CLIP1-LTK融合蛋白抑制剂的医药用途

clip1-ltk融合蛋白抑制剂的医药用途
技术领域
1.本发明属于制药领域，涉及clip1-ltk融合蛋白抑制剂的医药用途，具体是clip1-ltk融合蛋白抑制剂在制备制备治疗clip1-ltk基因融合阳性的非小细胞肺癌相关疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.基因融合(gene fusion)是指由于某种机制如易位或与其他染色体重排使得两个不同基因的部分序列或全部序列融合到一起，形成了一个新的基因的现象。由基因融合激活的蛋白激酶是与造血系统恶性肿瘤和实体瘤相关的一类重要的诱发因素。融合基因的蛋白产物通常是开发抗癌药物的理想靶点。
3.2021年11月，《自然》杂志上发表的一篇文献表明，在0.4％的非小细胞肺癌病人中发现了由cap-gly结构域连接蛋白1(cap-gly domain-containing linker protein 1，clip1)的16号外显子与白细胞酪氨酸激酶(leukocyte tyrosine kinase，ltk)的11号外显子的序列融合而成的clip1-ltk融合表达转录本(图1)。实验表明，表达clip1和ltk的nih3t3成纤维细胞和ba/f3原b淋巴细胞没有发生致癌转化，而表达clip1-ltk融合蛋白的则发生了致癌转化。证实了clip1-ltk融合蛋白是依赖于其自身激酶活性的全新的致癌驱动因子，可作为非小细胞肺癌靶向治疗药物开发的关键靶标。
4.目前研究表明，clip1-ltk融合蛋白在完整ltk激酶结构域的上游含有clip1蛋白的多个卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)。卷曲螺旋结构域会促进ltk蛋白的二聚化，促使672位的酪氨酸残基磷酸化，从而组成性地持续激活ltk的激酶活性，磷酸化ltk进一步激活下游的akt和mapk等信号通路，促进细胞的增殖和存活，引发细胞的致癌转化。野生型ltk结构中由于不包含clip1蛋白中的卷曲螺旋结构域，不能够激活ltk的激酶活性。因此，clip1与ltk的蛋白融合是细胞致癌转化的关键。更重要的是，clip1-ltk融合基因阳性的肿瘤样本中，其它已知的致癌驱动基因检测均呈阴性，表明clip1-ltk融合基因与其他已知的驱动基因是相互排斥的，有望成为clip1-ltk融合阳性癌症患者治疗的黄金靶点。
5.目前，尚未有针对clip1-ltk融合蛋白开发的选择性抑制剂的报导。由于ltk与alk的蛋白激酶域具有较高的同源性，因此推测alk的抑制剂也有可能结合ltk的激酶域并抑制ltk的活性。经过实验证实，克唑替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和恩曲替尼这五种药物对ltk都表现出一定的抑制活性，但相较于对alk的活性均有大幅度的降低。开发更特异ltk抑制剂以扩展临床用药选择是本领域技术人员需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供clip1-ltk融合蛋白抑制剂的医药用途，所述用途是这类clip1-ltk融合蛋白抑制剂在制备治疗clip1-ltk基因融合阳性的非小细胞肺癌相关疾病的药物中的应用，所述非小细胞肺癌相关疾病为除小细胞肺癌以外与肺上皮的各种类型癌症疾病的集合体，常见类型有鳞状细胞癌，腺癌、大细胞癌，临床表现为咳嗽、胸痛、咯血、呼
吸困难和体重减轻等。
7.所述clip1-ltk融合蛋白抑制剂的化合物结构具体如下表所示。
8.表1
9.所述药物包括其药学上可接受的盐、前药、立体异构体、氘代物以及溶剂合物中的任意一种。
10.本发明提供的化合物是结构新颖的clip1-ltk融合蛋白抑制剂，对clip1-ltk融合蛋白具有一定的抑制效果，可以抑制clip1-ltk依赖性细胞系(ba/f3-clip1-ltk)的异常增殖从而阻止细胞的致癌转化，因此，可将所述化合物作为clip1-ltk融合蛋白抑制剂应用于治疗非小细胞肺癌。
附图说明
11.图1为各化合物和阳性化合物lorlatinib抑制率以及ic50测试值。
12.图2为karmadock和其他模型在dekois2.0数据集上的筛选能力(bed_roc,ef_0.5％,ef_1％,ef_5％)和分类精度(roc_auc和pr_auc)。数值越大，表示性能越好。
具体实施方式
15.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
16.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
17.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
18.实施例1
19.一、基于结构的虚拟筛选
20.实验原理：利用基于结构的虚拟筛选，对化合物数据库中的化合物与clip1-ltk之间的结合模式和结合自由能进行预测，筛选能够和clip1-ltk结合的小分子化合物。
21.实验方法：(1)同源建模：由于pdb中目前尚无clip1-ltk蛋白的晶体结构，与clip1-ltk蛋白具有高度序列相似性的alk蛋白被用作模板，采用swiss-model和alphafold2来同源建模clip1-ltk的蛋白结构；(2)化合物库获取：测试了包含156万分子的chemdiv库；(3)蛋白结构预处理：dinger 2020中的protein preparation wizard被用于蛋白质结构预处理，包括了移除溶剂、重新加氢、在ph＝7.0的环境下质子化、调整键级、填补缺失的侧链和loop区、调整氢键网络并基于opls3力场进行能量最小化。预处理结束后，根据alk中解析出的共晶配体半径截取clip1-ltk蛋白的口袋；(4)图生成：用python中的torch_geometric库为蛋白和小分子生成图数据文件并储存；(5)虚拟筛选：利
用自研的深度学习对接软件karmadock对clip1-ltk蛋白和两个分子库进行虚拟筛选；(6)过滤：选取打分前10000的化合物进行过滤，去除不符合以下成药性规则的化合物：1)logp/logd(ph＝7.0)《5.5；2)违反lipinski五规则；3)违反opera的药物相似性规则；4)功能官能团没有毒性、反应性或reos规则定义的其他不良部分；(7)聚类：使用discovery studio 2.5中的find diversity molecule模块，根据fcfp_4指纹计算出的tanimoto距离对其余分子进行聚类；(8)可视化分析：从每一类分子中采样，分析其与蛋白的相互作用模式，保留与蛋白形成良好相互作用模式的分子。最后从chemdiv购买了21个化合物进行实验测试。
22.实验结果：筛选得到21个潜在clip1-ltk抑制剂，并拥有不同的化学骨架，其结构式如表1。
23.表1
24.二、化合物抗细胞增殖活性评价实验
25.实验原理：噻唑蓝，简称mtt。细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。
26.实验方法：对上述虚拟筛选得到的活性较好的化合物，在构建的ba/f3-clip1-ltk细胞系中采用mtt比色法进行细胞增殖活性评价。实验中使用不含il-3的rpmi-1640培养基制备ba/f3-clip1-ltk细胞悬液，在96孔板中每孔接种90μl(104个/孔)，在细胞培养箱中静置2h后加入10μl浓度梯度化合物或dmso。培养72h后每孔加入10μl mtt(5mg/ml)，孵育4h后加入100μl sds-hcl-pbs三联缓冲液过夜。使用酶标仪检测570nm处各孔的吸光度值，数据处理后拟合化合物浓度与细胞活力的量效关系曲线，得到化合物的定量抗细胞增殖活性值
(ic
50
)。
27.实验结果：化合物对于clip1-ltk的抑制活性如图1。实验结果表明本文所述化合物对clip1-ltk基因融合致癌转化的baf3细胞有增殖抑制活性，有应用于治疗clip1-ltk基因融合阳性的非小细胞肺癌的潜力。其中zxj06在筛选得到的化合物中抑制活性最好，ic
50
＝522.4nm。
28.三、karmadock：基于深度学习的分子对接模型
29.模型架构：(1)图表征：首先将分子表征为2维的分子图，以原子为节点，共价键为边，节点特征和边特征见表2；将蛋白以氨基酸残基为节点，残基内的cα的坐标作为节点坐标，利用k最近邻算法连接距离节点最近的30个邻居节点，从而构建残基图，节点表征和边表征除了常规的2维信息，还包含了三维的几何信息(详见表3)。(2)encoder：分子图和残基图分别输入两个不同的encoder，graph transformer(gt)和geometric vector perceptrons(gvp)，来学习图内部的拓扑连接关系和分子内相互作用并更新节点表征。(3)构建相互作用图：把蛋白残基节点和分子原子节点放到一张图中，除了原有的边以外，遍历所有的残基图节点-分子图节点对并新增边，同样分子图内部所有节点也两两形成边。分子图按照分子的可旋转键分割成若干个片段，每个片段在对接过程中可以看作是刚体，其两两节点之间的距离是不变的。边的特征为边的类型(单键、双键、三键、芳香键和非键相互作用)以及节点间距离，其中蛋白节点间的距离以及分子图中片段内节点间距离是根据节点真实坐标进行计算，蛋白节点和分子节点间距离以及分子图中不同片段节点间的距离被编码为-1。(4)构象预测模块：如图1所示，这个模块采用了8层堆叠的e(n)equivariant graph neural network(egnn层)来预测蛋白质和配体之间形成的稳定结合构象。在构象生成后，对构象进行后处理来保证构象的键长键角的合理性。有两种后处理的方式：1)力场优化：用rdkit的mmff94力场对优化后的构象进行10步的minimization，来优化构象；2)rdkit构象叠合：把模型预测的分子构象的可旋转键的扭转角计算出来，赋予rdkit生成的合理构象相同的扭转角，再叠合预测的点云构象和rdkit构象的方位。(5)打分模块：该模块首先两两组合蛋白节点和分子节点，将蛋白-分子节点对的节点特征拼合，通过线性层、batch normalization、elu和dropout来获得蛋白-分子节点对之间的融合特征表示，然后通过三个不同的(线性层+elu)预测蛋白配体节点间最小距离的分布的均值、标准差和组合系数。在训练的时候，首先训练mdn模块(打分模块)，待mdn模块收敛后，再训练egnn模块(集合构象预测模块)。因为mdn模块学习了蛋白质残基和配体原子对之间的距离的最优分布，且encoder是mdn模块和egnn模块共享的，所以，在学习mdn模块时能够给encoder模块引入残基-原子距离最优分布这样一个归纳偏置，有利于模型减少结合构象的搜索空间，从而帮助模型学习如何快速精确的找到蛋白质和配体的稳定结合构象。在实际应用的时候，先用egnn模块预测出蛋白质和小分子配体的结合构象再输入到mdn模块中进行结合强度的预测。
30.实验方法：
31.实例1：结合构象的预测精度和速度在pdbbind 2020数据集上对比了karmadock和传统对接软件以及基于深度学习的结合构象预测模型的预测的构象的精度和速度。
32.实例2：结合强度的预测精度
对比了karmadock和传统对接软件/深度学习打分函数在casf数据集上的对接能力和筛选能力，其中对接能力是看模型能否从同一个蛋白配体复合物的多个结合构象中挑选出最优的结合构象，筛选能力是看模型能否根据打分把活性分子富集靠前。这两个能力对虚拟筛选的命中率影响很大，因此我们着重于模型的这两个能力。
33.实例3：在虚拟筛选数据集dekois2.0上测试模型作为对接软件的性能在虚拟筛选中，对接构象的准确性和结合亲和力的准确性对于命中率都有着至关重要的影响，没有准确的结合构象，即使有高精度的亲和力预测模型也无法准确预测结合亲和力；没有高精度的结合亲和力预测模型，没有准确的结合构象也无法给出真实的结合亲和力。我们用karmadock在dekois2.0上进行了虚拟筛选测试。
34.对实施例方案的描述旨在解释本发明的原理及举例其实际应用，以便本领域其他技术人员能够利用本发明进行实现及修改。本发明的范围由权利要求书及其等同形式所限定。
35.实验结果：
36.实例1：结合构象的预测精度和速度如表4所示，karmadock在refined set上取得了第二的对接精度和最快的对接速度；在剩下的测试集上均取得了最高的精度和最快的速度。
37.实例2：结合强度的预测精度如表5所示，karmadock在打分能力和筛选能力都取得了第二名的好成绩，说明karmadock能够很好的预测蛋白质和配体的结合强度。
38.实例3：在虚拟筛选数据集dekois2.0上测试模型作为对接软件的性能如图2，实验结果表现karmadock能够在一众传统的对接模型和深度学习模型中取得最好的富集能力。
39.表2.分子图的节点特征和边特征abool2value指把布尔变量转换成数字，true对应1，false对应0.
40.表3.残基图中的节点和边的表征
41.表4.各个模型在不同测试集上的对接速度和精度
42.a
speed记录了预测单个结合构象所花费的秒数(ligpose只公开了加速倍率，没有具体的时间数值)；b精度在所有预测的构象中，被预测成功(预测构象和真实构象的rmsd小于等于)的构象的比例；cdl表示为深度学习模型；ddk表示为传统对接软件；eligpose当前测试集下表现最好的模型会被加粗显示；fkarmadock在pdbbind general excluding refined set数据集上训练得到；gkarmadock raw在pdbbind general set训练得到；hkarmadock ff以及ikarmadock aligned在karmadock raw的基础上增加了后处理；jtankbind我们给定了tankbind正确的口袋。
43.表5.模型在casf 2016上的对接能力和筛选能力
44.a
success rate,一种用于衡量模型对接能力的指标,成功预测的构象的数量(rmsd≤)与所有测试的构象的数量之比；bef 1％(富集因子),一种用于衡量模型筛选能力的指标,衡量打分排名前1％的分子中的活性分子的占比和活性分子在整个化合物库中的占比的比例；cdl表示深度学习模型；dhb表示深度学习和传统对接模型的混合模型；edk表示传统对接软件。

技术特征：
1.一种clip1-ltk融合蛋白抑制剂在制备治疗非小细胞肺癌相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌相关疾病为除小细胞肺癌以外与肺上皮的各种类型癌症疾病的集合体，常见类型有鳞状细胞癌，腺癌、大细胞癌，临床表现为咳嗽、胸痛、咯血、呼吸困难和体重减轻。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，clip1-ltk融合蛋白抑制剂通过抑制clip1-ltk依赖性细胞系的异常增殖从而阻止细胞的致癌转化。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述clip1-ltk融合蛋白抑制剂的化合物结构如下所示：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括其药学上可接受的盐、前药、立体异构体、氘代物以及溶剂合物中的任意一种。

技术总结
本发明提供一种CLIP1-LTK融合蛋白抑制剂在制备治疗非小细胞肺癌相关疾病的药物中的应用，所述非小细胞肺癌相关疾病为除小细胞肺癌以外，所有来源于肺上皮的各种类型癌症疾病的集合体，常见类型有鳞状细胞癌，腺癌、大细胞癌，临床表现为咳嗽、胸痛、咯血、呼吸困难和体重减轻。本发明提供的化合物是结构新颖的CLIP1-LTK融合蛋白抑制剂，对CLIP1-LTK融合蛋白具有一定的抑制效果，通过抑制CLIP1-LTK依赖性细胞系(Ba/F3-CLIP1-LTK)的异常增殖从而阻止细胞的致癌转化，因此，可将所述化合物作为CLIP1-LTK融合蛋白抑制剂应用于治疗非小细胞肺癌。胞肺癌。


技术研发人员：潘培辰 侯廷军 张徐俊 渠旺林 陈世诚
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/19