一种可实时动态监测AMPK活性的肝癌细胞株及其应用的制作方法

一种可实时动态监测ampk活性的肝癌细胞株及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种可实时动态监测ampk活性的肝癌细胞株及其应用。


背景技术：

2.单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine 5
’‑
monophosphate activated protein kinase，ampk)是由α催化亚基与β、γ两个调节亚基构成的异源三聚体复合物。在哺乳动物中，α亚基具有两个亚型，分别由prkaa1或prkaa2基因编码；而β、γ亚基则由prkab、prkag基因编码，分别有两个和三个亚型。
3.ampk是细胞内能量稳态的主要调节因子，其在时间和空间上的选择性调控是维持能量稳态的关键。越来越多的证据表明，ampk在肿瘤等代谢异常相关疾病的发生发展过程中发挥重要作用，并且与抗肿瘤药物疗效密切相关。对于肝细胞癌而言，ampk在其发生发展过程中发挥作用，有研究揭示了ampk作为抑癌因子抑制肝细胞癌进展，但也有证据表明ampk促进了肝细胞癌的发生发展。因此，ampk不能简单地被定义为肿瘤抑制因子，其作为多条信号通路关联的枢纽，可以被微环境、遗传或表观遗传变异、细胞能量与功能状态等多种内在和外在因素调节，从而导致肿瘤细胞适应性生存或死亡。
4.ampk在肿瘤发生发展过程中发挥的作用很可能与其活性的动态变化以及活化时长相关。并且，ampk活性与肿瘤细胞的药物敏感性密切相关，因此，开发监测ampk实时活性的工具和方法，对于研究肿瘤细胞的耐药性机制，进而克服抗肿瘤药物耐药性问题具有重大意义。此外，ampk实时活性检测技术也有助于ampk靶向药物在肿瘤治疗中的药理机制研究。然而，传统分子生物学手段不能实时动态测量ampk活性变化，并且，要实现活细胞内ampk活性时空变化监测的准确性和实时性，要求细胞能够稳定高表达ampk活性报告器，同时还要求细胞能够保持正常人源细胞的特性，而目前尚未报道过可精确测量肝癌细胞中ampk活性实时动态变化的工具。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中尚无可精确测量肝癌细胞中ampk活性实时动态变化的工具的技术问题，本发明提供了一种可实时动态监测ampk活性的肝癌细胞株及其应用。该肝癌细胞株能够较为准确地监测活的肝癌细胞内ampk活性的实时动态变化，因而能够用于研究ampk靶向药物治疗肝癌的药理机制，以及肝癌细胞的耐药性机制和对策。
6.本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一种可实时动态监测ampk活性的肝癌细胞株，所述肝癌细胞株命名为人肝源细胞huh7-ahie8 p32，已在2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:63541。
7.本发明团队在将特定的ampk活性报告器ampkar2导入到huh7肝癌细胞系中后，经过多次筛选，偶然获得了一株与原始细胞系的形态无差异的细胞株——huh7-ahie8 p32，
发现其保留了原始肝癌细胞系的特性，又能够稳定表达ampk活性报告器，且具有较高的表达量，因而能够用于监测活的肝癌细胞内ampk活性的实时动态变化，并使监测结果具有较高的准确性。
8.第二方面，本发明提供了所述肝癌细胞株在实时动态监测肝癌细胞内ampk活性中的应用。
9.作为优选，所述应用包括以下步骤：利用所述肝癌细胞株，基于荧光共振能量转移原理和高内涵成像技术，实时动态监测肝癌细胞内ampk活性。
10.作为优选，所述应用具体包括以下步骤：(1)对huh7-ahie8 p32细胞进行持续高内涵荧光显微镜成像，获取多个时间点的mturquoise2和ypet通道的荧光强度；(2)选取多个细胞，分别计算单细胞内mturquoise2和ypet通道在每个时间点的平均荧光强度值，减去各通道在相应时间点的背景荧光强度，获得各时间点单细胞内mturquoise2和ypet的荧光强度；(3)根据以下公式，计算各时间点的ampk指数：
11.本发明中，基于荧光共振能量转移原理和高内涵成像技术，检测在不同时间点，huh7-ahie8 p32细胞内mturquoise2和ypet的荧光强度，再据此计算出ampk指数。得到的ampk指数与受、供体荧光强度比值一致，能够用来表征ampk活性的相对变化。
12.进一步地，步骤(2)中，单细胞内mturquoise2和ypet通道在每个时间点的平均荧光强度值通过以下方式获取：选取多个细胞，在每个细胞的细胞质中随机手动圈选出1个区域，然后检测区域内的荧光强度，分别计算单细胞内mturquoise2和ypet通道在每个时间点的平均荧光强度值；或者，选取多个细胞，采用半自动高通量的分析方法，自动分割和追踪单细胞，然后分析单细胞内的整体荧光强度，分别计算单细胞内mturquoise2和ypet通道在每个时间点的平均荧光强度值。
13.进一步地，步骤(1)中，在进行持续高内涵荧光显微镜成像的过程中，用适合青色荧光蛋白(cyan fluorescence protein)的激发光波段激发细胞，分别在青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白(yellow fluorescence protein)的合适发射光波段收集发射光，即为mturquoise2和ypet通道的荧光强度。
14.进一步地，所述适合青色荧光蛋白的激发光波段为438/29nm滤光片滤过的蓝光；所述青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的合适发射光波段分别为483/32nm和562/40nm滤光片滤过后的发射光波段。
15.进一步地，步骤(1)中，在进行持续高内涵荧光显微镜成像前，所述huh7-ahie8 p32细胞培养在玻璃底培养板中。
16.进一步地，步骤(1)中，在进行持续高内涵荧光显微镜成像前，使用pbs缓冲液对huh7-ahie8 p32细胞进行轻缓洗涤。
17.通过pbs缓冲液轻缓洗涤，能够减少细胞碎片，避免其影响后续的图像分析。此外，当需要研究特定培养条件下肝癌细胞内ampk活性的实时动态变化情况时，通过pbs缓冲液
轻缓洗涤，还能够去除前期培养时所用的培养基，在洗涤后可更换所需研究的培养条件。
18.第三方面，本发明提供了所述肝癌细胞株在检测肝癌细胞内ampk激活持续时长中的应用。
19.基于对肝癌细胞内ampk活性的实施动态监测，能够获得ampk激活持续时长，该指标可作为肝癌细胞获得性耐药的观测指标，有助于研究肝癌细胞对ampk靶向药物的耐药性机制及对策，此外还有助于研究ampk靶向药物在肝癌治疗中的药理机制。
20.作为优选，所述应用包括以下步骤：(i)利用所述肝癌细胞株，获得ampk指数随时间变化的折线图；(ii)在步骤(i)获得的折线图中，将ampk指数开始从最大值下降的时间点定义为ampk指数连续下降的起始点，从起始点开始，寻找相邻两个时间点之间折线段斜率变化最大的转折点，即为ampk的去激活点；(iii)计算去激活点与起始点的时间差，即为ampk激活持续时长。
21.进一步地，步骤(ii)中，所述寻找相邻两个时间点之间折线段斜率变化最大的转折点的方法如下：计算相邻两个时间点之间折线段的斜率k；当k》0时，将k重新赋值为零；当k《0时，k值保持不变；寻找相邻两个折线段的k值变化最大处，这两个折线段之间的拐点即为ampk的去激活点。
22.通过在k》0时，将k重新赋值为零，能够避免ampk指数上升过程中出现大幅度斜率变化而对分析结果造成影响。
23.进一步地，步骤(ii)中，在寻找相邻两个时间点之间折线段斜率变化最大的转折点的过程中，对于折线图中ampk指数先轻微下降又重新上升的拐点，该点不是所需的去激活点：判断该点之后的1～2个时间点的范围内是否出现ampk指数的明显上升，若出现，则以该点为起始点，再次分析该时间点后斜率变化最大的转折点作为去激活点。
24.对于曲线中ampk指数先轻微下降又重新上升的区域，该点不是所需的去激活点，因此需要通过上述方法排除这个微小的“降落”对分析结果带来的影响。
25.进一步地，步骤(i)具体包括以下步骤：(i)对huh7-ahie8 p32细胞进行持续高内涵荧光显微镜成像，获取多个时间点的mturquoise2和ypet通道的荧光强度；(ii)选取多个细胞，分别计算单细胞内mturquoise2和ypet通道在每个时间点的平均荧光强度值，减去各通道在相应时间点的背景荧光强度，获得各时间点单细胞内mturquoise2和ypet的荧光强度；(iii)根据以下公式，计算各时间点的ampk指数：
26.第四方面，本发明提供了所述肝癌细胞株在研究肝癌细胞耐药性中的应用，所述研究肝癌细胞耐药性为研究肝癌细胞的耐药性机制或研究克服肝癌细胞耐药性的策略。
27.肝癌细胞对ampk靶向药物的耐药性，可能与ampk活性的动态变化以及ampk激活持续时长相关，利用肝癌细胞株huh7-ahie8 p32能够揭示两者之间的关系，因而有助于研究肝癌细胞的耐药性机制，并在此基础上，进一步研究克服肝癌细胞耐药性的策略。
28.例如，索拉非尼诱导的细胞内葡萄糖代谢重编程由ampk介导，并且是肝细胞癌对索拉非尼敏感性降低的重要机制之一。然而，索拉非尼治疗肝细胞癌时，ampk活性动态变化过程未见报道，且目前，ampk活性与索拉非尼抗肿瘤疗效及糖酵解过程之间的关联仍然存在争议，肝癌细胞受索拉非尼处理后，细胞内ampk的活性动力学及其与药物敏感性间的关系尚不清楚。本发明利用huh7-ahie8 p32细胞株，通过对单细胞内ampk实时活性的监测，证实了在索拉非尼诱导的代谢应激下，肝癌细胞ampk活性呈现动态变化，糖酵解与ros分别正向或负向调节激活持续时长，揭示了缩短ampk激活的持续时长可在一定程度上提高肝细胞癌对索拉非尼的敏感性，暗示ampk的激活时长在肝癌细胞获得性耐药中的重要作用，并且，联合应用糖酵解抑制剂和索拉非尼可增加肝癌细胞对索拉非尼的敏感性，有望成为治疗肝细胞癌的新型用药策略。
29.第五方面，本发明提供了所述肝癌细胞株在研究ampk靶向药物治疗肝癌的药理机制中的应用。
30.ampk靶向药物治疗肝癌的机制可能与ampk活性的动态变化以及ampk激活持续时长相关，因此，利用肝癌细胞株huh7-ahie8 p32研究两者之间的相关性，有助于研究ampk靶向药物治疗肝癌的药理机制。
31.与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明提供的肝癌细胞株huh7-ahie8 p32能够作为实时动态监测活的肝癌细胞中ampk活性的工具，且具有较高的准确性，因而对于研究ampk靶向药物治疗肝癌的药理机制，以及肝癌细胞的耐药性机制和对策具有重要意义。
附图说明
32.图1为a-769662和碘乙酸钠处理对ampk活性的影响。其中，图1a～1c分别为huh7-ahie8 p32细胞在“0min”时刻接受空白对照(图1a)、a-769662(图1b)和碘乙酸钠(图1c)处理前后单细胞内ampk指数变化；图1d为acc磷酸化水平的westemn blot检测结果，“p-acc”为磷酸化acc，“t-acc”为总acc。
33.图2为葡萄糖对索拉非尼处理下肝癌细胞活力和死亡情况的影响。其中，图2a为不同葡萄糖浓度下索拉非尼对细胞活力的影响，结果表示为以相应葡萄糖浓度下未进行索拉非尼处理的细胞活力为基准时的百分比；图2b为25mmol/l葡萄糖浓度下10μmol/l索拉非尼单独或与化合物c联合使用对细胞活力的影响，结果表示为以该葡萄糖浓度下未进行索拉非尼处理的细胞活力为基准时的百分比；图2c为不同葡萄糖浓度下索拉非尼单独或与化合物c联用诱导的细胞死亡情况。图2a和2b中，数据以平均值
±
标准差表示，n＝3，“***”指p《0.001。
34.图3为葡萄糖对索拉非尼处理下ampk活性实时动态变化的影响。其中，图3a～3d分别为huh7-ahie8 p32细胞在0mmol/l(图3a)、2.5mmol/l(图3a)、5mmol/l(图3a)和25mmol/l(图3d)葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受10pμmol/l索拉非尼处理前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图3e为图3a～3d中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示索拉非尼加入的时间点，“sfb”指索拉非尼(sorafenib，sfb)；图3f为不同葡萄糖浓度下索拉非尼持续激活ampk的时长，“平均值”指ampk激活持续时长的平均值，“数值”指单细胞ampk激活持续时
长，“***”指p《0.001。
35.图4为在不同葡萄糖浓度的培养条件下，huh7-ahie8 p32细胞在索拉非尼处理前后经背景校正后ypet与mturquoise2的荧光强度的比值在细胞上的投射。其中，
“‑
36”为索拉非尼加入前36分钟，“27”、“87”、“147”、“177”分别为索拉非尼加入后第27、87、147、29、177分钟。
36.图5为ampk激活持续时长与ampkar2表达水平的相关性。图5a为不同葡萄糖浓度下ampk激活时长与索拉非尼加入前36min时的ypet荧光强度(即基础ypet荧光强度)的相关性；图5b为不同葡萄糖浓度下ampk激活时长与索拉非尼加入后27min时ypet荧光强度的相关性。
37.图6为不同葡萄糖浓度下dmso对ampk活性(ampk指数)实时动态变化的影响。其中，图6a～6d分别为huh7-ahie8 p32细胞在0mmol/l(图6a)、2.5mmol/l(图6b)、5mmol/l(图6c)和25mmol/l(图6d)葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受dmso处理前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图6e为图6a～6d中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示dmso加入的时间点。
38.图7为huh7-ahie8 p32细胞在25mmol/l葡萄糖浓度下于“0min”时刻接受10μmol/l索拉非尼处理前后单细胞内的ampk指数变化。在此处理条件下选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图，且标记死亡细胞及死亡时间点。其中，曲线末端的菱形方块表示细胞死亡时间点。
39.图8为葡萄糖对huh7-ahie8 p32细胞糖酵解速率的影响。其中，图8a为0mmol/l或25mmol/l葡萄糖浓度下10μmol/l索拉非尼处理前后huh7-ahie8 p32细胞ocr随时间的变化；图8b为图8a葡萄糖浓度下，索拉非尼处理前的耗氧率(即基础耗氧率)；图8c为0mmol/l或25mmol/l葡萄糖下，10μmol/l索拉非尼处理前后huh7-ahie8 p32细胞胞外酸化率随时间的变化；图8d为图8c葡萄糖浓度下，索拉非尼处理前的胞外酸化率，即基础胞外酸化率。图8a和8c中，箭头表示相应试剂加入的时间点；图8b和8c中，“n.s”指无统计学差异，“***”指p《0.001。
40.图9为葡萄糖和2-dg对索拉非尼诱导的糖酵解速率变化的影响。其中，图9a为dmso或10μmol/l索拉非尼和25mmol/l葡萄糖或25mmol/l 2-dg处理下huh7-ahie8 p32细胞ocr随时间的变化；图9b为dmso或10μmol/l索拉非尼和25mmol/l葡萄糖或25mmol/l2-dg处理下huh7-ahie8 p32细胞ecar随时间的变化。图9a和9b中，数据以平均值
±
标准差表示，n＝3，箭头表示相应药物加入的时间点。
41.图10为2-dg对高糖下索拉非尼处理后ampk活性动态变化的影响。其中，图10a～10c分别为huh7-ahie8 p32细胞在25mmo/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受10μmol/l索拉非尼处理约30min，而后加入空白对照(图10a)、25mmol/l(图10b)或100mmol/l(图10c)2-dg，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图10d为图10a～10c中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点；图10e为不同2-dg浓度下索拉非尼持续激活ampk的时长，“平均值”指ampk激活持续时长的平均值，“数值”指单细胞ampk激活持续时长，“**”指p《0.01，“***”指p《0.001。
42.图11为2-dg对高糖下dmso处理后ampk活性动态变化的影响。其中，图11a～11c分
别为huh7-ahie8 p32细胞在25mmol/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受dmso处理约30min，而后加入空白对照(图11a)、25mmol/l(图11b)或100mmol/l(图11c)2-dg，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图11d为图11a～11c中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点。
43.图12为2-dg对索拉非尼诱导的acc磷酸化水平变化的影响。其中，图12a为western blot检测huh7-ahie8 p32细胞在高糖培养条件下接受10μmmol/l索拉非尼处理15min或120min，以及相同浓度索拉非尼预处理30min后与2-dg(25或100mmol/l)联合处理90min时acc位点的磷酸化；图12b为细胞磷酸化acc与总acc含量的比值。图12a和12b中，“p-acc”为磷酸化acc，“t-acc”为总acc；图12b中，“n.s.”表示无统计学差异，“***”指p《0.001。
44.图13为补充葡萄糖对无糖下索拉非尼处理后ampk活性动态变化的影响。其中，图13a～13c分别为huh7-ahie8 p32细胞在0mmol/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受10μmol/l索拉非尼处理约30min，而后加入空白对照(图13a)、12.5mmol/l(图13b)或25mmol/l(图13c)葡萄糖，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图13d为图13a～13c中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点；图13e为不同葡萄糖补充浓度下索拉非尼持续激活ampk的时长，“平均值”指ampk激活持续时长的平均值，“数值”指单细胞ampk激活持续时长，“n.s.”表示无统计学差异，“***”指p《0.001。
45.图14为补充葡萄糖对低糖下索拉非尼处理后ampk活性动态变化的影响。其中，图14a～14c分别为huh7-ahie8 p32细胞在2.5mmol/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受10μmol/l索拉非尼处理约30min，而后加入空白对照(图14a)、10mmol/l(图14b)或22.5mmol/l(图14c)葡萄糖，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图14d为图14a～14c中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点。
46.图15为葡萄糖对索拉非尼诱导的acc磷酸化水平变化的影响。其中，图15a为westerm blot检测huh7-ahie8 p32细胞在低糖培养条件下接受10μmo/l索拉非尼处理15min或120min，以及相同浓度索拉非尼预处理30min后补充葡萄糖(10或22.5mmol/l)处理90min时acc位点的磷酸化；图15b为细胞磷酸化acc与总acc含量的比值。图15a和15b中，“p-acc”为磷酸化acc，“t-acc”为总acc；图12b中，“n.s.”表示无统计学差异，“**”指p《0.01，“***”指p《0.001。
47.图16为补充葡萄糖对无糖和低糖下dmso处理后ampk活性动态变化的影响。其中，图16a～16c分别为huh7-ahie8 p32细胞在0mmol/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受dmso处理约30min，而后加入空白对照(图16a)、12.5mmol/l(图16b)或25mmol/l(图16c)葡萄糖，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图16d为图16a～16c中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点；图16e～16g分别为huh7-ahie8 p32细胞在2.5mmol/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受dmso处理约30min，而后加入空白对照(图16a)、10mmol/l(图16b)或22.5mmol/l(图16c)葡萄糖，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化
绘图；图16h为图16e～16g中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点。
48.图17为索拉非尼处理下糖酵解对肝癌细胞活力的影响。其中，图17a为25mmol/l葡萄糖浓度下25或100mmol/l 2-dg对10μmol/l索拉非尼预处理30min后huh7-ahie8 p32细胞活力的影响，结果表示为以相应葡萄糖浓度下未进行索拉非尼处理的细胞活力为基准时的百分比；图17b为2.5mmol/l葡萄糖浓度下10或22.5mmol/l葡萄糖对10μmol/l索拉非尼预处理30min后huh7-ahie8 p32细胞活力的影响，结果表示为以相应葡萄糖浓度下未进行索拉非尼处理的细胞活力为基准时的百分比。图17a和17b中，数据以平均值
±
标准差表示，n＝3，“***”指p《0.001。
49.图18为索拉非尼对肝癌细胞ros水平的影响。
50.图19为trolox对高糖下ampk活性的影响。其中，图19a和19b分别为huh7-ahie8p32细胞在25mmo/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受dmso处理约30min，而后加入空白对照(图19a)、2mmol/l trolox(图19a)，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图19c为图19a和19b中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点。
51.图20为第29代和第20代huh7-ahie8 p32细胞内的绿色荧光强度。其中，“p20huh7-ahie8 p32”和“p29 huh7-ahie8 p32”分别指huh7-ahie8 p32细胞株第20和29代，“huh7 with no ampkar2”指未导入ampkar2的huh7细胞。
52.图21为trolox对高糖下索拉非尼处理后ampk活性动态变化和肝癌细胞活力的影响。其中，图21a～21c分别为huh7-ahie8 p32细胞在25mmol/l葡萄糖浓度培养条件下，于“0min”时刻接受10μmol/l索拉非尼处理约30min，而后加入空白对照(图21a)、2mmol/ltrolox(图21b)，或于“0min”时刻接受10μmol/l索拉非尼与2mmol/l trolox共同处理(图21c)，该过程前后单细胞内ampk指数变化，每种处理条件选择了99个区域即99个单细胞并基于各细胞ampk指数随时间点变化绘图；图21d为图21a～21c中ampk指数的均值和95％置信区间，箭头表示相应试剂加入的时间点；图21e为各处理条件下索拉非尼持续激活ampk的时长及分布，“平均值”指ampk激活持续时长的平均值，“数值”指单细胞ampk激活持续时长；图21f为2mmol/ltrolox在10μmol/l索拉非尼预处理30min后加入或与索拉非尼同时加入对hub7细胞活力的影响，结果表示为以25mmol/l葡萄糖浓度下未进行索拉非尼处理的细胞活力为基准时的百分比，数据以平均值
±
标准差表示，“n.s.”表示无统计学差异，“*”指p《0.05，“**”指p《0.01。
具体实施方式
53.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
54.总实施例一种可实时动态监测ampk活性的肝癌细胞株，所述肝癌细胞株命名为人肝源细胞huh7-ahie8 p32，已在2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no:63541。
55.所述肝癌细胞株在实时动态监测肝癌细胞内ampk活性中的应用。
56.作为一种具体实施方式，所述应用包括以下步骤：利用所述肝癌细胞株，基于荧光
test(两组)及one-way anova(三组及以上)方法进行分析。数据均以平均值和标准差(mean土sd)显示。当所得p值小于0.05时，认为两组之间具有显著性差异(*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001)。所有实验均在相同条件下重复三次。
66.实施例1：细胞株的构建人肝细胞癌细胞系huh7购买于国家实验细胞资源共享服务平台(tp://www.cellresource.cn/)，并依照平台建议进行培养、传代及冻存操作。
67.huh7细胞以2.5
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105个/孔密度接种于6孔细胞培养板内进行扩大培养后，使用jetprime转染试剂，按照厂家的说明书进行转染。以2:1的比例混合ppbj-puro-ampkar2-nes(由professor john albeck from university of california davis提供)和pcmv-hypbase质粒(由the wellcome sanger institute提供)，按照每孔2μg dna、200μl转染缓冲液、4μl转染试剂将其依次混匀，室温孵育10min后，将混合液以200μl/孔呈滴状加入孔中，混匀，培养4小时后更换为新的生长培养基。继续培养48小时，用嘌呤霉素处理以筛选稳定表达ampkar2的huh7多克隆细胞群。由于多克隆细胞群存在较大荧光强度差异，故接下来使用流式细胞仪检测单细胞ypet荧光强度并将ampkar2高表达细胞以1个/孔分选至96孔培养板内，培养14天，根据单克隆细胞株圆形致密的形态特征挑选出单克隆细胞株，消化后进一步于24孔培养板、6孔培养板、10cm培养盘中扩增，经筛选后，获得一株高表达ampkar2且与原始细胞系的形态无差异的单克隆细胞株，命名为人肝源细胞huh7-ahie8 p32，已在2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:63541。
68.实施例2：利用huh7-ahie8 p32细胞株进行ampk活性实时动态监测的方法2.1细胞培养细胞培养在补充1％青霉素链霉素溶液、10％胎牛血清的高糖dmem即生长培养基中。当细胞在37℃，5％ co2的培养箱中培养至密度达85％，使用胰蛋白酶-edta消化液消化3～5min，800rpm离心3min收集后，按1:4～1:6进行传代或以相应密度接种在不同类型的培养板上。细胞在后续实验中，均需先在生长培养基中预培养24小时，待预培养结束，将培养基更换为不含胎牛血清的同步化培养基，使细胞同步培养14小时，然后在药物处理前1或2小时更换为不同葡萄糖浓度、含25mmol/l羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)、无血清、无酚红的dmem培养基。
69.2.2高内涵荧光显微镜成像使用imagexpress micro confocal高内涵成像系统对huh7-ahie8 p32细胞进行成像。huh7-ahie8 p32细胞以9
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104个/孔密度均匀接种于24孔玻璃底培养板中，并按实施例1中的“2.1细胞培养”进行培养。拍摄前1小时，使用1
×
pbs缓冲液轻缓洗涤一次，以减少细胞碎片及残留的同步化培养基，再换入不同葡萄糖浓度的dmem(无血清，无酚红，含hepes)。在拍摄过程中，细胞均处于37℃、5％ co2环境中。基线拍摄持续约1小时，而后以4倍浓缩浓度沿孔板侧壁加入相关药物。为获得mturquoise2和ypet通道的荧光强度，用438/29nm滤光片滤过的蓝光激发细胞，分别收集483/32nm和562/40nm滤光片滤过后发射光。每6分钟采集一次图像。由于采用人工给药方式，且药物加入后需重新聚焦，所以加药后的图像采集间隔时间为15～30分钟。
70.2.3图像分析使用软件fiji(2.3.0)对2.2中获得的图像序列进行分析。在获取ampk指数随时间
变化的实验中，根据荧光通道和时间点排列图像，校正抖动，在单个细胞的细胞质中随机圈选出1个区域。每种处理条件选取99个细胞即99个区域。计算所选区域中mturquoise2或ypet在每个时间点的平均荧光强度值，减去各荧光通道对应时间点的背景荧光强度，以获得单细胞内荧光强度信号的数据。ampk指数计算方法如下：计算mturquoise2与ypet的比值，乘(-1)，该值再加1，使每次实验大部分值为正数。
71.在获取荧光共振能量转移(forster or fluorescence resonance energy transfer，fret)比率的实验中，根据荧光通道和时间点排列图像，校正抖动，并扣除相应通道在相应时间点的背景荧光强度，并调节阈值以圈选出所有细胞胞质部分，再次清除此部分外所有背景信号，使用图像运算器计算细胞质中ypet与mturquoise2荧光强度的比值并根据比值赋予伪彩，从而得到比率图。
72.2.4ampk激活持续时长分析利用matlab(r2020b)软件分析索拉非尼诱导的ampk激活持续时长。基于分析huh7-ahie8 p32细胞胞质的荧光比值，得到不同实验条件下细胞的ampk活性(即ampk指数)随时间变化的折线图(由2.3中获得)。在这些折线图中，将ampk指数开始从最大值下降的时间点定义为ampk指数连续下降的起始点。ampk在该点的去激活将会导致相邻时间点间的ampk指数值有显著的下降，因此，从ampk指数-时间曲线中提取ampk失活点(即拐点)的过程中，计算各相邻时间点间折线段所对应的斜率，即假设ti时间点的ampk指数值为ai，t
i+1
时间点的ampk指数值为a
i+1
，斜率k表示为k＝(a
i+1-ai)/(t
i+1-ti)。分析过程的重点在于ampk的连续下降，因此k》0时，将k重新赋值为零；当k《0时，斜率值保持不变。在整个记录时间范围内寻找斜率变化的最大值，斜率变化最大的转折点即为ampk的去激活点。对于曲线中ampk指数先轻微下降又重新上升的区域，该点不是所需的去激活点，因此需要排除这个微小的“降落”对分析结果带来的影响：判断该点之后的1～2个时间点的范围内是否出现ampk指数的明显上升，若出现，则以该点为起始点，再次分析该时间点后斜率变化最大所对应的转折点。ampk激活持续时长则是去激活点与起始点的时间差。对于ampk值未出现连续下降的曲线，将激活持续时长设置为最大成像时长。
73.在以下各实施例中，ampk活性的动态变化和激活持续时长的测定均按照本实施例中的方法进行。
74.实施例3：huh7-ahie8 p32用于ampk活性实时动态监测的效果为了观测ampk在肝细胞癌单细胞中的实时活性，分别使用ampk变构激活剂a-769662(剂量为100μmol/l)和糖酵解抑制剂碘乙酸钠(剂量为300μmol/l)作为阳性对照药物来处理huh7-ahie8 p32细胞，对照组采用dmso。
75.根据ampk指数，对ampk活性进行定量——ampk指数与受、供体荧光强度比值一致，并与ampk的活性成正比，因此，使用该指标来计算ampk活性的相对变化。为了在单个细胞及细胞群体水平检测ampk实时活性，在单个细胞胞质内随机圈出一个区域，检测该区域的平均受、供体荧光强度和计算ampk指数，并通过折线图展示ampk指数随时间的变化趋势(见图1)。在每种处理条件下，汇总99个细胞的ampk指数-时间图以反映细胞群体的总体响应。结果表明：在药物处理前(“0min”前)，ampk指数相对稳定；与对照组(图1a)相比，huh7-ahie8 p32中ampk指数在受到两种药物处理15分钟时已升高(图1b和图1c)。
76.为了验证ampk指数反映了ampk的激酶活性，将实验组和对照组的huh7-ahie8p32
细胞在药物处理15min后，运用westemn blot测量ampk激酶底物乙酰辅酶a羧化酶(acety1-coa carboxylase,acc)的磷酸化水平。结果表明，a-769662和碘乙酸钠均使acc磷酸化增加(图1d)。
77.综上所述，本发明提供的huh7-ahie8 p32细胞株能够稳定高表达ampk活性报告器，以实现ampk活性的实时动态监测，并能反映出药物刺激下ampk活性的实时动态变化，结果具有较高的准确性。与传统western blot检测手段相比，利用该细胞株，可在活细胞中实时监测ampk活性，并可得到单个细胞ampk活性的动态变化，从而为探究ampk活性与细胞对药物反应的异质性是否相关提供机会。
78.实施例4：利用huh7-ahie8 p32研究肝癌细胞对索拉非尼的耐药性机制和对策4.1葡萄糖延长索拉非尼诱导的肝癌细胞中ampk激活持续时长4.1.1葡萄糖对索拉非尼处理下肝癌细胞活力和死亡情况的影响为了验证索拉非尼处理下，葡萄糖代谢与肝癌细胞药物敏感性相关并建立具有不同药物敏感性的肝癌细胞模型，检测了索拉非尼(剂量为10μmol/l)单独以及与ampk抑制剂化合物c(剂量为10μmol/l)联用处理2小时后，葡萄糖浓度(0～25mmol/l)与huh7-ahie8 p32细胞活力及细胞死亡的相关性。
79.细胞活力的测定方法如下：huh7-ahie8 p32细胞以1.2
×
104个/孔的密度均匀地接种到96孔板中心区域中，并按实施例2中的“2.1细胞培养”进行培养。边缘孔则封以100μl/孔1
×
pbs缓冲液。药物处理前2小时更换为不同葡萄糖浓度(0～25mmol/l)培养基。处理相应时间后，每孔加入1/10体积的cck-8试剂，混匀，于细胞培养箱中孵育1～2小时，用flexstation 3多功能酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活性的相对变化。
80.细胞死亡情况的检测方法如下：采用ebioscience
tm fixable viability dye efluor
tm 660染色方法检测细胞死亡情况。huh7-ahie8 p32细胞以3.5
×
105个/孔的密度均匀地接种到6孔板中，并按实施例2中的“2.1细胞培养”进行培养。药物处理前2小时更换为不同葡萄糖浓度(0～25mmol/l)培养基。在药物处理2小时后，消化并收集细胞于1.5ml离心管，使用1
×
pbs缓冲液洗涤细胞一次。使用1
×
pbs缓冲液将染色液稀释1000倍，以每组500μl体积加入，置于4℃中避光孵育30分钟。孵育完毕，使用1
×
pbs缓冲液洗涤后再次使用1
×
pbs溶液重悬。样品通过40μm细胞筛网过滤后立刻使用流式细胞仪检测荧光强度。由于在存活细胞中染料仅结合细胞表面蛋白，而在死亡细胞中，染料与细胞表面蛋白与内侧蛋白均可结合，因此，在630nm激发光照射下，死亡细胞在660nm处发射光强度增强。
81.细胞活力和死亡情况检测结果见图2。结果表明：索拉非尼处理时，高糖(25mmol/l)组huh7-ahie8 p32细胞的细胞活力比无糖或低糖(0或2.5mmol/l)组提高2～4倍(图2a)；且高糖组死亡细胞所占比例低于无糖或5mmol/l葡萄糖组(图2c)；此外，在5mmol/l或25mmol/l葡萄糖浓度下，索拉非尼与ampk抑制剂化合物c联合应用相比索拉非尼单独使用降低了细胞活力且加剧细胞死亡(图2b、2c)。上述结果表明，huh7-ahie8 p32细胞对索拉非尼的敏感性随葡糖糖浓度升高而降低，ampk在索拉非尼诱导的细胞损伤中起到保护作用，提示葡萄糖及ampk在肝癌细胞对索拉非尼的敏感性中发挥重要作用。
82.4.1.2葡萄糖对索拉非尼处理下ampk活性(ampk指数)实时动态变化的影响既往研究表明ampk可感知葡萄糖水平，也是调控葡萄糖代谢的重要因子之一，因此，对索拉非尼处理时，具有不同药物敏感性的肝癌细胞模型中ampk活性是否存在差异进行验证。利用索拉
非尼(剂量为10μmol/l)处理的huh7-ahie8 p32细胞模型，检测不同葡萄糖浓度下ampk活性的动态变化和激活持续时长。
83.在单细胞水平，索拉非尼处理约15分钟时ampk指数上升到最大值，并维持一段时间后下降；在同一葡萄糖浓度下，该动态变化过程呈现异质性，且在高糖组更显著(图3a～3d)。在总体水平，计算各组的ampk指数平均值(图3e)，结果显示无糖组ampk基础指数(索拉非尼加入前)高于含糖组，与文献报道的葡萄糖饥饿诱导ampk磷酸化水平升高的现象一致。此外，从图3e可以看出，ampk指数维持在最大值的时长与葡萄糖浓度正相关(由于说明书中不能有色彩，图3e中转化为灰度模式后，各曲线颜色差异不明显，从彩色原图中可明显得出上述结论)，由此，将该时长定义为ampk激活持续时长，并对其进一步统计，结果表明：在0、2.5、5和25mmol/l葡萄糖浓度下，ampk激活持续时长随葡萄糖浓度升高而增加，分别为43.8、69.5、82.8和119.5分钟，且各组间差异显著(p《0.001)(图3f)。综上所述，索拉非尼处理下ampk活性动态变化与葡萄糖浓度密切相关。
84.4.1.3葡萄糖对索拉非尼处理下ampk活性(fret比率)动态变化的影响为了进一步验证索拉非尼处理下ampk活性的细胞异质性，采用另一个量化指数fret比率(即受、供体荧光强度比值)，计算不同葡萄糖浓度下fret比率的动态变化并将其投射到细胞上，结果见图4。与ampk指数类似，fret比率升高提示ampk活化。与ampk指数量化结果一致，从图4可以看出：在索拉非尼加入前第36分钟时，fret比率维持在较低水平，且在不含葡萄糖组较高；在索拉非尼处理第27分钟时，各组fret比率均显著升高；在索拉非尼处理87分钟时，各组均有部分细胞ampk活性降低而另一部分细胞维持ampk激活状态；而当索拉非尼处理达177分钟时，大部分细胞ampk均去活化，仅高糖条件下存在维持ampk激活状态的细胞。综上所述，ampk激活时长与葡萄糖浓度成正相关，且在相同葡萄糖浓度下，ampk激活时长的细胞间异质性较明显。
85.4.1.4ampk激活持续时长与ampkar2表达水平的相关性为了探究ampk激活持续时长是否受ampkar2表达水平的调控，在单细胞水平，分别在索拉非尼(剂量为10μmol/l)处理前后分析了ypet荧光强度与ampk激活持续时长之间的相关性。结果表明：ampk激活的持续时长与ypet荧光强度无显著相关性(p》0.05)(图5)，说明持续时长与ampkar2的表达水平无关。
86.4.1.5不同葡萄糖浓度下dmso对ampk活性(ampk指数)实时动态变化的影响为了验证ampk活性动态变化受葡萄糖调控只在索拉非尼处理时发生，检测了dmso处理时不同葡萄糖浓度下ampk活性动态变化，结果见图6。结果表明：dmso加入时ampk指数发生一过性变化并迅速回到原水平，但整体而言，dmso处理均不改变ampk活化水平(图6a～6d)；此外，与索拉非尼处理组ampk基础指数在无葡萄糖时更高的现象相似，dmso处理时无糖组ampk活性更高(图6e)。
87.4.1.6ampk活性变化与细胞死亡的相关性为了分析ampk指数从最大值开始下降与细胞死亡的相关性，将这二者发生的时间点进行比较。其中，我们认为ampkar2荧光信号进入细胞核的时间为细胞死亡的时间点(因ampkar2有核排斥信号，在活细胞中其分布于胞质，若其进入细胞核，则提示核膜损伤和细胞死亡)。为了排除ampk指数从最大值下降是由细胞死亡导致的，将荧光进入细胞核的时间点即细胞死亡的时间点进行了标记。如图7所示，ampk活性下降(即曲线拐点)早于细胞死亡
dg(25或100mmol/l)会使其升高(图11b～11d)，这与预期一致，因为2-dg可通过抑制糖酵解和atp生成，从而激活ampk，并且2-dg处理下ampk的激活呈现持续性。此前发现，索拉非尼处理可激活ampk且维持一段时间(图10a、10d)，然而索拉非尼与2-dg联合应用则导致ampk激活持续时长缩短(图10b～10d)。因此，糖酵解对细胞维持索拉非尼诱导的ampk激活状态是必需的。
93.4.3.3 2-dg对索拉非尼诱导的acc磷酸化水平变化的影响进一步通过检测ampk下游靶点acc的磷酸化水平，来反映ampk在索拉非尼或索拉非尼与2-dg联合应用下的活性变化，结果见图12。结果表明：在dmso处理下，2-dg可增强acc的磷酸化水平，验证了糖酵解的抑制可增强ampk活性；索拉非尼单独处理15min或120min时磷酸化acc的比例显著增加，但处理120min时acc的磷酸化相比于15min无显著变化；索拉非尼预处理30min再与2-dg联合处理90min相比索拉非尼单独处理均显著降低了acc的磷酸化，甚至与相同时间条件下2-dg单独处理组相比，acc磷酸化的降低同样具有统计学意义，这提示部分细胞发生了ampk的去激活，ampk激活持续时长的缩短是2-dg和索拉非尼共同作用的结果，证实了糖酵解对细胞维持索拉非尼诱导的ampk激活状态是必需的。
94.4.3.4补充葡萄糖对无糖和低糖下索拉非尼和dmso处理后ampk活性动态变化的影响前面已经证实，高糖培养时应用2-dg可显著缩短索拉非尼诱导的ampk激活持续时长。随后，进一步探索在无糖以及低糖培养时，补充葡萄糖是否延长索拉非尼诱导的ampk激活持续时长。
95.无糖培养条件下，在索拉非尼预处理约30min时补充葡萄糖(12.5或25mmol/l)来促进糖酵解，并检测单个细胞内ampk的实时活性，结果见图13。结果表明：与索拉非尼单独处理相比，补充葡萄糖组细胞平均激活持续时长显著增加，且表现出较明显的细胞异质性(图13a～13d)。此外，12.5mmol/l葡萄糖组33.33％的细胞以及25mmol/l葡萄糖组23.23％的细胞ampk激活持续时长延长至220分钟以上(图13e)。综上，无糖培养时，补充葡萄糖以增强糖酵解过程，可延长索拉非尼诱导的ampk激活持续时长。
96.此外，低糖(2.5mmol/l)培养的细胞与无糖培养相比，补充葡萄糖后ampk活性变化过程相似(图14)，进一步证实葡萄糖的加入和其诱导的糖酵解增加是维持ampk激活的关键。
97.分别在无糖和低糖培养的细胞中依次添加dmso和葡萄糖，并检测ampk活性，结果见图16。结果表明：与对照组相比，补充葡萄糖可抑制ampk活性，提示葡萄糖的补充促进了糖酵解速率，促进atp生成，减少能量应激，从而抑制ampk活性(图16a～16d)。此外，单独索拉非尼处理可短暂激活ampk(图13a)。然而，索拉非尼处理和补充葡萄糖联合应用可显著延长ampk活化持续时间(图13b、13c)。由此可见，索拉非尼处理时，糖酵解过程对ampk活性的调控作用发生了逆转，其中的机制仍待进一步的研究。此外，在低糖培养的细胞中可得到相同结论(图16e～16h)。
98.4.3.5葡萄糖对索拉非尼诱导的acc磷酸化水平变化的影响western blot结果表明：在低糖条件下，索拉非尼可在15min内显著提高磷酸化acc的比例；然而当处理时长达120min时，acc磷酸化水平与无索拉非尼对照组不存在显著差异，且相比索拉非尼处理15min时显著降低，表明多数细胞已发生了ampk的去激活；当葡萄糖补充加入时，无论补充至12.5mmol/l或25mmol/l，acc在索拉非尼加入120min时仍呈现
高磷酸化水平，逆转索拉非尼单独处理相同时间下acc活性的降低(图15)。westemblot结果和ampk指数变化一致，共同证明在索拉非尼处理下，糖酵解维持了更长时间的ampk激活状态。
99.4.4增强糖酵解降低索拉非尼对肝癌细胞的杀伤作用为了探索肝癌细胞对索拉非尼敏感性与糖酵解水平的关系，采用了两种方法：高糖培养时依次添加索拉非尼和2-dg，或低糖培养时依次添加索拉非尼和葡萄糖，并检测细胞活力。细胞活力的测定方法见4.1.1，结果见图17。结果表明：高糖培养时2-dg与索拉非尼联合处理相比索拉非尼单独处理细胞活性显著降低，该过程依赖于2-dg浓度(图17a)；而低糖培养时，补充葡萄糖则可显著提高细胞活性，该过程依赖于葡萄糖浓度(图17b)。
100.综合以上4.1～4.4的结果，我们认为肿瘤细胞内糖酵解过程与抗肿瘤药物敏感性密切相关。葡萄糖可能通过增强糖酵解过程，延长索拉非尼诱导ampk激活持续时长，进而促进肿瘤细胞在抗肿瘤药物压力下存活，提示抑制糖酵解过程可增加肿瘤细胞的药物敏感性。因此，联合应用糖酵解抑制剂和索拉非尼有望成为治疗肝细胞癌的新型用药策略。
101.4.5ros缩短索拉非尼诱导的肝癌细胞中ampk激活持续时长高糖培养时，索拉非尼处理诱导ampk活化，然而单个细胞的ampk激活持续时长存在显著的细胞异质性(图3f、图4)，提示除糖酵解外，仍存在某些因素调控ampk活性。我们猜测，索拉非尼激活ampk时伴随ros氧化应激，而过度产生的ros可能是ampk失活的重要原因，并对此进行了实验验证。
102.4.5.1索拉非尼对肝癌细胞ros水平的影响ros的检测基于dcfh-da和流式细胞术，具体方法如下：细胞以3.5
×
105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，按实施例2中的“2.1细胞培养”进行培养。药物处理相应时间后，使用1
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pbs缓冲液将其洗去。使用1
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pbs缓冲液将溶于dmso中的10mmol/l h2dcfda原液进一步稀释为5μmol/l，以1ml/孔加入孔板并在37℃避光孵育30min。去除染色液后，用0.05％胰酶-edta溶液消化收集细胞，离心后用1
×
pbs溶液重悬。样品通过40μm细胞筛网过滤后立刻使用流式细胞仪检测荧光强度。样品用488nm激光激发，检测530/30nm荧光的增加可以测量dcf在细胞中的积累，以监测单细胞的氧化还原状态。使用flowjo(10.8.1)软件进行结果分析。
103.测量25mmo/l葡萄糖浓度下，10μmol/l索拉非尼处理60min时huh7-ahie8 p32细胞内ros累积水平，结果见图18。结果表明：在高糖培养时，索拉非尼处理显著增加细胞内ros含量，ros水平较高的细胞占细胞总数的54.3％。
104.4.5.2trolox对高糖下ampk活性的影响为了探究索拉非尼诱导的ros氧化应激是否在ampk活性动态变化过程中发挥作用，通过trolox(一种亲水性细胞通透的抗氧化剂)，来清除索拉非尼诱导的ros，结果见图19。结果表明：dmso处理时，即使数据采集过程中出现了波动，但总体而言trolox对于ampk指数无显著影响。
105.4.5.3trolox对高糖下索拉非尼处理后ampk活性动态变化的影响随后，我们探究了trolox对于高糖下索拉非尼诱导的ampk活性动态变化和肝癌细胞活力的影响，结果见图21。结果表明：与索拉非尼单独处理组相比，索拉非尼处理同时或索拉非尼处理30min后加入trolox，可延长ampk活化持续时长(图21a～21c)，且ampk长时间活化(≥220分钟)的细胞比例增加，由索拉非尼单独处理组的16.2％增加到trolox与索拉非尼同时处理组的27.2％
和索拉非尼与trolox先后处理组的28.3％(图21e)；此外，trolox可抑制索拉非尼处理诱导的细胞活力的降低(图21f)。
106.根据以上4.5.1～4.5.3的结果，在高葡萄糖浓度下，ros是索拉非尼诱导的ampk活化的抑制因子，缩短ampk激活持续时长，并与索拉非尼抗肿瘤疗效相关。
107.实施例5：huh7-ahie8 p32表达ampk活性报告器的稳定性为了探究ampk活性报告器在huh7-ahie8 p32中是否稳定表达，我们培养了第20代与第29代的huh7-ahie8 p32细胞并进行细胞流式分析。因为ampk活性报告器中青色荧光蛋白的激发光和发射光波段与绿色荧光蛋白高度重叠，而流式细胞仪上只能检测绿色荧光蛋白的信号，所以我们分析了细胞内绿色荧光的强度，结果见图20。结果表明，第29代和第20代huh7-ahie8 p32细胞有类似的荧光强度，说明它们有类似的ampk活性报告器的蛋白表达水平，本发明的huh7-ahie8 p32细胞株能够稳定表达ampk活性报告器。
108.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本发明中所用试剂、生物材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明中所用方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
109.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种可实时动态监测ampk活性的肝癌细胞株，其特征在于，所述肝癌细胞株命名为人肝源细胞huh7-ahie8 p32，已在2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:63541。2.如权利要求1所述肝癌细胞株在实时动态监测肝癌细胞内ampk活性中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：利用所述肝癌细胞株，基于荧光共振能量转移原理和高内涵成像技术，实时动态监测肝癌细胞内ampk活性。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)对huh7-ahie8 p32细胞进行持续高内涵荧光显微镜成像，获取多个时间点的mturquoise2和ypet通道的荧光强度；(2)选取多个细胞，分别计算单细胞内mturquoise2和ypet通道在每个时间点的平均荧光强度值，减去各通道在相应时间点的背景荧光强度，获得各时间点单细胞内mturquoise2和ypet的荧光强度；(3)根据以下公式，计算各时间点的ampk指数：5.如权利要求1所述肝癌细胞株在检测肝癌细胞内ampk激活持续时长中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(i)利用所述肝癌细胞株，获得ampk指数随时间变化的折线图；(ii)在步骤(i)获得的折线图中，将ampk指数开始从最大值下降的时间点定义为ampk指数连续下降的起始点，从起始点开始，寻找相邻两个时间点之间折线段斜率变化最大的转折点，即为ampk的去激活点；(iii)计算去激活点与起始点的时间差，即为ampk激活持续时长。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(ii)中，所述寻找相邻两个时间点之间折线段斜率变化最大的转折点的方法如下：计算相邻两个时间点之间折线段的斜率k；当k>0时，将k重新赋值为零；当k<0时，k值保持不变；寻找相邻两个折线段的k值变化最大处，这两个折线段之间的拐点即为ampk的去激活点。8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤(ii)中，在寻找相邻两个时间点之间折线段斜率变化最大的转折点的过程中，对于折线图中ampk指数先轻微下降又重新上升的拐点，该点不是所需的去激活点：判断该点之后的1～2个时间点的范围内是否出现ampk指数的明显上升，若出现，则以该点为起始点，再次分析该时间点后斜率变化最大的转折点作为去激活点。9.如权利要求1所述肝癌细胞株在研究肝癌细胞耐药性中的应用，其特征在于，所述研究肝癌细胞耐药性为研究肝癌细胞的耐药性机制或研究克服肝癌细胞耐药性的策略。10.如权利要求1所述肝癌细胞株在研究ampk靶向药物治疗肝癌的药理机制中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医学领域，公开了一种可实时动态监测AMPK活性的肝癌细胞株及其应用。该肝癌细胞株命名为人肝源细胞Huh7-AHIE8 P32，已在2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63541。本发明提供的肝癌细胞株Huh7-AHIE8 P32能够作为实时动态监测活的肝癌细胞中AMPK活性的工具，且具有较高的准确性，因而对于研究AMPK靶向药物治疗肝癌的药理机制，以及肝癌细胞的耐药性机制和对策具有重要意义。和对策具有重要意义。和对策具有重要意义。


技术研发人员：夏信群
受保护的技术使用者：北京沃锶达细胞技术有限公司
技术研发日：2023.08.03
技术公布日：2023/10/19