共聚物溶于油性溶剂中，加入表面活性剂，作为油相，向油相中加入多表位肽或profilin蛋白；步骤b)、配制聚乙烯醇的水溶液作为水相，将步骤a)获得的油相和水相混合，形成初乳；步骤c)、将步骤b)获得的初乳加入至聚乙烯醇的水溶液中，获得复乳；步骤d)、去除所述复乳中的溶剂，离心获得沉淀，洗涤干燥获得冻干粉。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中聚乳酸乙醇酸共聚物和所述多表位肽或所述profilin蛋白的质量比为100:(0.1～1)；和/或，所述步骤b)中的聚乙烯醇的水溶液的质量浓度为0.1％～1％，所述步骤c)中的聚乙烯醇的水溶液的质量浓度为4％～8％；和/或，所述步骤b)中采用超声法制备初乳，参数为：180w，20％功率，1s超声，1s间隔，共5min；和/或，所述步骤c)中采用超声法制备复乳，参数为：180w，50％功率，1s超声，1s间隔，共20min。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述多表位肽或所述profilin蛋白采用以下方法制备获得：将编码所述多表位肽或所述profilin蛋白的基因导入载体中获得重组载体，将所述重组载体转化至底盘菌株中获得重组菌株，培养所述重组菌株诱导其表达所述多表位肽或所
述profilin蛋白，收集所述多表位肽或所述profilin蛋白并纯化。10.如权利要求1-6任一所述的疫苗在制备用于预防刚地弓形虫感染的生物制品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种预防动物刚地弓形虫病的纳米材料多表位肽疫苗，该疫苗利用PLGA包裹多表位肽和profilin免疫激动剂形成纳米颗粒。所述多表位肽核心组成为六个优势肽段，分别是SAG1


技术研发人员：杨怡 马光旭 杜爱芳 赵明秀 张飞跃
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/19