同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合及方法与流程

1.本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂、基于lamp技术同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.持续感染高危hpv是宫颈癌的主要原因，也是宫颈上皮内病变的前兆瘤(cin)。全世界99％以上的宫颈癌都与hpv有关，hpv属于乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒a属，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，是一种小的，无包膜的，双链dna病毒，基因组大约有8000个核苷酸。有超过118种不同类型的hpv和大约40种不同的hpv可以感染人类肛门生殖器粘膜。然而，这些类型中只有大约14种亚型被认为是宫颈癌及其前体病变发展的高危亚型，who国际癌症研究机构(iarc)及其他国际组织的研究成果，将hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68等14种基因型列为高危型别。
3.虽然持续感染高风险(hr)hpv是宫颈癌及其前驱病变的必要原因，但很少有感染进展为这些疾病状态。hpv的性传播感染极为普遍，估计在所有女性中有高达75％的人在某个时候接触过hpv。然而，几乎所有受感染的妇女都会产生有效的免疫反应，并在2年内清除感染，没有任何长期的健康后果。任何类型的hpv感染都可以产生宫颈上皮内瘤变(cin)，尽管这通常也会在hpv感染被清除后消失。
4.在有宫颈癌筛查项目的发达国家，巴氏涂片检查自20世纪50年代中期以来一直被用作检测宫颈癌早期前兆的主要工具。尽管巴氏涂片和随后的液体细胞学方法在这些国家大幅降低了宫颈癌死亡率，但它需要经过高度训练的细胞病理学家进行解释，而且假阴性率很高。细胞学异常主要是由于hpv感染，然而，各种炎症或取样变异可能导致假阳性的细胞学结果。异常细胞学结果的分诊包括重复检查、阴道镜检查和活检。组织学证实的高级别病变必须通过手术切除或消融，以防止浸润性宫颈癌的发展。
5.人乳头瘤病毒在体外培养极其困难，并不是所有感染hpv的患者都有明显的抗体反应。分子检测是一种非侵入性的方法，以确定宫颈hpv感染的存在。hpv核酸检测可通过早期发现25岁及以上女性的高风险病变，减少25岁及以上asc-us细胞学患者不必要的阴道镜检查和治疗，提高宫颈癌筛查项目的敏感性。分子检测包括普通pcr检测技术、荧光pcr检测技术、原位分子杂交检测、数字pcr检测技术和等温扩增检测技术等。目前，市面上通常使用荧光pcr检测技术对患者采样所得的待测样本进行hpv检测，但是，pcr检测技术操作复杂、仪器昂贵并且涉及多重变温过程，并不适用于社区医院和基层检测。
6.目前，也有针对人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其基于rpa等温扩增技术或荧光pcr法进行检测，rpa等温扩增技术虽然反应时间短，但是需要核酸提取，操作复杂，成本较高。而荧光pcr法的检测时间长，并且对仪器的要求较高。
7.以lamp(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增技术)为代表的等温扩增技术可以在恒温65℃下，最快15分钟内实现核酸分子的百万倍扩增，因此难
免保证有少量错配和引物dimer，这些轻微的污染都会导致lamp高速扩增中造成的假阳性检测。无论采用sybr green、浊度、hnb等各种显色方法都很难产生高特异性的信号，因此从公布至今有近20年的时间，其仍然无法在诊断试剂领域获得广泛应用。


技术实现要素：

8.基于此，本发明的目的在于提供一种用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂、同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合、试剂盒和方法。
9.实现上述发明目的的技术方案包括如下。
10.本发明的第一方面，提供了一种用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂，其由包括以下浓度的组分组成：chelex-1004.8wt％～5.2wt％，tcep 0.48m～0.52m，licl 1.8m～2.2m，edta 1.3m～1.7m，sds 0.04wt％～0.06wt％，tween-201.8wt％～2.2wt％，np401.8wt％～2.2wt％。
11.本发明的第二方面，提供了一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合，包括：核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示的引物、核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示的引物、核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示的引物、以及核苷酸序列如seq id no.7所示的探针。
12.本发明的第三方面，提供了一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，包括上述核酸释放剂和上述引物探针组合。
13.本发明的第四方面，提供了一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法，包括以下步骤：在待测样本中加入上述核酸释放剂，于96℃～99℃放置4min～6min，即得待测样本dna；再使用上述引物探针组合对待测样本dna进行lamp扩增。
14.本发明的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法，通过采用免核酸提取的核酸释放剂得到待测样本的核酸，再利用特异性引物探针组合，实现了可以快速、高特异性地同时检测14种高危型人乳头瘤病毒，克服了市面上lamp技术假阳性的问题和荧光pcr方法和检测时间长和需要昂贵设备的缺点，具有广阔的应用前景。
附图说明
15.图1为本发明实施例4中各待测样本的lamp扩增结果。
16.图2为本发明试验例1中使用引物探针组合一进行lamp扩增的结果。
17.图3为本发明试验例1中使用引物探针组合二进行lamp扩增的结果。
18.图4为本发明试验例1中使用引物探针组合三进行lamp扩增的结果。
19.图5为本发明试验例2中使用本发明的检测方法对待测样本进行lamp扩增的结果。
20.图6为本发明试验例2中使用传统lamp荧光法对待测样本进行lamp扩增的结果。
21.图7为本发明试验例3中对使用核酸释放剂方案一提取的样本dna进行lamp扩增的结果。
22.图8为本发明试验例3中对使用核酸释放剂方案二提取的样本dna进行lamp扩增的结果。
23.图9为本发明试验例3中对使用核酸释放剂方案三提取的样本dna进行lamp扩增的结果。
24.图10为本发明试验例3中对使用takara试剂盒提取的样本dna进行lamp扩增的结果。
具体实施方式
25.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
26.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
27.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如green和sambrook等人，分子克隆实验指南(molecular cloning:alaboratorymanual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
28.在本发明中，首先采用核酸释放剂得到待测样本的核酸(免核酸提取步骤，5min内即可完成核酸的快速提取)，再基于lamp技术设计了特异性引物和特异性探针。采用荧光探针作为光学信号，其探针只会与特异性目的片段dna序列结合后，才会发光(传统的lamp荧光法具有检测快速的特点，采用荧光染料作为光学信号，其染料并不会特异的识别pcr产物，只要是有双链dna的合成，染料就与之结合并发光)，因此，在lamp试剂中添加探针能大幅度提高扩增的特异性，解决lamp技术的假阳性问题，实现了快速、高特异性地同时检测14种高危型人乳头瘤病毒。核酸处理到结果，最快15分钟内可以完成，可以克服市面上lamp技术假阳性的问题和荧光pcr方法和检测时间长、对样本的耐受性差和需要昂贵设备的缺点，具有广阔的应用前景。
29.在本发明的其中一些实施例中，公开了一种用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂，其由包括以下浓度的组分组成：chelex-100
30.4.8wt％～5.2wt％，tcep 0.48m～0.52m，licl 1.8m～2.2m，edta 1.3m～1.7m，sds 0.04wt％～0.06wt％，tween-201.8wt％～2.2wt％，np401.8wt％～2.2wt％。
31.在其中一些实施例中，公开了一种用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂，其由包括以下浓度的组分组成：chelex-1004.9wt％～5.1wt％，tcep 0.49m～0.51m，licl 1.9m～2.1m，edta 1.4m～1.6m，sds 0.05wt％，tween-201.9wt％～2.1wt％，np401.9wt％～2.1wt％。
32.在本发明的另一些实施例中，公开了一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合，包括：核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示的引物、核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示的引物、核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示的引物、以及核苷酸序列如seq id no.7所示的探针。
33.在其中一些实施例中，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团，3'修饰有荧光淬灭基团。
34.在其中一些实施例中，所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq1。
35.在其中一些实施例中，所述核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示的引物的工作浓度为250nm～350nm，所述核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示的引物的工作浓度为62.5nm～87.5nm，所述核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示的引物的工作浓度为125nm～175nm。
36.在其中一些实施例中，所述核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示的引物的工作浓度为280nm～320nm，所述核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示的引物的工作浓度为70nm～80nm，所述核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示的引物的工作浓度为145nm～155nm。
37.在其中一些实施例中，所述核苷酸序列如seq id no.7所示的探针的工作浓度为62.5nm～87.5nm。
38.在其中一些实施例中，所述核苷酸序列如seq id no.7所示的探针的工作浓度为70nm～80nm。
39.在本发明的另一些实施例中，公开了一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，包括上述核酸释放剂和引物探针组合。
40.在本发明的另一些实施例中，公开了一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法，包括以下步骤：在待测样本中加入上述核酸释放剂，于96℃～99℃放置4min～6min，即得待测样本dna；再使用引物探针组合对待测样本dna进行lamp扩增。
41.在其中一些实施例中，所述lamp扩增的反应体系包括：2
×
lamp premix buffer 25μl，bst dna聚合酶2μl，引物探针混合液5.25μl，荧光染料syto-92μl，样本dna 5μl，ddh2o 10.75μl。
42.在其中一些实施例中，所述lamp扩增的反应程序为：62℃～64℃恒温55min～65min。
43.在以下实施例中，所有样本是合成的质粒或第三方购买的质控品样本。
44.以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
45.实施例1用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂
46.本实施例提供了一种用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂，其由以下浓度的组分组成：chelex-1005wt％，tcep 0.5m，licl 2m，edta 1.5m，sds 0.05wt％，tween-202wt％，np402wt％。
47.本实施例的核酸释放剂的制备方法如下：在纯净水中加入chelex-100、tcep、licl、edta、sds、tween-20、np40，使其达到终浓度，即得。
48.实施例2用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合
49.根据国内外相关文献报道，选择14种高危型人乳头瘤病毒的e6基因序列，基于lamp引物设计原则，在primerexplorerv5网站，将基因序列带入，设计引物序列，lamp探针根据primer express5.0.1软件设计，设计了引物探针组合(生工生物合成)，序列如下：
50.hpv-lf1(seq id no.1):ctgtggtaactttctgggtcg
51.hpv-lb1(seq id no.2):cagttactgcgacgtgaggt
52.hpv-of1(seq id no.3):gcaccacaagagaactgc
53.hpv-ob1(seq id no.4):agcttatggattcccatatc
54.hpv-if1(seq id no.5):
55.tgtttgcagctctgtgcataagtttcaggacccacagga
56.hpv-ib1(seq id no.6):
57.agaatgtgtgtactgcaagcaatcccgaaaagcaaagtcat
58.hpv-p1(seq id no.7):fam-caactatacatgagataat-bhq1实施例3同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法
59.本实施例的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法，包括以下步骤：
60.1、提取样本dna
61.使用实施例1的核酸释放剂，将待测样本于98℃处理5min；
62.2、配制lamp反应体系
63.反应体系为50μl(具体如表1所示)，包括：2
×
lamp buffer 25μl(tris-hcl20mmol/l、kcl 10mmol/l、mgso410mmol/l、tritonx-1000.1％、dntp
64.1.2mmol/l、甜菜碱0.8mol/l)，bst dna聚合酶2μl，引物探针混合液5.25μl，荧光染料syto-92μl，样本dna 5μl，ddh2o 10.75μl；
65.其中，引物探针混合液为实施例2的引物探针的混合液，if1/ib1引物使用浓度为300nm，of1/ob1引物使用浓度为75nm，lf1/lb1使用浓度为150nm。
66.表1
67.试剂终浓度体积tris-hcl20mmol/l10μlkcl10mmol/l5μlmgso410mmol/l5μltritonx-1000.1％2μldntp1.2mmol/l2μl甜菜碱0.8mol/l1μlbstdna聚合酶0.1u/μl2μlhpv-if1/ib1300nm各0.375μlhpv-of1/ob175nm各0.75μlhpv-lf1/lb1150nm各1.5μlhpv-probe175nm0.1875μl样本dna/5μlh2o/10.5625μltotal 50μl
68.3、lamp扩增反应
69.将表1反应体系放置于荧光定量pcr仪(abi的quantstudio q5型号)中进行lamp反应，扩增程序如表2；反应完成后通过ct值判断14种高危型人乳头瘤病毒：如有ct值，即判定14种高危型人乳头瘤病毒阳性；如无ct值，即判定14种高危型人乳头瘤病毒阴性。
70.表2
71.程序循环次数温度时间是否采集荧光恒温163℃40min是
72.实施例4本发明的检测方法的特异性
73.采用实施例1的样本释放剂提取单纯疱疹病毒ⅰ型、人型支原体、淋病奈瑟菌和14种高危型人乳头瘤病毒样本(样本信息如表3所示)的核酸(98℃处理5min，用样本释放剂稀释至相应浓度)，按实施例2的反应体系和反应程序进行lamp扩增，通过ct值进行结果判断。
74.表3
75.样本名称品牌型号浓度单纯疱疹病毒ⅰ型计量院vip(bw)003110^5copies/ml人型支原体atcc3353010^5copies/ml淋病奈瑟菌atcc3142610^3个菌/mlhpv16中检院370060-20190110^5copies/mlhpv18中检院370060-20190110^5copies/mlhpv31菁良基因gw-ipf00410^5copies/mlhpv33菁良基因gw-ipf00510^5copies/mlhpv35菁良基因gw-ipf00610^5copies/mlhpv39中检院370060-20190110^5copies/mlhpv45菁良基因gw-ipf00910^5copies/mlhpv51菁良基因370060-20190110^5copies/mlhpv52菁良基因gw-ipf01010^5copies/mlhpv56中检院370060-20190110^5copies/mlhpv58菁良基因gw-ipf01110^5copies/mlhpv59菁良基因gw-ipf01210^5copies/mlhpv66菁良基因gw-ipf01310^5copies/mlhpv68菁良基因gw-ipf01410^5copies/ml
76.lamp扩增结果见表4和图1。
77.表4
78.[0079][0080]
图1和表4结果表明，单纯疱疹病毒ⅰ型、人型支原体和淋病奈瑟菌均无ct值，说明本发明检测方法的引物探针组合特异性好；hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66和hpv68第三方质控品其ct《36，说明本发明检测方法的引物组合能检测出14种高危型人乳头瘤病毒的相应型别。
[0081]
试验例1引物探针的筛选优化
[0082]
一、根据国内外相关文献报道，选择14种高危型人乳头瘤病毒的e6基因序列，基于lamp引物设计原则，在primerexplorerv5网站，将基因序列带入，设计引物序列，lamp探针根据primer express5.0.1软件设计，设计了3组引物探针组合(生工生物合成)，序列分别如下：
[0083]
第1组：
[0084]
hpv-lf1(seq id no.1):ctgtggtaactttctgggtcg
[0085]
hpv-lb1(seq id no.2):cagttactgcgacgtgaggt
[0086]
hpv-of1(seq id no.3):gcaccacaagagaactgc
[0087]
hpv-ob1(seq id no.4):agcttatggattcccatatc
[0088]
hpv-if1(seq id no.5):
[0089]
tgtttgcagctctgtgcataagtttcaggacccacagga
[0090]
hpv-ib1(seq id no.6):
[0091]
agaatgtgtgtactgcaagcaatcccgaaaagcaaagtcat
[0092]
hpv-p1(seq id no.7):fam-caactatacatgagataat-bhq1
[0093]
第2组：
[0094]
hpv-lf2(seq id no.8):actgaagtaactaaggaaggtac
[0095]
hpv-lb2(seq id no.9):aaatagcctgggaggtaac
[0096]
hpv-of2(seq id no.10):ggtaactttctgggtcgctcc
[0097]
hpv-ob2(seq id no.11):agttactgcgacgtgaggtat
[0098]
hpv-if2(seq id no.12):
[0099]
gcagttagtgtaattttgcaaagcttttaaggaatatgtacgtcathpv-ib2(seq id no.13):
[0100]
attcagatattttggaggactggctcctgtaaactggcagac
[0101]
hpv-p2(seq id no.14):fam-cacagagctgcaaacaactat-bhq1
[0102]
第3组：
[0103]
hpv-lf3(seq id no.15):tgcaccacaagagaactg
[0104]
hpv-lb3(seq id no.16):agcatatggattcccatctc
[0105]
hpv-of3(seq id no.17):ggtaactttctgggtcgctcc
[0106]
hpv-ob3(seq id no.18):cagttactgcgacgtgaggt
[0107]
hpv-if3(seq id no.19):
[0108]
gcagctctgtgcataactgtcaatgtttcaggacccaca
[0109]
hpv-ib3(seq id no.20):
[0110]
agaatgtgtgtactgcaagcaatcccgaaaagcaaagtcat
[0111]
hpv-p3(seq id no.21):fam-tagaatgtgtgtactgcaagc-bhq1
[0112]
二、荧光定量pcr进行lamp扩增，检测3组引物探针的扩增效率
[0113]
1、采用申请人自行合成的质粒序列(按常规方法进行合成)作为待测样本，质粒信息如表5。
[0114]
表5
[0115]
样本名称类型浓度hpv16质粒10^4copies/mlhpv18质粒10^4copies/mlhpv31质粒10^4copies/mlhpv33质粒10^4copies/mlhpv35质粒10^4copies/mlhpv39质粒10^4copies/mlhpv45质粒10^4copies/mlhpv51质粒10^4copies/mlhpv52质粒10^3copies/mlhpv56质粒10^4copies/mlhpv58质粒10^4copies/mlhpv59质粒10^4copies/mlhpv66质粒10^4copies/mlhpv68质粒10^4copies/ml
[0116]
2、pcr扩增体系配制同实施例表1。
[0117]
3、使用abi的quantstudio q5型号的荧光定量pcr仪，进行lamp扩增，扩增程序同实施例表2。
[0118]
三、结果分析
[0119]
lamp扩增结果通过ct值进行判断，结果如表6和图2～4所示。
[0120]
表6
[0121]
hpv型别引物探针组1引物探针组2引物探针组31661781888noct31101711331225noct358171439111210451226noct517152552813noct561426265888noct591614316681733681318noctntcnoct33noct
[0122]
从表6和图2～4结果可知，引物探针组2的ntc均有ct值，说明其引物探针组合特异性差，而引物探针1的ntc无ct值且hpv的其它亚型均能检出。
[0123]
试验例2本发明的检测方法和传统lamp荧光法的特异性比较
[0124]
选择某三甲医院收集的10例hpv14型阴性临床样本，通过takara病毒提取试剂盒提取dna，分别采用本发明的检测方法和传统lamp荧光法进行检测，pcr扩增体系如表7所示，扩增体系同试验例1，仪器选择abi的quantstudio q5型号的荧光定量pcr仪进行。
[0125]
表7
[0126][0127]
试验结果通过ct值进行判断。扩增结果见表8和图5～6。
[0128]
表8
[0129]
样本类型本发明检测方法传统lamp荧光法阴性样本1noctnoct阴性样本2noct27阴性样本3noctnoct阴性样本4noctnoct阴性样本5noctnoct阴性样本6noctnoct阴性样本7noct36阴性样本8noct28阴性样本9noctnoct阴性样本10noctnoct
[0130]
根据表8和图5～6的结果，传统lamp荧光法检测10例阴性临床样本，有3例检出阳性，说明lamp荧光法在测试时产生假阳性，其特异性差，而采用本发明的检测方法检测10例阴性临床样本，样本全为阴性，说明其特异性好。
[0131]
试验例3本发明的核酸释放剂的效果验证
[0132]
选择10例某三甲医院收集的14种高危型人乳头瘤病毒阳性临床样本，充分混匀后，平均分成4份，分别采用表9的核酸释放剂方案1、方案2、方案3和takara核酸提取试剂提取dna(核酸释放剂方案1、方案2、方案3，采用98℃5min处理提取dna，takara核酸提取试剂根据说明书操作进行dna提取)，再进行lamp扩增(扩增程序同试验例1)，比较对不同方案核酸释放剂提取的dna的扩增效果。
[0133]
表9
[0134]
序号名称作用方案1方案2方案31chelex-100病毒释放剂2.5％5％10％2tcep稳定剂1m0.5m1m3licl促进剂1m2m4m4edta核酸酶抑制剂0.75m1.5m3m
5sds灭活剂0.025％0.05％0.1％6tween-20病毒释放剂1％2％4％7np40病毒释放剂1％2％4％
[0135]
lamp扩增结果见表10和图7～10所示。
[0136]
表10
[0137]
样本类型方案1方案2方案3takara提取阳性样本118151714阳性样本221142522阳性样本32218noct17阳性样本4noct191815阳性样本520171714阳性样本623181818阳性样本717202116阳性样本824212015阳性样本926181618阳性样本10noct191716
[0138]
根据表10和图7～10结果可知，核酸释放剂方案1和方案3均有样本漏检，而方案2和takara提取试剂无样本漏检且ct值差别不大，说明方案2配方的核酸释放剂与takara试剂提取效率一致，满足hpv临床样本dna提取要求。
[0139]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0140]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂，其特征在于，其由包括以下浓度的组分组成：chelex-1004.8wt％～5.2wt％，tcep 0.48m～0.52m，licl 1.8m～2.2m，edta 1.3m～1.7m，sds 0.04wt％～0.06wt％，tween-201.8wt％～2.2wt％，np401.8wt％～2.2wt％。2.根据权利要求1所述的用于同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的核酸释放剂，其特征在于，其由包括以下浓度的组分组成：chelex-1004.9wt％～5.1wt％，tcep 0.49m～0.51m，licl 1.9m～2.1m，edta 1.4m～1.6m，sds 0.05wt％，tween-201.9wt％～2.1wt％，np401.9wt％～2.1wt％。3.一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，包括：核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示的引物、核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示的引物、核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示的引物、以及核苷酸序列如seq id no.7所示的探针。4.根据权利要求3所述的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团，3'修饰有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq1。5.根据权利要求3或4所述的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示的引物的工作浓度为250nm～350nm，所述核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示的引物的工作浓度为62.5nm～87.5nm，所述核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示的引物的工作浓度为125nm～175nm。6.根据权利要求5所述的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示的引物的工作浓度为280nm～320nm，所述核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示的引物的工作浓度为70nm～80nm，所述核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示的引物的工作浓度为145nm～155nm。7.根据权利要求3所述的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no.7所示的探针的工作浓度为62.5nm～87.5nm；优选为70nm～80nm。8.一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸释放剂和权利要求3～7任一项所述的引物探针组合。9.一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：在待测样本中加入权利要求1或2所述的核酸释放剂，于96℃～99℃放置4min～6min，即得待测样本dna；再使用权利要求3～7任一项所述的引物探针组合对待测样本dna进行lamp扩增。10.根据权利要求9所述的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法，其特征在于，所述lamp扩增的反应体系包括：2
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lamp premix buffer 25μl，bst dna聚合酶2μl，引物探针混合液5.25μl，荧光染料syto-92μl，样本dna 5μl，ddh2o 10.75μl；和/或所述lamp扩增的反应程序为：62℃～64℃恒温55min～65min。

技术总结
本发明公开了一种同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合及方法，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示的引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示的引物、以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。本发明的同时检测14种高危型人乳头瘤病毒的方法，通过采用免核酸提取的核酸释放剂得到待测样本的核酸，再利用特异性引物探针组合，实现了可以快速、高特异性地同时检测14种高危型人乳头瘤病毒，具有广阔的应用前景。前景。前景。


技术研发人员：唐伟 李江峰 梅哲
受保护的技术使用者：广州万孚生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/10/19