安吖啶在治疗β-catenin突变型肝癌中的应用

安吖啶在治疗
β-catenin突变型肝癌中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及安吖啶在治疗β-catenin突变型肝癌中的应用。


背景技术：

2.靶向联合免疫治疗成为晚期肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc，以下简称肝癌)的一线治疗方案，但是研究表明，ctnnb1突变肝癌无法从靶免治疗中获益。β-catenin由ctnnb1基因编码，是wnt/β-catenin信号通路的关键效应分子。并且β-catenin突变是肝癌中最常见的致癌突变。因此，寻找针对β-catenin突变肝癌的治疗方案对改善晚期肝癌患者生存至关重要。目前针对β-catenin突变的抗肿瘤药物主要是wnt/β-catenin信号通路抑制剂，其中靶向结合β-catenin突变是最直接的方式。现有研发的药物包括：omp-54m28、pri-724、wnt-974等，但是β-catenin突变缺乏特异性的结合位点、且空间结构复杂，难以设计高亲和力且有效的抑制剂，所以直接靶向结合β-catenin突变的方式暂未取得成功。同时，进入临床研究的抑制剂中，大多出现了较为严重的药物相关的不良事件，其中胃肠道反应、骨髓抑制性、骨毒性较明显，如呕吐、腹泻、发热、粒细胞缺乏症、血小板减少、贫血、骨折、高钙血症等。
3.临床研究表明，安吖啶(amsacrine，m-amsa)对急性白血病和淋巴瘤有活性，然而安吖啶在治疗实体肿瘤方面存在效率低、用量高、效果不显著、副作用显著等问题，不适宜临床应用。同时在肝癌实体瘤的临床实验研究中，因样本量不足，未对β-catenin突变型肝癌进行亚群分析，导致安吖啶在实体肿瘤应用方面受到限制。


技术实现要素：

4.本发明提供了安吖啶在治疗β-catenin突变型肝癌中的应用，低剂量安吖啶对β-catenin突变型肝癌有显著治疗作用，且药物副作用小。
5.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供安吖啶在制备治疗β-catenin突变型肝癌药物中的应用。
7.优选的，所述安吖啶有效浓度为1.5～20μm。
8.优选的，所述安吖啶的用量为2～10mg/kg。
9.本发明提供一种治疗β-catenin突变型肝癌的药物，所述药物包括安吖啶。
10.优选的，所述药物还包括药学上可接受的载体。
11.优选的，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂。
12.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
13.本发明首次发现低剂量安吖啶对β-catenin突变型肝癌有显著抑制作用，且药物副作用小，对β-catenin野生型肝癌细胞抑制效果不佳，拓宽了安吖啶治疗的临床适用范围，重点解决了安吖啶在实体肿瘤应用不佳的技术问题。
附图说明
14.图1β-catenin野生型和突变型肝癌细胞株构建(a.western blot检测sg-β-catenin mhcc97h单克隆细胞；b.western blot检测mhcc97hβ-catenin
wt
和β-catenin
s45p
细胞的表达情况；c.mhcc97hβ-catenin
s45p
扩增产物sanger测序峰图；d.mhcc97hβ-catenin
wt
扩增产物sanger测序峰图)。
15.图2高通量筛选特异性杀伤β-catenin
s45p
肝癌细胞的fda批准上市药物(a.药筛结果示意图；b-c.不同浓度安吖啶处理48h后mhcc97h和hcclm3细胞ec
50
结果；d.拓扑异构酶抑制剂及吖啶类似物处理48h后mhcc97h和hcclm3细胞存活结果，药物浓度10μμ处理48h；e.western blot检测γh2ax水平；d-e.实验均独立重复3次以上，所有数据均示为平均值
±
sd)。
16.图3安吖啶特异性抑制β-catenin突变型肝癌增殖(a.安吖啶治疗对肝癌皮下瘤肿瘤体积的影响(n＝7)，平均肿瘤体积
±
sem；b.安吖啶治疗后第15天肝癌皮下瘤的肿瘤大体图；c.安吖啶治疗后肝癌皮下瘤小鼠的生存曲线(n＝7)；d.安吖啶治疗后肝原位瘤小鼠的生存曲线(n＝9)；e.安吖啶治疗第1天和第10天肝原位瘤活体成像的代表性图像及第15天肝原位瘤的肿瘤大体图；f.安吖啶治疗对接种肝原位瘤小鼠的体重影响(β-catenin
wt n＝12，β-catenin
s45p n＝6)；肿瘤大小
±
sem，平均体重
±
sd；*：p《0.05；***：p《0.001；****：p《0.0001)。
具体实施方式
17.本发明提供了安吖啶在制备治疗β-catenin突变型肝癌药物中的应用。本发明所述安吖啶有效浓度为1.5～20μm，优选为2～18μm，在该有效浓度下，安吖啶显著抑制了β-catenin突变型肝癌细胞增殖，且药物副作用低。本发明所述安吖啶的用量为2～10mg/kg，优选为4～8mg/kg。
18.在本发明中，安吖啶在实体肿瘤上疗效不佳，通过体外药物筛选和ec
50
实验证明安吖啶可以特异性杀伤β-catenin突变型肝癌，对野生型肝癌无显著效果；动物实验的结果同样显示安吖啶可以抑制β-catenin突变型肝癌的生长并延长荷瘤小鼠的生存，然而对β-catenin野生型肿瘤生长及小鼠生存无治疗作用，并且安吖啶治疗β-catenin突变型肝癌具有一定的安全性，为肝癌临床转化治疗提供了前期基础。
19.本发明提供一种治疗β-catenin突变型肝癌的药物。本发明所述药物还包括药学上可接受的载体。本发明所述载体为在药物制备中所用的药用辅料，包括但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述化合物相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高所述化合物在药物制剂中稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善所述化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。
20.在本发明中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂。本发明所述药物还包括但不仅限于水溶液粉针剂、散剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂或控释剂等。
21.在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
22.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1构建β-catenin
wt
和β-catenin
s45p
肝癌细胞株
24.1.采用crisper/cas9和细胞单克隆技术构建了ctnnb1敲除的mhcc97h人源性肝癌单克隆细胞株。
25.利用mhcc97h细胞系，通过慢病毒介导sgrna敲除ctnnb1基因的表达，载体为u6-sgrna-ef1a-cas9-flag-p2a-puromycin。转染72h后，用2μg/ml嘌呤霉素筛选抗性细胞3天，继续将细胞扩大培养。为了获得稳定敲除ctnnb1基因的mhcc97h细胞，利用单克隆筛选技术分离mhcc97h sgctnnb1成单个细胞，在2μg/ml嘌呤霉素的筛选下将单个细胞扩大培养后，提取细胞总蛋白验证β-catenin蛋白表达情况。westernblot结果显示，细胞集落1的β-catenin蛋白表达水平明显下降，说明细胞集落1完全敲除了β-catenin表达，可作为ctnnb1基因敲除的单克隆细胞株(mhcc97h sgctnnb1-1)(图1a)。
26.2.在单克隆细胞株的基础上转染慢病毒过表达野生型及突变型β-catenin，构建β-catenin
wt
和β-catenin
s45p
肝癌细胞株
27.利用mhcc97h sgctnnb1-1通过慢病毒转染稳定过表达野生型、s45p点突变β-catenin，构建mhcc97hβ-catenin
wt
和β-catenin
s45p
肝癌细胞株。western blot结果显示，mhcc97hβ-catenin
wt
和β-catenin
s45p
细胞相对于空载对照组，β-catenin及靶基因gs蛋白表达水平明显上调，提示β-catenin过表达成功(图1b)。
28.为了明确β-catenin野生型和突变型肝癌细胞中ctnnb1基因序列，进一步sanger测序分析。mhcc97hβ-catenin
s45p ctnnb1基因目标片段内，sanger测序发现β-catenin第45个密码子为单峰，碱基序列由tct突变为cct，致使第45位氨基酸由丝氨酸变成脯氨酸(图1c)。mhcc97hβ-catenin
wt
细胞sanger测序峰图显示ctnnb1基因片段为野生型(图1d)。结合上述实验，得出结论为：mhcc97hβ-catenin野生型(mhcc97hβ-catenin
wt
)及s45p-β-catenin突变型(mhcc97hβ-catenin
s45p
)肝癌细胞株构建成功。
29.hcclm3β-catenin突变及野生型肝癌细胞株构建方法同上。
30.实施例2高通量药物筛选
31.1.初步筛选：fda批准上市药物库(ly-1022)购自mce公司，药物库包含2383个药物，以10mm浓度提供，药物-80℃冰箱保存。
32.1)实验设计：将β-catenin
s45p mhcc97h细胞株接种于96孔板中，调整细胞密度为5
×
103个/孔。每张板设置54个实验孔(18个药物，每个药物3种浓度)、6个对照孔、6个空白对照孔。对照孔中接种细胞，但仅添加完全培养基及药物相同体积的溶解液；空白对照孔中不接种细胞仅添加完全培养基。
33.2)药物筛选实验：细胞贴壁后，使用完全培养稀释各药物原液至5、10、20μm，100μl/孔，添加入实验孔中培养48h。药物处理48h后，移除培养基，每孔加入含10％cck-8的完全培养基，总计100μl。在37℃，5％co2细胞培养箱中避光孵育2h，随后酶标仪检测450nm波长下各孔吸光度值(od值)。
34.3)药筛实验数据分析：计算细胞活力＝(实验孔吸光度值-空白对照孔吸光度值)/
(对照孔吸光度值-空白对照孔吸光度值)。以细胞活力小于等于0.4作为药物对细胞具有显著抑制效应的标准。为了尽可能筛选满足对β-catenin突变肝癌显著抑制效应的药物，只要在任一浓度处理后细胞活力低于或等于0.4，即可以筛选为候选药物。通过对β-catenin
s45p
mhcc97h细胞株中三种浓度药物处理后的细胞活力进行整合，筛选出338种药物。接下来将得到对β-catenin突变型肝癌细胞具有抑制效应的“候选药物”进行二次筛选。
35.2.二次筛选
36.1)实验设计同初次筛选；
37.2)药物筛选实验：细胞贴壁后，使用完全培养基将初次筛选“候选药物”的药物原液稀释至5、10、20μm，100μl/孔，添加入实验孔中培养48h。cck-8实验同初次筛选步骤。
38.3)药筛实验数据分析：计算细胞活力，以细胞活力小于等于0.4作为药物对细胞具有显著抑制效应的标准，以细胞活力大于等于1.5作为药物对细胞具有显著促进效应的标准。为了尽可能减少抑制生理β-catenin信号通路带来的不良事件，首先剔除对β-catenin野生型肝癌细胞有明显效应的药物，即保留在5、10、20μm浓度处理48h后mhcc97hβ-catenin
wt
的细胞活力在0.4-1.5之间的药物。且同时对β-catenin
s45p mhcc97h细胞具有显著抑制效应的药物，即在5、10、20μm浓度处理48h后mhcc97hβ-catenin
s45p
的细胞活力低于0.4的药物。共得到35个药物，作为“阳性药物”进行再次筛选。
39.3.再次筛选
40.1)实验设计同初次筛选；
41.2)药物筛选实验：细胞贴壁后，使用完全培养基将二次筛选“阳性药物”的药物原液稀释至5、10、20μm，100μl/孔，添加入实验孔中培养48h。cck-8实验同初次筛选步骤。
42.3)药筛实验数据分析：为了获得明显区分野生型和突变型β-catenin的药物，再次筛选中设定药物处理后β-catenin突变型肝癌细胞活力小于0.4，并且野生型与突变型细胞生存活力比值高于两倍以上作为阳性药物的筛选标准。在二次筛选中得到的35个对β-catenin野生型肝癌细胞无明显效应的药物中再次筛选出8个药物。这8个药物仅针对β-catenin突变型肝癌细胞有明显抑制作用，对生理β-catenin信号通路无明显抑制作用。其中包括抗肿瘤药物有5个，拓扑异构酶抑制剂1个和核苷酸类似物4个。在该次筛选时，根据二次筛选时具有杀效应的最低药物浓度再次验证，最终发现安吖啶可以区分β-catenin野生型和突变型的肝癌细胞，并特异性杀伤β-catenin
s45p
突变肝癌细胞。整个筛选过程见图2a。
43.实施例3安吖啶对β-catenin野生型及突变型肝癌细胞的影响
44.1.ec
50
试验：将处于对数生长期，且生长状态良好的人源性肝癌细胞mhcc97hβ-catenin
wt
及β-catenin
s45p
肝癌细胞或hcclm3β-catenin
wt
及β-catenin
s45p
肝癌细胞分别接种至96孔板中，调整细胞密度为5
×
103/孔。培养24h，待细胞贴壁后，利用安吖啶分别处理β-catenin突变型肝癌细胞和β-catenin野生型肝癌细胞。安吖啶处理浓度为10-3
、10-2
、10-1
、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2、64、80、100、200、400和800μm。持续培养48h后更换为含10％cck-8溶液的完全培养基100μl继续培养2h，利用酶标仪检测450nm处od值，计算细胞活力，细胞抑制率＝1-细胞存活率。
45.结果表明，在mhcc97hβ-catenin
wt
及β-catenin
s45p
肝癌细胞中，安吖啶的ec
50
分别是12.35μm、2.65μm；在hcclm3β-catenin
wt
和β-catenin
s45p
肝癌细胞中，安吖啶的ec
50
分别是
17.18μm、8.33μm(图2b-c)。以上结果证实了：安吖啶在两株人源性肝癌细胞中都对β-catenin突变型肝癌具有更加特异性的杀伤作用。
46.2.与安吖啶具有相似分子结构和作用机理的药物对β-catenin野生型和突变型肝癌细胞的影响
47.将fda批准上市的药物库中的18个拓扑异构酶抑制剂和3个吖啶类似物分别处理β-catenin野生型和突变型肝癌细胞(处理方式同该实施例步骤1)，经10μm浓度处理48h后发现，仅有安吖啶在mhcc97h及hcclm3肝癌细胞系中都表现出了特异性杀伤β-catenin突变肝癌的作用(图2d)。并且安吖啶处理对dna损伤修复关键蛋白γh2ax的表达无特异性影响(图2e)。这表明，安吖啶对β-catenin突变型肝癌特异性抑制效应可能不依赖于拓扑异构酶抑制剂及吖啶分子结构的作用机理。
48.实施例4安吖啶对小鼠皮下和肝原位肿瘤的治疗作用
49.1.构建稳定过表达荧光素酶基因的肝癌细胞株
50.委托上海吉凯基因化学技术有限公司构建ubi-mcs-firefly_luciferase-ires-puromycin慢病毒。将稳定过表达β-catenin野生型和突变型的hepa1-6细胞分别接种于6孔板中，调整细胞密度至1
×
105个/孔。待细胞贴壁后，移除完全培养基并用pbs缓冲液轻柔冲洗细胞。去除pbs液体，加入1ml不含血清的dmem培养基、40μlhitransg p病毒感染增强液及过表达慢病毒液(moi＝10)。液体摇晃混匀后，细胞置于细胞培养箱中继续培养。12h后倒置显微镜下观察细胞的形态，更换培养基为1ml不含血清的dmem培养基培养。培养72h后更换为含有2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基筛选细胞3天，将剩余的细胞用完全培养基扩大培养即可获得稳定过表达荧光素酶基因的β-catenin野生型或突变型hepa1-6细胞株。
51.2.实验动物和处理
52.由南方医科大学动物中心提供雌性c57bl/6小鼠(4-6周龄)。
53.小鼠皮下瘤模型的构建：将鼠源性肝癌细胞(5
×
106个)皮下种植在c57bl/6小鼠的右后背部；计算肿瘤体积：长
×
宽2/2。当肿瘤达到约300mm3时进行治疗，随机分组，每2天测量一次肿瘤体积。出于动物伦理考虑，当肿瘤的体积达到1500mm3的时候断颈处死小鼠，无害化处理。将终点指定为开始治疗后的第15天。
54.小鼠原位癌模型的构建：通过腹腔内注射1％戊巴比妥钠溶液麻醉c57bl/6小鼠。碘伏消毒后于上腹部正中切口暴露肝脏，并将1
×
106鼠源性肝癌细胞缓慢注入肝包膜下，然后关闭腹腔。利用小动物活体成像仪(ivis@lumina ii system)检测肝原位癌生物发光，当肿瘤总roi达到106时进行治疗，每隔5天利用活体成像检测肝原位癌荧光强度变化。治疗开始的第1、8天，对小鼠进行尾静脉注射安吖啶(8mg/kg或4mg/kg)，并记录小鼠体重变化。治疗14天后，处死小鼠，并切除肝脏称重，用于后续实验。
55.3.小鼠活体成像实验
56.用无菌pbs缓冲液溶解d-荧光素钾盐，配制成15mg/ml的储存液，利用0.22μm滤膜过滤除菌后，避光-20℃冰箱保存。检测前每只小鼠上腹部体表去毛，腹膜内注射1％戊巴比妥钠溶液麻醉，按10ul/g腹腔注射15mg/ml荧光素钾盐溶液5-10min后显像。每次取5只小鼠，调整小鼠体位为仰卧位，暴露肿瘤位置。曝光条件：10bin、视野、曝光时间60s。拍照结束后利用aura软件圈出肿瘤部位获得roi值。
57.4.统计学方法
58.上述设计检测的实验均独立重复3次以上，多组间比较使用one-way anova方差分析，两组间比较使用student’s t检验分析，小鼠体重比较使用配对student’s t检验分析。除肿瘤体积变化外，所有数据均示为平均值
±
sd，而肿瘤体积变化数据均示为平均值
±
sem。使用kaplan-meier方法分析不同组小鼠的存活曲线。使用对数秩mantel-cox检验比较生存数据。p《0.05被认为具有统计学意义。所有数据均使用graphpad prism 7统计。
59.小鼠动物实验结果证明，安吖啶可以有效区分β-catenin野生型和突变型肝癌，并特异性抑制β-catenin突变型肝癌的肿瘤生长且延长小鼠的生存时间(图3a-e)。安吖啶用药前后肝原位瘤荷瘤小鼠体重变化并无明显差异，说明安吖啶治疗肝癌具有一定的安全性(图3f)。
60.综上所述，安吖啶可以特异性杀伤β-catenin突变型肝癌，且药物副作用低，但对β-catenin野生型肝癌无治疗作用。
61.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.安吖啶在制备治疗β-catenin突变型肝癌药物中的应用。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述安吖啶有效浓度为1.5～20μm。3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述安吖啶的用量为2～10mg/kg。4.一种治疗β-catenin突变型肝癌的药物，其特征在于，所述药物包括安吖啶。5.如权利要求4所述药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。6.如权利要求4所述药物，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂。

技术总结
本发明提供安吖啶在治疗β-catenin突变型肝癌中的应用，属于医药技术领域。本发明通过药物筛选发现安吖啶特异性杀伤β-catenin突变型肝癌，并在动物实验上证明了低剂量安吖啶对β-catenin突变肝癌具有治疗效应，药物副作用小，对β-catenin野生型肝癌治疗不佳。可见本发明拓宽了安吖啶治疗的临床适用范围，解决了安吖啶在实体肿瘤应用不佳的技术问题。决了安吖啶在实体肿瘤应用不佳的技术问题。决了安吖啶在实体肿瘤应用不佳的技术问题。


技术研发人员：孙景苑 曹传辉 高鑫娜 肖雅之 何欣容 罗泳仪 陈艺瑶
受保护的技术使用者：南方医科大学南方医院
技术研发日：2023.08.15
技术公布日：2023/10/19