一种基于RT-RAA和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法与流程

一种基于rt-raa和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法
技术领域
1.本发明属于植物病毒检测技术领域。更具体地，涉及一种基于rt-raa和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法。


背景技术：

2.番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus，tobrfv)是近年来新发的一种正单链rna(+ssrna)病毒，属于帚状病毒科(virgaviridae)，烟草花叶病毒属(tobamovirus)，基因组全长6.2～6.4kb。tobrfv的主要寄主为番茄(solanum lycopersicum)和辣椒(capsicum annuum)，感病植株的花和果实会大量减少，果实变形，严重时还会导致果实畸形、变褐、坏死，严重影响食用价值和产量。自2015年，该病毒在世界范围内迅速蔓延，陆续在30余个国家或地区被检出，横跨欧洲、美洲、非洲和亚洲，呈现出种子带毒传播、传播速度快和检出率高的特点。对tobrfv进行快速、准确的检测，是防止其传播的关键。
3.由于tobrfv容易出现与其同属的一种或多种病毒同时侵染同一病株的情况。因此，针对tobrfv的检测需要较高的特异性。目前已有的tobrfv的检测技术中，酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)不具备很好的特异性；现有的tobrfv商业化elisa检测试剂盒与番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，tomv)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，tmv)存在交叉反应；高通量测序技术(next-generation sequencing，ngs)受实验室条件和检测成本的限制，无法用于日常快速检测；普通rt-pcr和实时荧光rt-pcr法虽具有高灵敏度和检测时间短的优势，但需要具有一定经验的专业技术人员在实验室操作完成，对设备要求高，具有操作繁琐、耗时长和成本高等缺点。闫志勇等(2021)利用tobrfv粒子为抗原研制的特异性试纸条可快速检测tobrfv，但其检测灵敏度较低，比普通rt-pcr低32倍。亟需提供一种可简便、快速且准确的检测tobrfv的产品和方法。
4.重组酶介导的等温核酸扩增(recombinase-aided amplification，raa)技术是一种仿照t4噬菌体的体外核酸等温扩增方法(马文娣等，2021)，该技术无需造价高昂的升降温仪器，在恒温条件下20min内即可实现dna指数级扩增(jiao et al.，2019)，操作简便且反应快速、灵敏，适合于病毒基因组dna或rna的快速检测(li et al.，2019)。但raa与pcr相比，其出现的时间较短，引物和探针的设计难度大，方法构建困难，在植物病害检测领域成熟应用的案例少。侧流层析试纸条(lateral flow assay，lfa)采用层析式双抗体夹心法快速检测核酸扩增产物(fu et al.，2014)，与传统的琼脂糖凝胶电泳检测相比，该方法的操作简单，判读迅速，不含有毒物质，无需任何仪器设备(aktas et al.，2019)，便于实现病毒的现场快速检测，但其无法单独实现对tobrfv的准确检测。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是如何利用重组酶介导的等温核酸扩增和侧流层析试
纸条两项技术的优点，克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种基于rt-raa和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法。
6.本发明的第一个目的是提供一种用于检测番茄褐色皱果病毒的rt-raa引物和探针组合。
7.本发明的第二个目的是提供所述rt-raa引物和探针组合在检测番茄褐色皱果病毒中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供所述rt-raa引物和探针组合在制备检测番茄褐色皱果病毒的产品中的应用。
9.本发明的第四个目的是提供一种用于检测番茄褐色皱果病毒的试剂盒。
10.本发明的第五个目的是提供一种基于rt-raa检测番茄褐色皱果病毒的方法。
11.本发明的第六个目的是提供一种基于rt-raa和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法。
12.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
13.本发明基于番茄褐色皱果病毒几个不同的基因序列，分别设计了数条rt-raa引物和探针，经不断地循环验证、调整、再验证过程，基于cp基因设计得到了效果相对较好的rt-raa引物和探针，通过对所述引物和探针组合进一步的筛选和优化，获得了可用于检测番茄褐色皱果病毒的rt-raa引物和探针组合，以及相应的检测方法，由此可以实现对番茄褐色皱果病毒的特异、灵敏和快速的检测。
14.本发明提供了一种用于检测番茄褐色皱果病毒的rt-raa引物和探针组合，包括引物tob-ra5、tob-ra6和探针lf-p1；所述引物tob-ra5的序列如seq id no.1所示；所述引物tob-ra6的序列如seq id no.2所示；所述探针lf-p1的序列如seq id no.3所示。
15.利用本发明所述rt-raa引物和探针组合，结合侧流层析试纸条，即可实现对番茄褐色皱果病毒的检测。
16.为便于结合测流层析试纸条进行检测，可选地，本发明在引物tob-ra6序列的5'端标记了生物素(biotin)；在探针lf-p1序列的5'端标记了荧光基团fam，在第31位碱基标记了四氢呋喃残基(the)，3’端进行了c3 spacer修饰。
17.利用本发明所述rt-raa引物和探针组合可以实现对番茄褐色皱果病毒的特异性检测。因此，本发明还请求保护所述rt-raa引物和探针组合在检测番茄褐色皱果病毒中的应用。
18.本发明还请求保护所述rt-raa引物和探针组合在制备检测番茄褐色皱果病毒的产品中的应用。
19.本发明还提供了一种用于检测番茄褐色皱果病毒的试剂盒，所述试剂盒中含所述rt-raa引物和探针组合。
20.具体地，所述试剂盒中还含有rt-raa反应所需试剂。
21.具体地，所述试剂盒中还含有10μmol/l的醋酸镁。
22.作为一种可选的实施方式，所述试剂盒中还含有侧流层析试纸条。
23.具体地，所述侧流层析试纸条为与所述引物和/或探针上的标记物相匹配的试纸条，可用于检测所述引物和探针的扩增产物。
24.可选地，所述侧流层析试纸条为标记有胶体金的侧流层析试纸条。
25.本发明还提供了一种检测番茄褐色皱果病毒的方法，包括以下步骤：
26.s1.提取待测样品的总rna；
27.s2.以s1所得总rna为模板，以本发明所述引物和探针组合进行rt-raa反应；
28.s3.将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；若出现大小为200bp的特异性条带，则检测结果为阳性，反之为阴性。
29.本发明还提供了一种基于rt-raa和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法，包括以下步骤：
30.s1.提取待测样品的总rna；
31.s2.以s1所得总rna为模板，以本发明所述引物和探针组合进行rt-raa反应；
32.s3.将扩增产物稀释后用侧流层析试纸条进行检测；若试纸条的质控线和检测线处均出现条带，则检测结果为阳性；若试纸条的质控线处出现条带，则检测结果为阴性；若试纸条的质控线和检测线处均未出现条带，检测结果无效。
33.将扩增产物稀释后用侧流层析试纸条进行检测，由此可以实现现场的快速检测。具体地，所述侧流层析试纸条为标记有胶体金的侧流层析试纸条。
34.具体地，上述方法中，rt-raa反应所用反应体系中，引物的浓度为0.12～0.4μmol/l；探针的浓度范围为0.06～0.2μmol/l。
35.更具体地，引物的浓度为0.216μmol/l。
36.更具体地，探针的浓度为0.06μmol/l。
37.具体地，上述方法中，rt-raa反应所用反应条件为：42℃恒温处理10～15min。
38.更具体地，处理时间为15min。
39.本发明具有以下有益效果：
40.本发明提供了一种可用于检测番茄褐色皱果病毒的rt-raa引物和探针组合，同时还提供了利用所述引物和探针组合，结合侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法。利用本发明所述方法，不仅可以实现对番茄褐色皱果病毒的快速检测，同时该方法对设备的要求低，特异性和灵敏度高，检测结果准确，不易出现假阳性。本发明有助于番茄褐色皱果病毒的快速检测，有助于番茄褐色皱果病毒的防治。
附图说明
41.图1为rt-raa引物和探针的筛选结果；图中的1、3、5、7检测的均为tobrfv阳性样本，图中的2、4、6、8检测的均为空白对照；图中1～8对应的引物和探针组合依次为：tob-ra3/tob-ra4/lf-p1、tob-ra3/tob-ra4/lf-p1、tob-ra3/tob-ra4/lf-p2、tob-ra3/tob-ra4/lf-p2、tob-ra5/tob-ra6/lf-p1、tob-ra5/tob-ra6/lf-p1、tob-ra5/tob-ra6/lf-p2和tob-ra5/tob-ra6/lf-p2。
42.图2为rt-raa-lfa检测方法中探针浓度的优化结果；图中的1、3、5、7检测的均为tobrfv阳性样本，图中的2、4、6、8检测的均为空白对照；图中1～8对应的探针浓度依次为0.06μmol/l、0.06μmol/l、0.1μmol/l、0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.2μmol/l、0.4μmol/l、0.4μmol/l。
43.图3为rt-raa检测方法的特异性检测结果；图中的1为tobrfv rna样本；图中的2为tmv rna样本；图中的3为tomv rna样本；图中的4为tommv rna样本；图中的5为pmmov rna样
本；图中的6为pepmv rna样本；图中的7为torsv rna样本；图中的8为trsv rna样本。
44.图4为rt-raa-lfa检测方法的特异性检测结果；图中的1为tobrfv rna样本；图中的2为tmv rna样本；图中的3为tomv rna样本；图中的4为tommv rna样本；图中的5为pmmov rna样本；图中的6为pepmv rna样本；图中的7为torsv rna样本；图中的8为trsv rna样本；图中的9为空白对照；图中的10为健康番茄叶片。
45.图5为普通rt-pcr方法的灵敏度检测结果；m为m dl2000 marker；图中的1～10对应的rna样本的浓度依次为92.4、9.24
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100、9.24
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ng/μl。
46.图6为rt-raa-lfa检测方法的灵敏度检测结果；图中的1～10对应的rna样本的浓度依次为92.4、9.24
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ng/μl。
具体实施方式
47.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
48.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
49.本发明进行rt-raa反应所用试剂盒为rna恒温快速扩增试剂盒，购自安普未来(常州)生物科技有限公司，货号为wlrn8209kit。
50.本发明所用侧流层析试纸条购自安普未来(常州)生物科技有限公司，货号为wlfs8204。
51.实施例1引物和探针的设计以及检测方法的建立
52.1、引物和探针的设计
53.本发明基于tobrfv的多个不同的基因序列，分别设计了数条rt-raa引物和探针，经不断地循环验证、调整、再验证过程，基于cp基因设计得到了效果相对较好的rt-raa引物和探针，包括引物tob-ra3、tob-ra4、tob-ra5和tob-ra6，以及探针lf-p1和lf-p2，在此基础上构建用于检测tobrfv的rt-raa和rt-raa-lfa检测方法。为便于对比检测效果，本发明在构建用于检测tobrfv的方法中还利用了普通rt-pcr引物tobrfv-f-5506和tobrfv-r-6186。所述引物和探针的序列及其所携带的修饰如表1所示：
54.表1引物和探针序列
55.名称引物序列及其携带标记tobrfv-f-55065'-gtcccgatgtctgtaaggcttgc-3'tobrfv-r-61865'-gcaggtgcagaggaccattgtaa-3'tob-ra35'-cactaggtaatcagttccaaacacaacaag-3'tob-ra45'-biotin-tagaggatctagtaccgcattgtacctatac-3'tob-ra55'-ctaattcactaggtaatcagttccaaacacaac-3'tob-ra65'-biotin-tataatcctatttctagtatcgaaagctcctaa-3'lf-p15'-fam-ctagaacaaccgttcaacggcaatttagcg(thf)agtgtggaaacctgtc-c3-space3'lf-p25'-tcaacggcaatttagcgaagtgtggaaacc(thf)gtccctcaagtcact-c3-space3'
56.注：5'端标记有生物素(biotin)的引物为下游引物。
57.2、tobrfv的rt-raa和rt-raa-lfa检测方法
58.(1)病毒rna的提取
59.按照商品化植物总rna提取试剂盒的说明书分别提取感染tobrfv的番茄叶片和健康番茄叶片的总rna，用超微量分光光度计检测rna浓度，于-80℃保存备用。
60.(2)tobrfv的rt-raa和rt-raa-lfa检测
61.以提取的感染了tobrfv的番茄叶片的总rna为模板进行rt-raa-lfa检测，其中，rt-raa反应所用试剂盒为rna恒温快速扩增试剂盒(货号为wlrn8209kit)。rt-raa-lfa检测体系的体积为50μl，其中，buffer a 29.4μl、10μmol/l上游引物2μl、10μmol/l下游引物1.8μl、10μmol/l探针0.5μl、总rna 2μl、buffer b(10μmol/l醋酸镁)2.5μl、双蒸水补足50μl；上下颠倒反应管8～10次，使其充分混匀，振荡离心后，将反应管转移到恒温加热装置中，42℃加热15min。利用rt-raa进行检测时，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；若出现大小为200bp的特异性条带，则检测结果为阳性，反之为阴性则。利用rt-raa-lfa进行检测时，加热后取出10μl加入含有190μl去离子水的1.5ml离心管中，混合均匀，吸取50μl稀释后的反应产物滴入侧流层析试纸条的加样孔，5min后观察试纸条变化情况。若试纸条上出现2条条带(质控线处出现1条蓝色条带，检测线处出现1条红色条带)，则检测结果为阳性；若试纸条质控线处出现1条蓝色条带，检测结果为阴性；若试纸条质控线和检测线处均未出现条带，检测结果无效。
62.3、rt-raa-lfa检测引物探针的筛选
63.分别对表1所示的rt-raa引物和探针进行组合、筛选和优化，共4个组合，分别为tob-ra3/tob-ra4/lf-p1、tob-ra3/tob-ra4/lf-p2、tob-ra5/tob-ra6/lf-p1、tob-ra5/tob-ra6/lf-p2，其他条件保持不变，按照上述方法对上述组合体系分别进行检测，以双蒸水为空白对照，观察不同组合下胶体金标记的测流层析试纸条的变化情况。
64.rt-raa-lfa检测引物探针的筛选结果如图1所示。由图1可知，4个引物探针组合均时，tobrfv胶体金试纸条检测线均出现了明显的红色条带，空白对照无红色条带。其中，组合tob-ra3/tob-ra4/lf-p1tobrfv胶体金试纸条检测线强度最弱，组合tob-ra3/tob-ra4/lf-p2检测线强度次之，组合tob-ra5/tob-ra6/lf-p1、tob-ra5/tob-ra6/lf-p2检测线强度最强，二者强度基本一致，但tob-ra5/tob-ra6/lf-p1组合出现明显检测线的时间更短，后续实验选择tob-ra5/tob-ra6/lf-p1组合。
65.4、rt-raa-lfa检测方法的优化
66.本发明对rt-raa-lfa检测方法中探针的浓度进行了优化。具体地，上述50μl反应体系中，探针终浓度分别设置为0.06、0.1、0.2、0.4μmol/l，其他条件保持不变。按照本发明所述方法对上述优化体系分别进行检测，以双蒸水为空白对照，观察不同组合下胶体金标记的测流层析试纸条的变化情况。
67.所述rt-raa-lfa检测方法中探针浓度的优化结果如图2所示。由图2可知，当探针浓度分别为0.06、0.1、0.2、和0.4μmol/l时，胶体金标记的测流层析试纸条的检测线均出现了明显的红色条带，且3个样品的检测结果之间无明显差别。但当探针浓度过高(0.4μmol/l)时，空白对照会出现假阳性现象(图2中的8)，故选择0.06μmol/l作为rt-raa-lfa检测体系中探针的最佳浓度。
68.实施例2特异性检测
69.本发明进行特异性检测所用供试毒源和植物包括：tobrfv、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，tmv)、番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，tomv)、番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus，tommv)、辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus，pmmov)、凤果花叶病毒(pepino mosaic virus，pepmv)、番茄环斑病毒(tomato ringspot virus，torsv)、烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus，trsv)，共8种病毒rna样品，另还包括健康的番茄和辣椒叶片样品，所述样品均为发明人实验室保存。
70.利用优化后的rt-raa和rt-raa-lfa检测方法分别对上述8种病毒rna样品以及健康番茄叶片rna进行特异性检测，以双蒸水为空白对照，每个样品设置3个重复，根据检测结果判断所建立的检测方法是否具有特异性。
71.rt-raa检测方法的特异性检测结果如图3所示。rt-raa-lfa检测方法的特异性检测结果如4所示。由图3可知，本发明所述引物和探针能有效扩增tobrfv，目的片段大小为200bp，对其它病毒无特异性扩增。由图4可知，只有tobrfv阳性样品的胶体金试纸条检测线出现了明显的红色条带，而其它病毒rna只出现一条蓝色控制线。上述结果表明，本发明所述rt-raa引物和探针组合只能特异性扩增tobrfv，本发明所述rt-raa和rt-raa-lfa检测方法的特异性好，可以对tobrfv进行特异、准确的检测。
72.实施例3灵敏度检测
73.不同浓度tobrfv rna的检测：对提取获得的感染了tobrfv的番茄叶片的总rna进行超微量分光光度计检测，测得其浓度为92.4ng/μl，将此rna溶液进行10倍梯度稀释，依次获得浓度为92.4、9.24
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ng/μl的rna溶液，分别以不同浓度rna溶液为模板，进行rt-raa-lfa检测和普通rt-pcr检测，并对2种方法的灵敏度进行比较。
74.普通rt-pcr检测方法：利用引物tobrfv-f-5506/tobrfv-r-6186对提取的感染了tobrfv的番茄叶片的总rna进行一步法rt-pcr反应(takara，北京)，反应体系为：2
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one step buffer 12.5μl，上游、下游引物(10μm)各1.0μl，primescript one step enzyme mix 1.0μl，总rna 1.5μl，rnase free ddh2o补足至25μl。反应程序：50℃逆转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35次循环；72℃延伸10min；取5μl的pcr反应液用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳(120v，30min)，并用凝胶成像系统分析检测结果。
75.普通rt-pcr检测方法的检测灵敏度结果如图5所示。rt-raa-lfa检测方法的灵敏度检测结果如图6所示。由图5和图6可知，普通rt-pcr方法检测tobrfv rna时，灵敏度为9.24
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ng/μl(图5)；而利用rt-raa-lfa方法检测tobrfv rna时，当rna浓度为9.24
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ng/μl时，胶体金试验条检测线逐渐减弱，但当浓度为9.24
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ng/μl时，利用胶体金试纸条仍能产生检测线，表明rt-raa-lfa方法检测的灵敏度为9.24
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ng/μl(图6)，比普通rt-pcr方法的灵敏度提高了10倍左右。
76.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测番茄褐色皱果病毒的rt-raa引物和探针组合，其特征在于，包括引物tob-ra5、tob-ra6和探针lf-p1；所述引物tob-ra5的序列如seq id no.1所示；所述引物tob-ra6的序列如seq id no.2所示；所述探针lf-p1的序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述rt-raa引物和探针组合，其特征在于，引物tob-ra6序列的5'端标记有生物素；探针lf-p1序列的5'端标记有荧光基团fam，第31位碱基标记有四氢呋喃残基，3’端进行了c3spacer修饰。3.权利要求1或2所述rt-raa引物和探针组合在检测番茄褐色皱果病毒中的应用。4.权利要求1或2所述rt-raa引物和探针组合在制备检测番茄褐色皱果病毒的产品中的应用。5.一种用于检测番茄褐色皱果病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1或2所述rt-raa引物和探针组合。6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有rt-raa反应所需试剂。7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有侧流层析试纸条。8.一种基于rt-raa检测番茄褐色皱果病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.提取待测样品的总rna；s2.以s1所得总rna为模板，以权利要求1或2所述引物和探针组合进行rt-raa反应；s3.将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；若出现大小为200bp的特异性条带，则检测结果为阳性，反之为阴性。9.一种基于rt-raa和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.提取待测样品的总rna；s2.以s1所得总rna为模板，以权利要求1或2所述引物和探针组合进行rt-raa反应；s3.将扩增产物稀释后用侧流层析试纸条进行检测；若试纸条的质控线和检测线处均出现条带，则检测结果为阳性；若试纸条的质控线处出现条带，则检测结果为阴性；若试纸条的质控线和检测线处均未出现条带，检测结果无效。10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，rt-raa反应所用反应体系中，引物的浓度为0.12～0.4μmol/l；探针的浓度范围为0.06～0.2μmol/l。

技术总结
本发明公开了一种基于RT-RAA和侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法。本发明提供了一种可用于检测番茄褐色皱果病毒的RT-RAA引物和探针组合，同时还提供了利用所述引物和探针组合，结合侧流层析试纸条检测番茄褐色皱果病毒的方法。利用本发明所述方法，不仅可以实现对番茄褐色皱果病毒的快速检测，同时该方法对设备的要求低，特异性和灵敏度高，检测结果准确，不易出现假阳性。本发明有助于番茄褐色皱果病毒的快速检测，有助于番茄褐色皱果病毒的防治。果病毒的防治。果病毒的防治。


技术研发人员：冯黎霞 于璇 李献锋 马骏 武目涛
受保护的技术使用者：广州海关技术中心
技术研发日：2023.07.28
技术公布日：2023/10/19