血管紧张素-(1-4)在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用的制作方法

1.本发明涉生物医药技术领域，特别是涉及一种小分子多肽血管紧张素-(1-4)在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病是临床上最常见的神经退行性疾病，其典型病理特征为脑内淀粉样蛋白、过磷酸化tau蛋白的沉积以及神经炎症反应。典型临床症状包括学习、记忆功能下降、性格改变等。近年来，随着我国人口老龄化进程的加剧，阿尔茨海默病的发病率逐渐升高，现已成为影响老年人群生活质量的主要疾病，为家庭和社会造成了沉重的负担。目前针对阿尔茨海默病的常用治疗药物十分有限，其只能改善阿尔茨海默病的临床症状，并不能完全阻止或逆转该病的进展。因此，探索新的靶点并依此开发安全且有效的防治药物，一直是本领域的研究热点。
3.肾素-血管紧张素系统是体内最为重要的体液调节系统，其主要效应肽血管紧张素ii在体内参与水电解质、血压及细胞/器官功能的调节。新近研究表明，除循环系统外，肾素-血管紧张素系统还存在于脑中，是多种神经系统疾病，如缺血性卒中、帕金森病的治疗靶点。作为新发现的肾素-血管紧张素系统成员之一，血管紧张素-(1-4)由天冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸构成。迄今，血管紧张素-(1-4)对阿尔茨海默病的防治疗效国内外尚无报道。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明经研究，发现了小分子多肽血管紧张素-(1-4)的新用途—在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
6.提供了一种血管紧张素-(1-4)在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用。
7.进一步的，所述血管紧张素-(1-4)的结构式为(ⅰ)
[0008][0009]
进一步的，所述药物的剂型包括粉剂、注射液、胶囊、片剂、口服液。
[0010]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0011]
本发明首次证实了血管紧张素-(1-4)可减轻阿尔茨海默病模型小鼠脑内淀粉样蛋白病理及tau蛋白病理严重程度，减缓其脑内神经炎症反应，改善其认知功能。因此，血管
紧张素-(1-4)可以防治阿尔茨海默病，并可以用于制备防治阿尔茨海默病的药物。
附图说明
[0012]
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0013]
图1为血管紧张素-(1-4)可降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内淀粉样蛋白水平的示意图。每组n＝6只，组间比较采用单因素方差分析结合tukey’s事后检验法；柱状图代表三组数据的均数
±
标准差；*相较于人工脑脊液组小鼠p《0.05；
[0014]
图2为血管紧张素-(1-4)可降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内过磷酸化tau蛋白水平的示意图。每组n＝6只，组间比较采用单因素方差分析结合tukey’s事后检验法；柱状图代表三组数据的均数
±
标准差；*相较于人工脑脊液组小鼠p《0.05；
[0015]
图3为血管紧张素-(1-4)可减缓阿尔茨海默病模型小鼠脑内神经炎症反应的示意图。a：血管紧张素-(1-4)可显著降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内神经炎症因子tnf-α水平。b：血管紧张素-(1-4)可显著降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内神经炎症因子il-6水平。每组n＝6只，组间比较采用单因素方差分析结合tukey’s事后检验法；柱状图代表三组数据的均数
±
标准差；*相较于人工脑脊液组小鼠p《0.05；
[0016]
图4为血管紧张素-(1-4)可改善阿尔茨海默病模型小鼠认知功能的示意图。可见在第3-5天的水迷宫定位航行实验中，血管紧张素-(1-4)治疗组的阿尔茨海默病模型小鼠探测水下平台所需游动距离显著小于人工脑脊液组。每组n＝12只，多组间水迷宫数据采用重复测量的双因素方差分析，随后使用bonferroni事后分析法进行组间两两比较；数据使用均数
±
标准差表示；*相较于人工脑脊液组小鼠p《0.05。
具体实施方式
[0017]
下面结合附图和实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
[0018]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本技术。
[0019]
一、本实施例所采用的实验材料与方法
[0020]
1、实验试剂及耗材
[0021]
本实验所需的elisa检测试剂盒购自thermo fisher公司。
[0022]
血管紧张素-(1-4)交由medchemexpress公司合成(氨基酸序列：天冬氨酸-精氨酸-缬氨酸-酪氨酸，结构式见式(ⅰ))。
[0023][0024]
微型渗透泵购买自alzet公司。
[0025]
人工脑脊液按如下配方配置：nacl 130mmol/l，kcl 2.99mmol/l，cacl20.98mmol/l，mgcl2·
6h2o 0.80mmol/l，nahco
3 25mmol/l，na2hpo4·
12h2o0.039mmol/l，nah2po4
·
2h2o 0.46mmol/l。
[0026]
2、实验动物
[0027]
本实验所需的6月龄阿尔茨海默病模型小鼠：雄性samp8小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于南京市第一医院神经内科实验室。整个研究方案经南京市第一医院动物实验伦理委员会批准。
[0028]
3、动物分组及血管紧张素-(1-4)脑内输注
[0029]
6月龄雄性samp8小鼠被随机分为如下3组：空白对照组、人工脑脊液组、血管紧张素-(1-4)组。
[0030]
血管紧张素-(1-4)组：将血管紧张素-(1-4)溶于人工脑脊液，配置成10nmol/l的溶液，注入微型渗透泵(型号：2006，美国alzet公司；寿命：6周)中，后将微型渗透泵置于37℃生理盐水以激活。小鼠经麻醉后，于背部正中行约0.5cm的切口，使用小号血管钳深入切口，充分分离皮下组织，将激活的微型渗透泵植入其中，并连接侧脑室输注装置(型号：brain infusion kit 3，美国alzet公司)。之后分离头皮，暴露颅骨，将侧脑室输注装置固定在颅骨上，再将头皮及背部切口小心缝合。总输注时间为6周。
[0031]
人工脑脊液组：人工脑脊液组仅输注人工脑脊液。
[0032]
空白对照组：执行微型渗透泵背部植入术及侧脑室输注装置颅骨固定术，但不输注任何液体。
[0033]
4、脑内淀粉样蛋白水平检测
[0034]
使用断颈法处死小鼠，去除脑干与小脑，仔细剔除大脑表面脑膜及血管。取一侧半球，置入ep管中，按全蛋白提取试剂盒说明书提取脑组织全蛋白。采用elisa法试剂盒测定脑内淀粉样蛋白
1-42
水平。
[0035]
4、脑内过磷酸化tau蛋白水平检测
[0036]
使用断颈法处死小鼠，去除脑干与小脑，仔细剔除大脑表面脑膜及血管。取一侧半球，置入ep管中，按全蛋白提取试剂盒说明书提取脑组织全蛋白。采用elisa法试剂盒测定脑内过磷酸化tau蛋白(ser
199
位点)水平。
[0037]
6、脑内神经炎症因子水平检测
[0038]
使用断颈法处死小鼠，去除脑干与小脑，仔细剔除大脑表面脑膜及血管。取一侧半球，置入ep管中，按全蛋白提取试剂盒说明书提取脑组织全蛋白。采用elisa法试剂盒测定脑内tnf-α及il-6水平。
[0039]
7、水迷宫认知功能实验
[0040]
水迷宫认知功能实验根据vorhees等2006年公开的实验步骤进行。实验系统为直径120cm、高45cm的圆形水池，水深30cm，水温维持在22
±
3℃，水中加入无毒的白色素粉末以遮蔽动物视野。将圆形水池等分为四个象限，在池壁上以标志物标记四个象限的入水点，同时在第一象限正中放置一个直径为10cm的圆形平台，平台表面低于水面0.5cm。水迷宫上方装有摄像头，以同步记录小鼠在水中的活动状况。实验期间迷宫外参照物保持不变，实验环境保持安静。定位航行实验平台放置于第一象限，将小鼠任意从四个象限(东北、西北、东南、西南)之一面向池壁放入水中，强迫其游泳60秒来寻找隐藏于水下的平台。如果成功地找到平台，小鼠可以在平台上休息15秒；如果在60秒内未能成功找到平台，则由实验人员将小鼠手动置于站台上，同样给予15秒休息时间。如此每天训练4次，共持续5天；由电脑分析录像，记录小鼠寻找平台所用时间及路程。
[0041]
8、数据分析与统计
[0042]
本发明采用graphpad prism统计软件进行实验数据分析。数据均以均数
±
标准差标示。多组间比较采用单因素方差分析，随后组间两两比较采用tukey’s事后分析法；多组间水迷宫数据采用重复测量的双因素方差分析，随后使用bonferroni事后分析法进行组间两两比较。所有检验均采用双侧检验。p《0.05认为有统计学差异。
[0043]
二、相关实验结果
[0044]
1、血管紧张素-(1-4)可降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内淀粉样蛋白水平。
[0045]
见附图1，与人工脑脊液组相比，血管紧张素-(1-4)可显著降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内淀粉样蛋白
1-42
水平，其差异具统计学意义(p《0.05)。人工脑脊液组小鼠与空白对照组小鼠相比，脑内淀粉样蛋白1-42水平无明显差异(p》0.05)。
[0046]
2、血管紧张素-(1-4)可降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内过磷酸化tau蛋白水平。
[0047]
见附图2，与人工脑脊液组相比，血管紧张素-(1-4)可显著降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内过磷酸化tau蛋白(ser
199
位点)水平，其差异具统计学意义(p《0.05)。人工脑脊液组小鼠与空白对照组小鼠相比，脑内过磷酸化tau蛋白(ser
199
位点)水平无明显差异(p》0.05)。
[0048]
3、血管紧张素-(1-4)可减缓阿尔茨海默病模型小鼠脑内神经炎症反应。
[0049]
见附图3，与人工脑脊液组相比，血管紧张素-(1-4)可显著降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内神经炎症因子tnf-α及il-6水平，其差异具统计学意义(p《0.05)。人工脑脊液组小鼠与空白对照组小鼠相比，脑内tnf-α及il-6水平无明显差异(p》0.05)。
[0050]
4、血管紧张素-(1-4)可改善阿尔茨海默病模型小鼠认知功能。
[0051]
见附图4，在第3-5天的水迷宫定位航行实验中，血管紧张素-(1-4)治疗组的阿尔茨海默病模型小鼠探测水下平台所需游动距离显著小于人工脑脊液组(p《0.05)。使用重复测量的双因素方差分析法对上述数据进一步分析可知，血管紧张素-(1-4)可显著改善阿尔茨海默病模型小鼠空间学习能力(p《0.05)。与空白对照组小鼠相比，人工脑脊液组小鼠的空间学习能力无明显差异(p》0.05)。
[0052]
根据实验结果可知，小分子多肽血管紧张素-(1-4)可显著降低淀粉样蛋白病理及tau蛋白病理严重程度、减缓脑内神经炎症反应、改善认知功能水平。因此，血管紧张素-(1-4)可以防治阿尔茨海默病，并可以用于制备防治阿尔茨海默病的药物。
[0053]
本领域技术人员应当理解，本技术中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本技术中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

技术特征：
1.血管紧张素-(1-4)在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用。2.根据权利要求1所述的血管紧张素-(1-4)在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用，其特征在于，所述血管紧张素-(1-4)的结构式为(ⅰ)3.根据权利要求1所述的血管紧张素-(1-4)在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用，所述药物的剂型包括粉剂、注射液、胶囊、片剂、口服液。

技术总结
本发明公开了一种血管紧张素-(1-4)在制备阿尔茨海默病防治药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明首次证实了血管紧张素-(1-4)可减轻阿尔茨海默病模型小鼠脑内淀粉样蛋白病理及tau蛋白病理严重程度，减缓其脑内神经炎症反应，改善其认知功能。因此，血管紧张素-(1-4)可以防治阿尔茨海默病，并可以用于制备防治阿尔茨海默病的药物。备防治阿尔茨海默病的药物。备防治阿尔茨海默病的药物。


技术研发人员：蒋腾 付欣欣 黄志航 徐肇涵 陈帅宇 张颖冬
受保护的技术使用者：南京市第一医院
技术研发日：2023.08.09
技术公布日：2023/10/19