一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法

1.本发明涉及干细胞培养领域，更具体地说，涉及一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法。


背景技术：

2.黑果腺肋花楸(aronia melanocarpa elliott)又称为野樱莓、不老莓。属于蔷薇科(rosaceae)，引自美国东北部的一种新兴小型浆果。2018年9月，国家卫生健康委员会通过认证了黑果腺肋花楸为新食品原料，对于黑果腺肋花楸的产业发展起到极大的推动和转折作用。黑果腺肋花楸含有多种多酚类物质均具有抗氧化、抗衰老的作用，其果实经过加工成产品后对抑制高血压和预防心脑血管疾病都具有一定的疗效，且抗逆性较强。黑果腺肋花楸作为绿化植物还具有很高的观赏价值。因此，黑果腺肋花楸是集药用价值、食用价值和观赏价值于一身的、经济效益很高的灌木树种。我国多地区正引种该树种，近年来也有许多研究人员对组培苗的技术成功建立，稳定优化技术体系。
3.虽然黑果腺肋花楸的经济效益非常高，但是其生长周期和结果时间较长，而果实直接食用口感较为酸涩，需要进行加工，才能利用其丰富的多种活性物质。黑果腺肋花楸在种植生长过程中，面临着病虫害的威胁，再加上水土污染等因素，果实中“重毒副”和农药残留超标时常发生。在我国气候适宜的种植区如山东等地，果实成熟时节与雨季重叠，造成烂果、坏果等严重减产。上述种种原因，至今，黑果腺肋花楸在我国仍没有大面积种植。因此，利用细胞工程技术规模化培养黑果腺肋花楸不定根，并提取花青素，作为栽培的替代具有重大经济和社会价值。以不定根培养物形式获得花青素，比细胞和组织培养优势更明显，如生理生化代谢稳定、培养物不易退化、有效成分积累能力强等优点。
4.国外在一些药用植物，如人参、刺五加、颠茄等物种，进行了不定根诱导与培养工作，有些还进行规模化培养。但在这个过程中，需要细胞脱分化、再分化调控等变化过程，周期达到3个月以上，而且需要使用复杂的激素配比、多次转接继代等繁琐操作，导致周期长、污染率高等问题。


技术实现要素：

5.本发明提供一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法旨解决因受到病虫害威胁、水土污染以及季节气候等因素的影响，造成农药残留超标、坏果烂果减产等问题，导致黑果腺肋花楸在我国不适宜大面积种植；生长周期长，果实酸涩，需要进行加工，才能利用其丰富的多种活性物质；以及目前现有技术中应用于诱导产生不定根的培养基在培养过程中需要细胞脱分化、再分化调控等变化过程，且需要使用复杂的激素配比、多次转接继代等繁琐操作，导致周期长、污染率高等问题。更好地实现黑果腺肋花楸的药用价值、食用价值和观赏价值；提高黑果腺肋花楸的经济效益；建立稳定优化的培苗技术，为规模化生产黑果腺肋花楸花青素提供新的技术支持。
6.为了达到上述目的，本发明提供一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方
法，包括如下步骤：
7.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的制备：取黑果腺肋花楸的幼嫩枝条作为外植体，剪去叶片，清水冲洗、剪切成茎段，经酒精、升汞溶液浸泡后用无菌水清洗，切成茎芽顶端向上，以每100ml接种4～6根的接种比例接入快繁苗培养基中培养，得到黑果腺肋花楸无菌苗；所述快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa，0.8mg/l 6-ba，30g/l蔗糖，7g/l琼脂组成的固体培养基；
8.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖，包括如下步骤：将所得黑果腺肋花楸无菌苗的叶片，剪切后以每60ml接种3～5个的接种比例平铺在诱导不定根培养基中，温度为24～26℃，暗培养24～26d后，在光照强度为1500～3000lx，照光时间为12～18h/d，蓝红光光照波长比为(3～7):1，光照培养7～9d，得到黑果腺肋花楸不定根；所述诱导不定根培养基是由1/2ms培养基中加入1～3mg/l naa，1～4mg/l iba，30g/l蔗糖，4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
9.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：无菌条件下，将步骤s2所得黑果腺肋花楸不定根剪切成不定根段后，以每125ml接种4～6个的接种比例接种于液体培养基悬浮培养；所述液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.0～3.0mg/lnaa，1～3mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
10.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.45～0.55cm的切段，以每1000ml接种15～20个的接种比例转移到新鲜培养基中，灭菌后加入1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液，温度为22～28℃，光照1500～3000lx，光质为蓝红波长比为(7:1)～(3:1)的条件下，光照培养25～35d；所述新鲜培养基由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液，2.0～3.0mg/l naa，1～3mg/liba，50g/l蔗糖组成。
11.优选方式下，步骤s1所述清水冲洗次数为3～5次，所述茎段长度为3～5cm，所述无菌水冲洗次数为3～5次，所述茎芽为0.5～2.0cm的单芽，接入个数为4～6节；所述酒精浓度为70％，体积为190～210ml，浸泡时间为30～60s；所述升汞溶液浓度为0.1％，体积为95～110ml，浸泡时间为10～15min；所述培养基培养条件是温度为24～26℃，ph为7，led全色光，光照强度为1200lux、照光时长为12～16h/d，培育40d。
12.优选方式下，步骤s2所述剪切伤口个数为4～5个，剪切方式为沿着主叶脉竖直方向剪开、伤口宽度为叶片宽度的60％～70％、不剪断，向阳面朝上摆放。
13.优选方式下，步骤s3所述不定根段每段重量0.09～0.11g；所述液体培养基体积约为120～130ml，所述悬浮培养是在温度为25～28℃、转速为95～105rpm/min的条件下暗培养，培养周期为30～40d。
14.优选方式下，步骤s4所述灭菌的方式为在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌，时间为25min；所述1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液是0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得的，所述1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液是在灭菌后40～50min琼脂未凝的状态下添加的，添加量为200～600μg/l。
15.优选方式下，步骤s4所述橘皮提取液是将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液制得的；步骤s2～s4所述无菌条件为工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯操作。
16.最优方式下，一种“一步式”诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的培养方法，包括如下步骤：
17.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：取黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽，调节快繁苗培养基的ph调节至7并将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，黑果腺肋花楸无菌苗，备用。
18.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：
19.在无菌条件下，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断，取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，光照培养8d，照光时间为12h/d，蓝红光光照波长比为5:1，得到黑果腺肋花楸不定根。
20.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养，所述悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。
21.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：无菌条件下，将悬浮培养后的不定根切成0.5cm的切段，取5段转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l 1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为蓝红波长比为5:1的条件下，光照培养30d。
22.本发明的有益效果如下：
23.目前对黑果腺肋花楸果实中的生物活性成分的功能和利用研究很多，但是其果实结果周期长，且受环境因素影响大，国内并没有大批量种植，并且果实口感酸涩并不被大众所接受，仍需要进一步加工。
24.本发明仅选用黑果腺肋花楸的叶片作为原材料，利用简单的激素配比，“一步式”诱导生成不定根，通过加入农副产品——橘皮、1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液，促进花青素的合成及转色。
25.相比较现有技术的研究内容，本发明以叶片为外植体“一步式”直接诱导不定根，缩短了培养时间且取得较好效果，简化了中间胚性愈伤组织诱导的步骤，省去了脱分化形成愈伤组织和再分化过程形成不定根的中间过程，过程更简单，原料更易得新颖、产物更稳定、周期更短、成本更低、不定根诱导效率更高；本发明通过干细胞培养的手段，克服了目前不定根诱导和培养工艺中的问题，建立了更加高效、简单、安全、稳定的黑果腺肋花楸培养技术体系，并且通过发明的培养基配方与培养方法大大提高了不定根中花青素含量，是原植物果实的2倍以上，提高66％。以不定根作为培养物生产花青素，花青素含量比离体培养的细胞和愈伤组织及果实中更高。本发明通过植物器官培养的手段，为不定根由固体、液体放大到生物反应器的培养提供技术参数，也为规模化生产黑果腺肋花楸花青素提供新的技术支持。
26.本发明诱导不定根培养基配方：1/2ms培养基作为基础培养基加入30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂、2.5mg/l naa，2mg/l iba诱导不定根的大量产生后，在蓝红光波长5:1的配比进行悬浮培养提高花青素产量时，诱导率高达71.43％，花青素含量可达到8.19481mg/g；相
较于相同条件下，以ms作为基础培养基的诱导不定根培养基时，诱导率为35.26％，仅为本发明的1/2，花青素含量为2.35448mg/g，仅为本发明的1/4；相较于相同条件下，通过不同类型光源照射培养提高花青素含量，比led全光谱时的花青素含量高近2倍，比红蓝白光波长比为1:1:1时的花青素含量高1.3倍。
附图说明
27.图1是本发明实施例4诱导不定根培养基naa添加量为2.5mg/l、iba添加量为2mg/l时不定根诱导数和根长结果图；
28.图2是本发明实施例6在5:1红蓝光处理前显微镜下观察图；
29.图3是本发明实施例6在5:1红蓝光处理后显微镜下观察图。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
31.实施例1(1mg/l naa
‑‑
1～4mg/l iba)
32.一种诱导黑果腺肋花楸不定根的方法，包括如下步骤：
33.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
34.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
35.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：
36.在无菌条件下(方案中的无菌条件均指工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。分为4组，每组取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d。4组诱导不定根培养基的iba(吲哚丁酸)浓度不同，浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l，其余成分相同，分别为1/2ms培养基、1mg/l naa(α-萘乙酸)、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂。
37.实施例2(1.5mg/l naa
‑‑
1～4mg/l iba)
38.一种诱导黑果腺肋花楸不定根的方法，包括如下步骤：
39.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
40.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂
组成的固体培养基。
41.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：
42.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。分为4组，每组取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d。4组诱导不定根培养基的iba浓度不同，浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l，其余成分相同，分别为1/2ms培养基、1.5mg/l naa、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂。
43.实施例3(2mg/l naa
‑‑
1～4mg/l iba)
44.一种诱导黑果腺肋花楸不定根的方法，包括如下步骤：
45.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
46.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
47.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：
48.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。分为4组，每组取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d。4组诱导不定根培养基的iba浓度不同，浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l，其余成分相同，分别为1/2ms培养基、2mg/l naa、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂。
49.实施例4(2.5mg/l naa
‑‑
1～4mg/l iba)
50.一种诱导黑果腺肋花楸不定根的方法，包括如下步骤：
51.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
52.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
53.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：
54.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。分为4组，每组取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d。4组诱导不定根培养基的iba浓度不同，浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l，其余成分相同，分别为1/2ms培养基、2.5mg/l naa、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂。
55.实施例5(2.5mg/l naa
‑‑
2mg/l iba+蓝红光3:1)
56.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，包括如下步骤：
57.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
58.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
59.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：
60.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，光照培养8d，照光时间为12h/d，蓝红光光照波长比为3:1。得到黑果腺肋花楸不定根。过程中使用的诱导不定根培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa、2mg/l iba、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
61.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：
62.无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养。悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。过程中使用的液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa，2mg/liba，50g/l蔗糖组成。
63.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：
64.无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.5cm的切段，取5段转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液(0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得)，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为蓝红波长比为3:1的条件下，光照培养30天。过程中使用的新鲜培养基是由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液(将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液即为橘皮提取液)，2.5mg/lnaa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
65.实施例6(2.5mg/l naa
‑‑
2mg/l iba+蓝红光5:1)
66.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，包括如下步骤：
67.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
68.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂
组成的固体培养基。
69.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：
70.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，光照培养8d，照光时间为12h/d，蓝红光光照波长比为5:1。得到黑果腺肋花楸不定根。过程中使用的诱导不定根培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa、2mg/l iba、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
71.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：
72.无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养。悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。过程中使用的液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa，2mg/liba，50g/l蔗糖组成。
73.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：
74.无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.5cm的切段，取5段转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液(0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得)，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为蓝红波长比为5:1的条件下，光照培养30天。过程中使用的新鲜培养基是由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液(将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液即为橘皮提取液)，2.5mg/lnaa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
75.实施例7(2.5mg/l naa
‑‑
2mg/l iba+蓝红光7:1)
76.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，包括如下步骤：
77.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
78.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
79.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：
80.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。取4个叶片向阳面朝上平铺在诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，光照培养8d，照光时间为12h/d，蓝红光光照波长比为7:1，得到黑果腺肋花楸不定根。过程中使用的诱导不定根培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa、2mg/liba、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
81.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：
82.无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养。悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。过程中使用的液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa，2mg/liba，50g/l蔗糖组成。
83.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：
84.无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.5cm的切段，取5段转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液(0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得)，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为蓝红波长比为7:1的条件下，光照培养30天。过程中使用的新鲜培养基是由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液(将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液即为橘皮提取液)，2.5mg/lnaa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
85.对比例1(0mg/l naa
‑‑
0mg/l iba)
86.一种诱导黑果腺肋花楸不定根的方法，包括如下步骤：
87.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
88.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
89.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。取4个叶片向阳面朝上平铺在诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d。过程中使用的诱导不定根培养基是由1/2ms培养基为基础培养基加入30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
90.对比例2(0mg/l naa
‑‑
1～4mg/l iba)
91.一种诱导黑果腺肋花楸不定根的方法，包括如下步骤：
92.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
93.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
94.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4
个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。分为4组，每组取4个叶片向阳面朝上平铺在诱导不定根培养基中，温度为24～26℃，暗培养24～26d。4组培养基的iba浓度不同，浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l，其余成分相同，分别为1/2ms培养基、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂。
95.对比例3(1～2.5mg/l naa
‑‑
0mg/l iba)
96.一种诱导黑果腺肋花楸不定根的方法，包括如下步骤：
97.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
98.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
99.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。分为4组，每组取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d。4组诱导不定根培养基的naa浓度不同，浓度分别为1mg/l、1.5mg/l、2mg/l、2.5mg/l，其余成分相同，分别为1/2ms培养基、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂。
100.对比例4(2.5mg/l naa
‑‑
2mg/l iba+不同光质)
101.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，包括如下步骤：
102.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
103.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
104.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：
105.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。分为5组，每组取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，光照培养8d，照光时间为12h/d，5组培养基选用不同的光质照射，分别为led全光谱、红蓝光光照波长比5:1、红蓝白光光照波长比为1:1:1、红白光光照波长比为1:5、蓝光。得到黑果腺肋花楸不定根过程中使用的诱导不定根培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa、2mg/l iba、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
106.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：
107.无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，每组取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养。悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。过程中使用的液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
108.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：
109.无菌条件下，将步骤s3培养后的5组不定根切成0.5cm的切段，分别转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液(0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得)，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为红蓝光光照波长比5:1的条件下，光照培养30d。过程中使用的新鲜培养基是由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液(将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液即为橘皮提取液)，2.5mg/lnaa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
110.对比例5(1/2ms培养基+蓝红光光照波长5:1)
111.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，包括如下步骤：
112.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
113.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
114.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：
115.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，光照培养8d，照光时间为12h/d，蓝红光光照波长比为5:1。得到黑果腺肋花楸不定根。过程中使用的诱导不定根培养基为1/2ms加入4.5g/l琼脂固体培养基。
116.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：
117.无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，每组取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养。悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。过程中使用的液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
118.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：
119.无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.5cm的切段，转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l 1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液(0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得)，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为蓝红波
长比为5:1的条件下，光照培养30d。过程中使用的新鲜培养基是由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液(将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液即为橘皮提取液)，2.5mg/l naa，2mg/liba，50g/l蔗糖组成。
120.对比例6(果实)
121.选取生长温度为22～28℃，日光照射8～12h/d，自然条件栽培下，生长状况良好的成熟的黑果腺肋花楸果实，检测黑果腺肋花楸的花青素含量作为对比例。
122.对比例7(愈伤组织)
123.一种诱导黑果腺肋花楸愈伤组织提高花青素含量的方法，包括如下步骤：
124.将黑果腺肋花楸无菌苗继代过程中，苗的茎部与培养基接口处的愈伤组织，剪碎成0.5cm的大小，以每60ml接种7～10个的接种比例接入添加了1.5mg/lnaa，2mg/l 6-ba，1mg/l kt、30g/l蔗糖、7g/l琼脂继代愈伤的培养基中，温度为24～26℃，暗培养20d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，led全色光照光培养10d，照光时间为12～16h/d，获得大量的愈伤组织。
125.对比例8(ms培养基+2.5mg/l naa
‑‑
2mg/l iba)
126.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，包括如下步骤：
127.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
128.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
129.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：
130.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d，得到黑果腺肋花楸不定根。过程中使用的诱导不定根培养基是由ms培养基中加入2.5mg/l naa、2mg/l iba、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
131.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：
132.无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养。悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。过程中使用的液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa，2mg/liba，50g/l蔗糖组成。
133.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：
134.无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.5cm的切段，取5段转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液(0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得)，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质
为蓝红波长比为5:1的条件下，光照培养30天。过程中使用的新鲜培养基是由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液(将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液即为橘皮提取液)，2.5mg/lnaa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
135.对比例9(1/4ms培养基+2.5mg/l naa
‑‑
2mg/l iba)
136.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，包括如下步骤：
137.s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：
138.选取长势旺盛、叶色墨绿的黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽。将快繁苗培养基的ph调节至7，将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，得到生长快、叶子宽大的无菌苗备用。过程中使用的快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa、0.8mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、7g/l琼脂组成的固体培养基。
139.s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导：
140.在无菌条件下(工作台先经30min紫外灭菌后，点燃酒精灯)，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，不剪断。取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d，得到黑果腺肋花楸不定根。过程中使用的诱导不定根培养基是由1/4ms培养基中加入2.5mg/l naa、2mg/l iba、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成的固体培养基。
141.s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：
142.无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养。悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d。过程中使用的液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.5mg/l naa，2mg/liba，50g/l蔗糖组成。
143.s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：
144.无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.5cm的切段，取5段转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液(0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得)，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为蓝红波长比为5:1的条件下，光照培养30天。过程中使用的新鲜培养基是由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液(将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液即为橘皮提取液)，2.5mg/lnaa，2mg/l iba，50g/l蔗糖组成。
145.表1不定根诱导培养基筛选的实验因素水平
[0146][0147]
实施例1～4和对比例1～3在无菌条件下，将培育的无菌苗叶片剪出4～5个伤口，选用1/2ms培养基中加入30g/l蔗糖，4.5g/l琼脂为基础培养基，探究不同浓度水平的naa(α-萘乙酸)和iba(吲哚丁酸)对不定根诱导效果的影响。将表1列举的5种naa浓度和5种iba浓度两两组合，得到25种组合配比。
[0148]
其中，实施例1是在naa浓度均为1mg/l，iba浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l的培养基中培养的；实施例2是在naa浓度均为1.5mg/l，iba浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l的培养基中培养的；实施例3是在naa浓度均为2mg/l，iba浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l的培养基中培养的；实施例4是在naa浓度均为2.5mg/l，iba浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l的培养基中培养的；对比例1是在naa浓度、iba浓度均为0mg/l的培养基中培养的；对比例2是在naa浓度均为0mg/l，iba浓度分别为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l的培养基中培养的；对比例3是在iba浓度均为0mg/l，naa浓度分别为1mg/l、1.5mg/l、2mg/l、2.5mg/l的培养基中培养的。通过实施例1～4和对比例1～3不同激素配比对黑果腺肋花楸愈伤组织诱导及不定根分化结果见表2。
[0149]
表2不同激素配比对黑果腺肋花楸愈伤组织诱导及不定根分化结果
[0150]
[0151][0152]
如表2所示，不同激素配比对黑果腺肋花楸愈伤组织诱导及不定根分化结果，结果显示，在照光后不定根会有不同的颜色变化。对比例1培养基中未没有添加naa和iba的情况下，诱导率、生根率以及根部颜色均没有变化。部分生长素在一定浓度下可以促进花青素的合成。对比例2培养基添加不同浓度的iba，照光后根部不变色、呈透色，生根率在添加iba浓度为4mg/l时最高，为50％。实施例1在添加1mg/l naa的基础上，再添加不同浓度的iba，照光后根部微微呈乳白色，生根率在添加iba浓度为1mg/l时最高，为70％。实施例2在添加1.5mg/l naa的基础上，再添加不同浓度的iba，照光后根部呈淡粉色，生根率在添加iba浓度为2mg/l时最高，为68.43％。实施例3在添加2mg/l naa的基础上，再添加不同浓度的iba，照光后根部呈淡粉色，生根率在添加iba浓度为4mg/l时最高，为52.94％。实施例4在添加2mg/l naa的基础上，再添加不同浓度的iba，照光后根部多呈粉红色，生根率在添加iba浓度为2mg/l时最高。如图1所示，是本发明实施例4诱导不定根培养基naa添加量为2.5mg/l、
iba添加量为2mg/l时不定根诱导数和根长结果。照光后根部呈粉红色，诱导率可达70％，生根率可达到71.43％。对比例3培养基添加不同浓度的naa，照光后根部呈翠绿色，生根率在添加iba浓度为2.5mg/l时最高，为25.65％。综上所述，诱导不定根发生的最佳培养基配方为1/2ms培养基中加入30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂、2.5mg/l naa，2mg/l iba。
[0153]
表3不同光照对黑果腺肋花楸不定根花青素积累影响
[0154][0155]
如表3所示，是在最佳培养基配方诱导的不定根，在不同光照对黑果腺肋花楸不定根花青素积累影响。从根部颜色可在一定程度上直观的判断花青素含量，根部呈粉色或红色的花青素含量高于根部绿色或呈透白色的花青素含量，颜色越深花青素含量越高。
[0156]
不定根花青素含量测定：
[0157]
取黑果腺肋花楸不定根，放置在烘箱中40℃烘干至恒重，然后放在研钵中研成粉末，称取干重为1g粉末于烧杯中，以60％乙醇溶液为溶剂，料液比为1g:30ml，匀浆后将ph调至2，置于50℃超声波清洗机中，超声60分钟进行提取，提取结束后的提取液立即转移到离心管中，8000rpm/min离心5min，过滤，保留上清液，测定上清液花青素的含量。取2组试管，每组3支，每支量取0.2ml上清液。其中一组上清液使用ph＝1.0的氯化钾溶液稀释5倍，测定并计算稀释液在波长520nm和700nm处吸光值之差，记为a0；另一组上清液使用ph＝4.5的乙酸钠缓冲液稀释5倍，测定并计算稀释液在波长520nm和700nm处吸光值之差，记为a1。最后利用式(1)计算花青素提取量，mg/g。
[0158]
提取量＝(a0-a1)
×m×d×
v/(ε
×
m)(1)
[0159]
式中：m为矢车菊-3-o-葡萄糖苷的相对分子质量，m＝449.2g/mol；d为稀释倍数，d＝5；ε为矢车菊-3-o-葡萄糖苷的消光系数，v为提取溶液体积ml，ε＝26 900l/(mol
·
cm)；m为黑果腺肋花楸不定根质量，m＝1g。
[0160]
计算结果如表3所示，实施例5～7分别选用蓝红光之比为3:1、5:1、7:1的光照射；对比例4的5组分别选用led全光谱、红蓝之比为5:1、红蓝白光之比为1:1:1、红白光之比为1:5、蓝光照射；对比例5是通过1/2ms培养基蓝红光之比为5:1的条件下不定根。对比例4中，红蓝光之比为5:1、红白光之比为1:5和蓝光照射时，根颜色分别为淡绿色、绿色和透白色，花青素含量分别为1.84595mg/g、0.85485mg/g、0.51812mg/g，花青素含量明显低于实施例5～7、对比例5以及对比例4的其它2组；对比例4中，led全光谱、红蓝白光之比为1:1:1的光照条件下，根颜色均为淡粉色，花青素含量分别为4.35845mg/g、5.59746mg/g，花青素含量虽明显高于红蓝光之比为5:1、红白光之比为1:5和蓝光照射。实施例5～7蓝红光之比为3:1、
5:1、7:1的光照射，根颜色呈紫红色，花青素含量分别为6.54975mg/g、8.19481mg/g、5.75797mg/g，花青素含量明显高于对比例4中任意一组，其中，蓝红光之比为5:1时花青素含量最高。实施例5和对比例4采用不同的培养基成分，相同光质照射，根颜色呈紫红色，花青素含量为7.59481mg/g，明显低于实施例6蓝红光之比为5:1。
[0161]
综上所述，表3总结了不同光源的光照对黑果腺肋花楸不定根花青素积累影响，结果显示，不同光源对黑果腺肋花楸不定根中花青素的积累有影响，其中蓝红光之比为5:1对花青素含量的积累效果最佳。
[0162]
如图2～3所示，分别为实施例6在5:1红蓝光处理前、后显微镜下观察到的影像，可以看出经过5:1红蓝光处理过后的不定根部内有大量红色，说明其花青素含量较处理之前有所提高。
[0163]
表4不同培养基对诱导不定根以及花青素积累
[0164][0165]
如表4所示，对比例8对应实验序号1的数据；实施例6对应实验序号2的数据，对比例9对应实验序号3的数据。在其它培养条件相同的情况下，实施例6、对比例8～9分别选用1/2ms培养基、ms培养基和1/4ms培养基作为基础培养基，并均基础培养基中加入2.5mg/l naa、2mg/l iba、30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂组成固体培养基作为诱导不定根培养基，进行“一步式”诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的培养。从表4中可以看出，实施例6以1/2ms为基础培养基时诱导效果最好，可达到诱导率可达到71.43％，花青素含量可达到8.19481mg/g。实施例6的培养产物与对比例8的培养产物相比，诱导率是对比例8的培养产物的2倍，花青素含量是对比例8的培养产物的3倍以上。实施例6的培养产物与对比例9的培养产物相比，诱导率是对比例9的培养产物的1.3倍，花青素含量是对比例9的培养产物的1.6倍。因此，实施例6是三组实验中效果最好的。
[0166]
表5黑果腺肋花楸不同产物中花青素含量的比较
[0167][0168]
如表5所示，是本发明实施例6黑果腺肋花楸不定根、对比例6黑果腺肋花楸果实和黑果腺肋花楸愈伤组织花青素含量的比较。果实中花青素含量占4.9％；愈伤组织中花青素含量占6.2％，相较于果实提高了27％；黑果腺肋花楸不定根花青素含量占8.1％，相较于果实提高了66％，相较于黑果腺肋花楸愈伤组织也有明显提高。
[0169]
综上所述，实施例6选用的诱导不定根培养基配方：1/2ms培养基中加入30g/l蔗糖、4.5g/l琼脂、2.5mg/l naa，2mg/l iba，在光照条件为蓝红光之比为5:1的情况下培养出的黑果腺肋花楸不定根花青素含量是最高的，明显优于其他实施例和对比例。
[0170]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、黑果腺肋花楸无菌苗的制备：取黑果腺肋花楸的幼嫩枝条作为外植体，剪去叶片，清水冲洗、剪切成茎段，经酒精、升汞溶液浸泡后用无菌水清洗，切成茎芽顶端向上，以每100ml接种4～6根的接种比例接入快繁苗培养基中培养，得到黑果腺肋花楸无菌苗；所述快繁苗培养基是由ms培养基为基础培养基加入0.2mg/l naa，0.8mg/l 6-ba，30g/l蔗糖，7g/l琼脂组成的固体培养基；s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：将所得黑果腺肋花楸无菌苗的叶片剪切后以每60ml接种3～5个的接种比例平铺在诱导不定根培养基中，温度为24～26℃，暗培养24～26d后，在光照强度为1500～3000lx，照光时间为12～18h/d，蓝红光光照波长比为(3～7)：1，光照培养7～9d，得到黑果腺肋花楸不定根；所述诱导不定根培养基是由1/2ms培养基中加入1～3mg/l naa，1～4mg/liba，30g/l蔗糖，4.5g/l琼脂组成的固体培养基；s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：无菌条件下，将所得黑果腺肋花楸不定根剪切成不定根段后，以每120～130ml接种4～6个的接种比例接种于液体培养基悬浮培养；所述液体培养基是由1/2ms培养基中加入2.0～3.0mg/l naa，1～3mg/l iba，50g/l蔗糖组成；s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：无菌条件下，将悬浮培养后的不定根切成0.45～0.55cm的切段，以每1000ml接种15～20个的接种比例转移到新鲜培养基中，灭菌后加入1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液，温度为22～28℃，光照1500～3000lx，光质为蓝红波长比为(7:1)～(3:1)的条件下，光照培养25～35d；所述新鲜培养基由1/2ms、鲜重15g/l橘皮提取液，2.0～3.0mg/l naa，1～3mg/liba，50g/l蔗糖组成。2.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，其特征在于，步骤s1所述清水冲洗次数为3～5次，所述茎段长度为3～5cm，所述无菌水冲洗次数为3～5次，所述茎芽为0.5～2.0cm的单芽；所述酒精浓度为70％，体积为190～210ml，浸泡时间为30～60s；所述升汞溶液浓度为0.1％，体积为95～110ml，浸泡时间为10～15min；所述快繁苗培养基培养条件是温度为24～26℃，调节ph为7，led全色光，光照强度为1200lux、照光时长为12～16h/d，培育40d。3.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，其特征在于，步骤s2所述剪切伤口个数为4～5个，剪切方式为沿着主叶脉竖直方向剪开、伤口宽度为叶片宽度的60％～70％，向阳面朝上摆放。4.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，其特征在于，步骤s3所述不定根段每段重量0.09～0.11g；所述悬浮培养是在温度为25～28℃、转速为95～105rpm/min的条件下暗培养，培养周期为30～40d。5.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，其特征在于，步骤s4所述灭菌的方式为在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌，时间为25min；所述1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液是0.5g/l kh2po4、1g/l 1％乙烯利溶于蒸馏水制得的，所述1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液是在灭菌后40～50min琼脂未凝的状态下添加的，添加量为200～600μg/l。6.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，其特征在于，所述橘皮提取液是将新鲜橘皮捣碎，转速为5000rpm，离心10min，取上清液制得的。7.根据权利要求1～6任一所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，其特征在
于，包括如下步骤：s1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导：取黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体，剪去叶片，清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料，经70％的酒精中浸泡30～60s后，再在0.1％升汞中浸泡10min，用无菌水清洗3次，切成1cm的单芽，调节快繁苗培养基的ph调节至7并将单芽顶端向上接入100ml快繁苗培养基中，每瓶中接入5个单芽，在25℃的条件下，光照强度为1200lux，led全色光照光12h/d，培育40d，黑果腺肋花楸无菌苗，备用；s2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖：在无菌条件下，取步骤s1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片，沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口，取4个叶片向阳面朝上平铺在60ml诱导不定根培养基中，温度为25℃，暗培养25d后，进行光照培养，光照强度为3000lux，光照培养8d，照光时间为12h/d，蓝红光光照波长比为5:1，得到黑果腺肋花楸不定根；s3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养：无菌条件下，将步骤s2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段，取5段分别接种于125ml液体培养基中悬浮培养，所述悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养，培养周期为35d；s4、提高不定根悬浮培养的花青素含量：无菌条件下，将步骤s3培养后的不定根切成0.5cm的切段，取5段转移到250ml新鲜培养基中，在110kpa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌25min后，等待45min，向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/l 1％乙烯利的磷酸二氢钾水溶液，温度为25℃，光照强度为3000lx，光质为蓝红波长比为5:1的条件下，光照培养30d。

技术总结
本发明公开了一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法，该方法包括如下四步骤：黑果腺肋花楸无菌苗的制备、无菌苗不定根诱导和增殖、不定根悬浮培养、提高不定根悬浮培养的花青素含量。本发明以叶片为外植体“一步式”直接诱导不定根，省去了脱分化和再分化的中间过程；简化了培养操作环节、降低了成本，提高了不定根的诱导效率。同时，以不定根为培养物生产花青素，花青素含量比离体培养的细胞和愈伤组织及果实中更高。本发明通过植物器官培养的手段，建立简便、安全、高效的黑果腺肋花楸不定根培养体系，为不定根由固体、液体放大到生物反应器的培养提供技术参数，为规模化生产提取黑果腺肋花楸花青素提供新途径。黑果腺肋花楸花青素提供新途径。


技术研发人员：张宗申 侯名君 王衍杰 刘长斌
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：2023.08.08
技术公布日：2023/10/19