一种高效抗癌的肿瘤疫苗及其制备方法

1.本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，具体是一种高效抗癌的肿瘤疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.肿瘤疫苗作为一种新兴的免疫疗法，是将肿瘤抗原、编码肿瘤抗原的基因、免疫细胞及分子等导入体内, 激活非特异性免疫应答杀灭肿瘤的方法。根据作用目的，肿瘤疫苗可分为预防性肿瘤疫苗和治疗性肿瘤疫苗；根据作用机制，肿瘤疫苗又可分为蛋白质/合成肽疫苗、细胞疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗等。尽管肿瘤疫苗已被证明能引起免疫反应，但临床效果通常较差，不足以克服肿瘤微环境的低免疫原性。免疫佐剂具有增强免疫原性、改变免疫反应类型、调节免疫反应强度等作用，是肿瘤疫苗重要组成部分。因此在许多肿瘤疫苗中，肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，taa）与免疫佐剂共同使用来激活强大的机体免疫反应。
3.随着现代疫苗的发展，对增强免疫原性的佐剂和新型递送系统的需求越来越大。纳米颗粒是指粒径在1-1000ｎｍ范围内的颗粒材料，将纳米技术与肿瘤疫苗相结合是当今的研究热点。纳米肿瘤疫苗作为一种新型“杂交”型疫苗, 可高效被树突状细胞摄取, 从而实现肿瘤抗原和佐剂的高效递释，诱发强免疫反应。高分子纳米微粒可通过亲水与疏水的作用制备或包覆多种药物，并实现药物缓释的作用。
4.针对癌症的治疗方法也层出不穷，但在各类癌症免疫治疗策略中，肿瘤疫苗具有成本相对较低、特异性高、副作用低的特点。尽管近年来不断有肿瘤疫苗产品进入临床试验，但是整体上肿瘤疫苗的研发仍需攻克诸多难关。其中，免疫原性弱而无法诱导高效的抗肿瘤免疫应答是肿瘤疫苗研发过程中面临的最大困难。患者肿瘤异质性、人白细胞抗原异质性和肿瘤免疫微环境是阻碍肿瘤疫苗发展的主要因素。
5.各种类型的肿瘤疫苗均有其优缺点：mrna肿瘤疫苗虽然免疫原性强，但由于其稳定性差，肿瘤抗原的免疫耐受性强、肿瘤的异质性和肿瘤微环境等原因降低了其抗肿瘤作用。肿瘤细胞疫苗含有肿瘤细胞的所有抗原，设计和生产疫苗之前不需对这些抗原进行系统而繁琐的鉴定，但其免疫原性较弱，且肿瘤细胞疫苗分泌多种抑制或杀死树突状细胞和t淋巴细胞等多种免疫细胞的细胞因子，导致肿瘤细胞疫苗的效果不佳。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种高效抗癌的肿瘤疫苗及其制备方法，本发明所采取的技术方案如下：第一方面，提供一种高效抗癌的肿瘤疫苗，包括负载免疫调节剂的纳米颗粒、肿瘤相关抗原，所述免疫调节剂为沙利度胺。免疫佐剂因其增强免疫原性、改变免疫反应类型、调节免疫反应强度等作用，是肿瘤疫苗设计中重要的一环。而fda批准上市的佐剂价格昂贵，增加了研发成本，沙利度胺（thalidomide，thd）是一种新型免疫调节剂，我们首次提出用thd作为肿瘤疫苗佐剂，其不仅具有价格低廉的特点，而且可显著下调肿瘤坏死因子-α
(tnf-α)，同时调节其他细胞因子的水平和机体的免疫状态，增加免疫原性。
7.作为优选，所述纳米颗粒为聚乳酸-羟基乙酸颗粒；基于聚乳酸-羟基乙酸（polylactic-co-glycolic acid，plga）的纳米颗粒因具有良好的安全性和生物降解性被食品药品监督管理局（food and drug administration，fda）批为疫苗载体。
8.作为优选，所述肿瘤相关抗原为肿瘤细胞膜；细胞膜包被的纳米仿生型肿瘤疫苗使肿瘤疫苗能够得到源细胞的特性, 从而增强其免疫逃逸、肿瘤的靶向定位和促进抗肿瘤免疫等功能，肿瘤细胞膜含有大量的免疫原性抗原，可被用于激发特异性免疫反应，与体内正常的细胞相比,肿瘤细胞具有其独特的特征, 例如不断增殖的能力、迁移性、接触抑制丧失和同源靶向能力等, 肿瘤细胞坏死后会释放损伤相关模式分子 (damage associatedmolecular patterns, damps), 可通过toll样受体、rig-1样受体或 nod样受体等模式识别受体,使其具有更强的免疫原性,诱导自身免疫或免疫耐受，因此,肿瘤细胞膜包被纳米粒,能更有效地靶向恶性肿瘤,触发或增强体内免疫系统的应答。
9.作为优选，上述肿瘤疫苗具体为由肿瘤细胞膜包被的负载沙利度胺的聚乳酸-羟基乙酸（plga）颗粒。
10.第二方面，提供上述高效抗癌的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：s1.采用纳米共沉淀法制备负载沙利度胺的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒，具体为：配置三氯甲烷：甲醇为 1:1 的有机相溶剂，按照沙利度胺：plga 为 1：1称取材料于有机相溶剂中，超声水浴，待溶液成为浑浊样液体时，加入三氯甲烷，抽取有机溶液后快速滴入纯水或0.1% pva溶液中，超声粉碎并混合均匀，最后用高速离心机离心，取沉淀用纯水定容，得到负载沙利度胺的plga纳米颗粒；若需要长期保存，则在离心后放入冷冻干燥机真空冷冻过夜，-20 ℃或
ꢀ‑
80 ℃保存；s2.采用低温超声包膜法，或冷冻超声包膜法，或挤膜法，得到肿瘤细胞膜碎片并与负载沙利度胺的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒混合，得到肿瘤细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗；低温超声包膜法及冷冻超声包膜法可使癌细胞膜包裹变得更加简易与均匀；以下提供上述三种方法的具体操作步骤：1.低温超声包膜法：5 mg/ml的纳米粒，加入1*107/个肝癌细胞，混合后，用超声破碎20 s，冰浴超声10 min，得到癌细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗。
11.2.冷冻超声包膜法：1*107/个肝癌细胞至于离心管中，-20度冷冻过夜，隔天融化得到细胞膜碎片并与5 mg/ml的纳米粒混合，冰浴超声10 min，得到癌细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗。
12.3.挤膜法：1*107/个肝癌细胞超声破碎得到细胞膜碎片，5 mg/ml的纳米粒混合，用200 nm滤孔的挤膜器来回推挤10-20次，得到癌细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗。
13.本发明的有益效果如下：本发明提供的负载沙利度胺的肿瘤疫苗能够高效靶向树突状细胞和巨噬细胞，并将肿瘤抗原递送至树突状细胞和巨噬细胞内部；同时，显著刺激巨噬细胞和树突状细胞增生，提高抗原呈递细胞mhc ii的表达量，提高肿瘤抗原呈递效率，提高机体的免疫记忆效果，有效预防肿瘤发生、发展和转移。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
15.图1为负载沙利度胺的多功能肿瘤疫苗透电图；图2为负载沙利度胺的多功能肿瘤疫苗的粒径分布；图3为肿瘤疫苗被树突状细胞和巨噬细胞吞噬的效果；图4为肿瘤疫苗刺激原代外周血树突状细胞和巨噬细胞的效果；图5为肿瘤疫苗的体内生物学功能对比。
具体实施方式
16.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例
17.经试验筛选，以下提供实施效果最佳的负载沙利度胺的plga纳米颗粒的制备方法：s1.采用纳米共沉淀法制备负载沙利度胺的plga纳米颗粒。三氯甲烷：甲醇为 1:1 的溶液为有机相溶剂。用分析天平按照沙利度胺：plga 为 1：1称取 50 mg材料于2 ml的有机相溶剂中，超声水浴2 h，待溶液成为浑浊样液体时，加入1ml三氯甲烷。用注射器抽取有机溶液后，快速滴入放置在磁力搅拌器上调节转数适中 10 ml 纯水或者0.1% pva溶液中，超声粉碎 5 min，并至于磁力搅拌器上旋转 3-4 h。最后用高速离心机10000rpm离心，取沉淀用纯水定容到 10 ml，得到浓度为 5 mg/ml的负载沙利度胺的plga纳米颗粒。若需要长期保存，则在10000 rpm离心后，放入冷冻干燥机真空冷冻过夜，-20 ℃或
ꢀ‑
80 ℃保存。
18.s2.用癌细胞膜包裹上述纳米颗粒，以下提供三种方法，其中低温超声包膜法及冷冻超声包膜法可使癌细胞膜包裹变得更加简易与均匀：（1）低温超声包膜法：5 mg/ml的纳米粒，加入1*107/个肝癌细胞，混合后，用超声破碎20 s，冰浴超声10 min，得到癌细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗。
19.（2）冷冻超声包膜法：1*107/个肝癌细胞至于离心管中，-20度冷冻过夜，隔天融化得到细胞膜碎片并与5 mg/ml的纳米粒混合，冰浴超声10 min，得到癌细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗。
20.（3）挤膜法：1*107/个肝癌细胞超声破碎得到细胞膜碎片，5 mg/ml的纳米粒混合，用200 nm滤孔的挤膜器来回推挤10-20次，得到癌细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗。
21.测试例1. 肿瘤疫苗靶向树突状细胞和巨噬细胞的效果图3为树突状细胞和巨噬细胞吞噬带有荧光的纳米粒的情况。本测试例中，将树突状细胞和巨噬细胞与纳米粒共孵育30分钟，运用激光共聚焦拍摄荧光图片。其中红色为细
胞骨架，绿色为纳米粒的荧光，蓝色为细胞核。如图3所示，在短时间内，树突状细胞和巨噬细胞能够很好的吞噬纳米粒，表面运用plga可以合成高效靶向树突状细胞和巨噬细胞的疫苗载体。
22.2. 肿瘤疫苗刺激树突状细胞和巨噬细胞抗原呈递的效果图4为流式细胞术检测肿瘤疫苗刺激原代外周血树突状细胞和巨噬细胞的效果。如图所示，与普通plga纳米粒合成的肿瘤疫苗相比，负载沙利度胺的肿瘤疫苗能够更高的激活树突状细胞和巨噬细胞表达mhc ii，并激活下游cd4+ t细胞形成免疫记忆。control组为对照组，mtv组为单纯plga纳米粒包裹癌细胞膜，mtv@tha为负载沙利度胺的plga纳米粒包裹癌细胞膜。*p《0.05，** p《0.01，*** p《0.001，****p《0.0001，方差分析。
23.3. 肿瘤疫苗的体内生物学功能如图5所示，与其他组相比，接受肿瘤疫苗接种后的小鼠，腹围和腹腔积液体积显著下降，表明腹腔肿瘤转移的情况有显著下降。这说明注射肿瘤疫苗其能够很有效的预防和治疗癌症转移。
24.以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

技术特征：
1.一种高效抗癌的肿瘤疫苗，其特征在于：包括负载免疫调节剂的纳米颗粒、肿瘤相关抗原，所述免疫调节剂为沙利度胺。2.根据权利要求1所述的一种高效抗癌的肿瘤疫苗，其特征在于：所述纳米颗粒为聚乳酸-羟基乙酸颗粒。3.根据权利要求1所述的一种高效抗癌的肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤相关抗原为肿瘤细胞膜。4.根据权利要求1所述的一种高效抗癌的肿瘤疫苗，其特征在于：具体为由肿瘤细胞膜包被的负载沙利度胺的聚乳酸-羟基乙酸颗粒。5.如权利要求1-4任一项所述的高效抗癌的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：s1.采用纳米共沉淀法制备负载沙利度胺的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒，具体为：配置三氯甲烷：甲醇为 1:1 的有机相溶剂，按照沙利度胺：聚乳酸-羟基乙酸为 1：1 称取材料于有机相溶剂中，超声水浴，待溶液成为浑浊样液体时，加入三氯甲烷，抽取有机溶液后快速滴入纯水或0.1% pva溶液中，超声粉碎并混合均匀，最后用高速离心机离心，取沉淀用纯水定容，得到负载沙利度胺的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒；s2.采用低温超声包膜法，或冷冻超声包膜法，或挤膜法，得到肿瘤细胞膜碎片并与负载沙利度胺的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒混合，得到肿瘤细胞膜包裹的负载沙利度胺的纳米肿瘤疫苗。

技术总结
本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种高效抗癌的肿瘤疫苗及其制备方法，在本发明中，首次提出用沙利度胺作为肿瘤疫苗佐剂，且本发明提供的负载沙利度胺的肿瘤疫苗能够高效靶向树突状细胞和巨噬细胞，并将肿瘤抗原递送至树突状细胞和巨噬细胞内部；同时，显著刺激巨噬细胞和树突状细胞增生，提高抗原呈递细胞MHC II的表达量，提高肿瘤抗原呈递效率，提高机体的免疫记忆效果，有效预防肿瘤发生、发展和转移。发展和转移。发展和转移。


技术研发人员：夏景林 黄安民 孔伊帆 余志杰 刘丕旭
受保护的技术使用者：温州医科大学附属第一医院
技术研发日：2023.07.20
技术公布日：2023/10/19