棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55共培养的培养基及其生防制剂的制作方法

棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养的培养基及其生防制剂
技术领域
1.本发明涉及菌种共培养技术领域，特别是涉及棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养的培养基及其生防制剂。


背景技术：

2.烟草疫霉(phytophthora nicotianae)在世界范围内广泛分布，主要能够引起烟草黑胫病、柑桔根腐病等毁灭性病害，严重制约着经济作物的可持续发展。根据病原菌的来源将烟草疫霉归类为土传病原菌，在其所有的生长阶段都会引起病害。
3.在土传病害的防治中，土壤颗粒使药剂向植物表面的递送变得困难，限制了药剂防病效果，此外，根系分泌物为植物病原菌和其他土壤微生物提供养分的过程也影响病害防控。生物防治作为化学防治的替代手段，受到越来越多的关注，尤其考虑到农药对人类健康的危害。有益微生物通过分泌抗菌化合物、产生铁载体、溶解不溶性磷酸盐和分泌抗生素等多种途径来促进植物生长和防治植物病害。生物防治具有节约成本、减少农药使用和可持续等优势。木霉属(trichoderma spp.)和芽孢杆菌属(bacillus spp.)是生物防治中应用极为广泛的两个微生物属。这两类微生物均能够产生广泛的抗菌代谢物，但在很多共培养过程中，芽孢杆菌属会抑制木霉的生长，从而干扰两个物种抗菌次级代谢产物的产生。因此，优化构建有利于微生物生长和抗菌次级代谢物生产的共培养系统具有实际应用价值。现有研究中，虽然构建了棘孢木霉hg1和芽孢杆菌tpb55的共培养体系，但其共培养过程中两株菌的菌量未达到预期效果。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了棘孢木霉(trichoderma asperellum)hg1与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tpb55共培养的培养基及其生防制剂。本发明通过筛选碳源，优化发酵条件，提高了共培养菌株的菌量，同时提高抗菌活性，并进行盆栽实验，获得显著的作用效果。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种棘孢木霉(trichoderma asperellum)hg1与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tpb55共培养的培养基，包括以下质量百分含量的组分：酵母粉1.8～2.2％、玉米粉0.8～1.2％、碳源0.8～1.2％和余量的水；所述碳源包括：半乳糖和l-丙氨酸的混合物或糊精。
7.优选的，所述半乳糖和l-丙氨酸的混合物中半乳糖和l-丙氨酸的质量比为1：1。
8.本发明还提供了一种生防制剂的制备方法，包括：
9.将棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55在上述技术方案所述的培养基中共培养，得到共培养液或无菌共培养液为所述生防制剂。
10.优选的，所述共培养的方法包括：先在所述培养基中接种棘孢木霉hg1孢子液，24h
后接种所述枯草芽孢杆菌tpb55孢子液。
11.优选的，棘孢木霉hg1孢子液与枯草芽孢杆菌tpb55孢子液的接种体积比为10：1；所述棘孢木霉hg1孢子液的孢子浓度为1
×
106cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌tpb55孢子液的孢子浓度为1
×
106cfu/ml。
12.优选的，所述棘孢木霉hg1孢子液和所述培养基的体积比为1：100。
13.优选的，所述共培养的温度为28℃，所述共培养的时间为14d。
14.优选的，当所述生防制剂为共培养液时，所述培养基中的碳源为糊精；当所述生防制剂为无菌共培养液时，所述培养基中的碳源为半乳糖和l-丙氨酸的混合物。
15.优选的，得到共培养液后，还包括：将所述共培养液过滤，得到发酵液；将所述发酵液用乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，得到菌液提取物为所述生防制剂。
16.本发明还提供了利用上述技术方案所述制备方法制备得到的生防制剂在防治烟草疫霉中的应用。
17.有益效果：
18.本发明提供了一种棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养的培养基，包括以下质量百分含量的组分：酵母粉1.8～2.2％、玉米粉0.8～1.2％、碳源0.8～1.2％和余量的水；所述碳源包括：半乳糖和l-丙氨酸的混合物或糊精。本发明通过筛选碳源，优化发酵条件，改善了棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养菌量较小的问题，通过改变碳源刺激具有抑菌活性的次级代谢物的产生并提高对烟草疫霉的抑制作用，在盆栽防病试验中也取得显著的效果。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
20.图1为hg1碳源筛选结果；
21.图2为tpb55碳源筛选结果；
22.图3为糊精发酵菌液提取物对烟草疫霉的抑制效果；
23.图4为多种化合物构型图；
24.图5为(e)-7,9-二烯-11-羰基十八酸甲酯(浓度为0.3mg/ml)对烟草疫霉的抑制效果。
具体实施方式
25.本发明提供了一种棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养的培养基，包括以下质量百分含量的组分：酵母粉1.8～2.2％、玉米粉0.8～1.2％、碳源0.8～1.2％和余量的水；所述碳源包括：半乳糖和l-丙氨酸的混合物或糊精。本发明所述棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55公开于文献【xi-fen zhang,qing-yu li,mei wang,si-qi ma,yan-fen zheng,yi-qiang li,dong-lin zhao,cheng-sheng zhang.2e,4e-decadienoic acid,a novel anti-oomycete agent from coculture ofbacillus subtilis and trichoderma asperellum.microbiology spectrum,10.4】。
26.在本发明中，所述培养基包括酵母粉1.8～2.2wt.％，优选为2wt.％。
27.在本发明中，所述培养基包括玉米粉0.8～1.2wt.％，优选为1wt.％。
28.在本发明中，所述培养基包括玉米粉0.8～1.2wt.％，优选为1wt.％。
29.在本发明中，所述半乳糖和l-丙氨酸的混合物中半乳糖和l-丙氨酸的质量比优选为1：1。本发明通过筛选碳源和优化发酵条件，改善了棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养菌量较小的问题，通过改变碳源刺激具有抑菌活性的次级代谢物的产生并提高对烟草疫霉的抑制作用，在盆栽防病试验中也取得显著的效果。
30.本发明还提供了一种生防制剂的制备方法，包括：
31.将棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55在上述技术方案所述的培养基中共培养，得到共培养液或无菌共培养液为所述生防制剂。
32.在本发明中，所述共培养的方法优选包括：先在所述培养基中接种棘孢木霉hg1孢子液，24h后接种所述枯草芽孢杆菌tpb55孢子液；棘孢木霉hg1孢子液与枯草芽孢杆菌tpb55孢子液的接种体积比优选为10：1；所述棘孢木霉hg1孢子液的孢子浓度优选为1
×
106cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌tpb55孢子液的孢子浓度优选为1
×
106cfu/ml；所述棘孢木霉hg1孢子液和所述培养基的体积比优选为1：100；所述共培养的温度优选为28℃，所述共培养的时间优选为14d。
33.在本发明中，当所述共培养液为所述生防制剂时，所述培养基中的碳源优选为糊精；当所述无菌共培养液为所述生防制剂时，所述培养基中的碳源优选为半乳糖和l-丙氨酸的混合物。本发明所述无菌共培养液为共培养后进行无菌处理得到的无菌共培养液。
34.得到共培养液后，优选还包括：将所述共培养液过滤，得到发酵液；将所述发酵液用乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，得到菌液提取物为所述生防制剂。
35.本发明还提供了利用上述技术方案所述制备方法制备得到的生防制剂在防治烟草疫霉中的应用
36.本发明构建了棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55的共培养体系，并从中分离出了抗烟草疫霉活性物质——癸二烯酸(ec
50
＝34.59μg/ml)，并通过优化共培养体系的条件进而刺激有抑菌活性的新次级代谢物的产生，提高对疫霉的抑菌效果将为新颖共培养生防菌剂和天然产物农药的开发提供技术支持和理论指导，具有重要的社会和经济意义。
37.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养的培养基及其生防制剂进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.实施例1
39.1、单菌株碳源筛选
40.(1)用biolog ff微孔板测定棘孢木霉hg1对各种碳源的利用率。根据微孔板的操作说明，用棉签蘸取在pda培养基上培养5d的hg1，接入接种液(ff-if)中，采用浊度仪测量浊度，配制细胞浓度为75％的菌悬液。将菌悬液按每孔100μl的量加入至biologff微孔板中，28℃的条件下培养14d。培养期间每24h用microstation分析仪在750nm波长下定量检测每孔的色度和浊度反应。
41.(2)采用biolog geniii微孔板测定枯草芽孢杆菌tpb55对各种碳源的利用率。根据微孔板的操作说明用棉签蘸取在na培养基上培养2d的tpb55接种到接种液(b)中，配制成90～98％细胞浓度的菌悬液。将菌悬液按每孔100μl的量加入至biolog geniii微孔板中，
28℃下培养48h。期间每隔12h用microstation分析仪在590nm波长下定量检测每孔的色度和浊度反应。
42.(3)筛选结果
43.得到hg1和tpb55共同偏好的碳源、hg1偏好的碳源及tpb55偏好的碳源如表1及图1及图2所示。2种菌株共同偏好的碳源共6种，各自偏好的碳源分别有4种和3种，将两种菌株各自偏好的碳源进行组合，共得到12种碳源组合。
44.表1碳源偏好
45.共同偏好hg1偏好tpb55偏好a-d-葡萄糖d-半乳糖l-苹果酸蔗糖a-d-乳糖l-乳酸d果糖γ-氨基丁酸l-丙氨酸d山梨醇木糖-d甘露醇
‑‑
糊精
‑‑
46.2、共培养时间及比例筛选
47.(1)从筛选出的碳源中任选3种进行测试，以确定共培养的时间及菌株比例。培养基为ymc，具体含有以下百分含量的组分：酵母粉2％，玉米粉1％，碳源1％和蒸馏水96％。
48.(2)棘孢木霉hg1在pda平板中28℃培养10d，无菌水清洗并收集孢子，于countstar血细胞计数板中加入20μl孢子悬浮液，采用countstar细胞计数仪测量孢子数量。用无菌水将孢子浓度稀释至1
×
106cfu/ml，得到hg1孢子悬浮液。于250mlymc培养基中加入所述hg1孢子悬浮液。
49.枯草芽孢杆菌tpb55于na平板中28℃培养2d，接入nb培养基中，180rpm，28℃条件下培养24h，将200μl菌液加入微孔板中，采用酶标仪测量菌液od
600
值，无菌水稀释至1
×
106cfu/ml，得到tpb55孢子悬浮液。
50.共培养的时间及菌株比例设置如表2所示。
51.表2共培养时间及比例条件设置
[0052][0053]
注：hg1与tpb55的体积比为1:1时，二者的接种体积浓度均为1％；hg1与tpb55的体积比为10:1时，hg1的接种体积浓度为1％，tpb55的接种体积浓度为0.1％。
[0054]
根据表2的接种顺序和体积比将tpb55孢子悬浮液与hg1孢子悬浮液同时接入ymc培养基中，或先将hg1孢子悬浮液接入ymc培养基中24h后，再将将tpb55孢子悬浮液接入ymc培养基中。将上述体系在180rpm、28℃下培养14d。
[0055]
pda平板中加入抗生素氯霉素0.5％、链霉素0.5％，na平板中加入制霉菌素0.5％、放线菌酮0.5％。用无菌水按浓度梯度(10-2
，10-3
，10-4
，10-5
)稀释发酵液，涂板观察菌落生长
情况。
[0056]
(3)筛选结果hg1及tpb55长势较为均衡的培养条件如表3所示，在hg1与tpb55接种比例为10:1，顺序接种，时间间隔24h时，两种菌株的长势较好且能够达到相对平衡(hg1菌丝生长旺盛且tpb55菌量＞1
×
106cfu/ml)。因此选定hg1与tpb55接种比例为10:1，顺序接种，时间间隔24h。
[0057]
表3菌株生长良好的共培养比例筛选结果
[0058]
碳源同时加入hg1与tpb55顺序加入(24h)葡萄糖1:1，10:110:1乳糖、苹果酸-1:1半乳糖、l-丙氨酸10:11:1，10:1
[0059]
3、共培养碳源筛选
[0060]
(1)不同碳源的共培养发酵
[0061]
确定接种比例及接种时间后，采用步骤2筛选的最优培养方法，通过共培养发酵实验筛选碳源。碳源分别为hg1与tpb55共同偏好的6种碳源及hg1与tpb55各自偏好的12种碳源组合，如表4所示，每个处理设置3个重复。
[0062]
表4碳源组合
[0063][0064][0065]
(2)共培养体系抑菌成分提取
[0066]
共培养体系发酵14d后，处理发酵产物。留取50ml发酵液保存于4℃冰箱中备用，纱布过滤菌丝，将菌丝浸泡于二氯甲烷：甲醇＝1:1的溶剂中，将菌丝依次用破碎机及细胞破碎仪打碎并过滤，留取有机相，以上操作重复2次。有机相旋蒸蒸干，纯水转出后，经乙酸乙酯萃取。萃取所得有机相旋蒸仪蒸干后得到菌丝提取物。
[0067]
过滤后的发酵液用乙酸乙酯萃取2次后，有机相旋蒸蒸干得到菌液提取物。
[0068]
(3)共培养菌丝提取物抑菌
[0069]
采用菌丝生长速率法测定共培养菌丝提取物对烟草疫霉的抑制活性(mei et al.,2019)。用5mm打孔器取28℃培养箱活化3～4d的烟草疫霉，接种于共培养菌丝提取物浓度为100μg/ml的oa平板中央(共培养菌丝提取物先经dmso溶解后溶于oa平板中)，以含0.5％dmso的oa平板为对照，于28℃恒温培养96h。采用十字交叉法测定菌丝生长直径并根据以下公式计算抑菌率：
[0070][0071]
(4)共培养菌液提取物抑菌
[0072]
采用步骤(3)相同的方法测定1mg/ml共培养菌液提取物对烟草疫霉的抑制率，以0.5％dmso作为对照。
[0073]
(5)共培养无菌滤液抑菌
[0074]
将共培养发酵液依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜除菌，得到无菌滤液，以20％的比例加入至oa燕麦培养基中。采用步骤(3)相同的方法方法测定其对烟草疫霉抑制率。
[0075]
(6)试验结果
[0076]
不同碳源共培养菌丝提取物抑菌率如表5所示。由结果可知菌丝提取物对烟草疫霉的抑菌效果均较弱。
[0077]
表5不同碳源共培养菌丝提取物抑菌率
[0078][0079][0080]
不同碳源共培养菌液提取物抑菌率如表6所示。由结果可知不同碳源共培养的菌液提取物对烟草疫霉均有抑制作用，糊精作为碳源时，抑菌率最高可达76.45％，因此选定
糊精作为共培养的最终碳源。
[0081]
表6不同碳源共培养菌液提取物抑菌率
[0082]
碳源抑菌率(％)糊精76.45
±
0.00a果糖75.21
±
0.00a甘露醇73.56
±
0.83b木糖、l-丙氨酸68.18
±
0.41c木糖、苹果酸64.88
±
0.41d木糖、乳酸56.61
±
0.72e半乳糖、l-丙氨酸53.72
±
0.83f葡萄糖50.41
±
0.00g乳糖、乳酸44.21
±
0.72hγ-氨基丁酸、l-丙氨酸43.80
±
0.83hγ-氨基丁酸、苹果酸40.50
±
0.00iγ-氨基丁酸、乳酸40.09
±
0.41i半乳糖、苹果酸38.02
±
0.00j蔗糖35.13
±
0.41k乳糖、l-丙氨酸33.06
±
0.00l半乳糖、乳酸31.41
±
0.83m山梨醇24.38
±
0.00n
[0083]
将具有抑菌效果的不同碳源共培养无菌滤液融板抑菌效果列于表7。结果表明，部分碳源共培养的无菌滤液对烟草疫霉具有抑菌效果，其中半乳糖和l-丙氨酸作为碳源时，抑菌率达58.55％，糊精作为碳源时，抑菌率为45％。
[0084]
表7不同碳源共培养无菌滤液融板抑菌率
[0085]
[0086][0087]
4.盆栽防病实验
[0088]
(1)试验材料
[0089]
制备烟草疫霉菌谷：将谷子置于蒸馏水中煮20min，待2/3谷子开花后，用纱布滤干水分置于锥形瓶中，用封口膜封口后高压灭菌(121℃，20min)。将烟草疫霉接种于oa平板活化4天后，用5mm打孔器取菌饼置于灭菌的谷子培养基中(每瓶3～5个菌饼)，28℃下培养14天，即为烟草疫霉菌谷。
[0090]
试验土壤为中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地的大田土壤(黄土型)，按照土壤：烟草疫霉菌谷＝200g：2g的质量比将烟草疫霉菌谷加入到土壤中，即为试验病土。
[0091]
(2)试验设计
[0092]
将生长基本均匀、含有5片真叶的烟苗移栽到含有200g土的花盆中(每盆1株，顶径12cm
×
9.5cm
×
10cm)。设置以下5个处理：(1)ck(对照)：不添加共培养发酵液；(2)半乳糖、l-丙氨酸为碳源共培养发酵液；(3)糊精为碳源共培养发酵液；(4)γ-氨基丁酸、l-丙氨酸为碳源共培养发酵液；(5)葡萄糖为碳源共培养发酵液。将上述共培养发酵液稀释10倍进行灌根(20ml/株)。每个处理设3个重复，每个重复15株烟苗。于人工气候室中培养(28℃；相对湿度70％；光照：黑暗周期，12：12h)烟苗。在接种黑胫病菌后的第10d和第15d，记录每个处理的病情指数，在接种后第15d，测量烟苗的株高、最大叶长、最大叶宽和有效叶数。
[0093]
(3)病情指数的测定
[0094]
根据烟草黑胫病病害严重度分级标准和以下公式调查并计算各处理病情指数。
[0095]
病情指数计算公式：
[0096][0097]
(4)相对防治效果的测定
[0098]
相对防效计算公式：
[0099][0100]
(5)盆栽防病试验结果
[0101]
盆栽发病情况及不同处理农艺性状如表8、9、10所示。
[0102]
表8第10d盆栽发病情况
[0103]
处理病情指数相对防治效果(％)ck18.79
±
0.00a-半乳糖、l-丙氨酸0.00
±
0.00c100.00
±
0.00a糊精0.00
±
0.00c100.00
±
0.00aγ-氨基丁酸、l-丙氨酸15.19
±
2.89b24.07
±
14.46b葡萄糖3.70
±
1.85c81.48
±
9.26a
[0104]
表9第15d盆栽发病情况
[0105]
处理病情指数相对防治效果ck30.00
±
0.00a-半乳糖、l-丙氨酸0.00
±
0.00c100.00a糊精0.00
±
0.00c100.00aγ-氨基丁酸、l-丙氨酸30.00
±
0.00a0.00
±
0.00c葡萄糖10.37
±
0.37b65.43
±
1.23b
[0106]
表10不同处理农艺性状
[0107]
处理株高最大叶长最大叶宽有效叶数ck4.98
±
0.87ab12.80
±
0.8a6.62
±
0.43a7.17
±
0.48a半乳糖、l-丙氨酸5.10
±
0.24ab13.25
±
0.3a6.88
±
0.14a6.50
±
0.56a糊精4.42
±
0.55ab13.58
±
0.2a7.00
±
0.18a7.00
±
0.26aγ-氨基丁酸、l-丙氨酸3.38
±
0.31b12.42
±
0.51a3.38
±
0.3b6.50
±
0.22a葡萄糖5.67
±
0.80a14.08
±
0.64a5.67
±
0.8a7.17
±
0.31a
[0108]
由表8～10可知，处理半乳糖-l-丙氨酸和糊精的病情指数及发病率均为0，显著低于ck，防治效果较好。处理半乳糖-l-丙氨酸与糊精的农艺性状与ck均无显著差异，表明防治效果较好的两处理对烟株的生长发育无负作用。
[0109]
5.共培养主成分分离鉴定及抑菌活性鉴定
[0110]
(1)抑菌主成分的分离鉴定
[0111]
当糊精作为碳源时，共培养菌液提取物融板对烟草疫霉的抑菌率最高，可达76.45％，因此选用糊精作为共培养发酵的碳源。接种操作为步骤2筛选的最优接种法，接种比例为hg1/tpb55＝10/1，180rpm、28℃下培养14d。培养基ymc成分：酵母粉2％，玉米粉1％，糊精1％。每瓶体积为250ml，共发酵140瓶。
[0112]
发酵14d后，处理共培养体系，纱布过滤菌丝，留取菌液，经乙酸乙酯萃取两次。将有机相旋蒸浓缩得到19.96g发酵液提取物。以乙酸乙酯/石油醚(0％～100％)和甲醇作为减压住流动相，以100～200目正向硅胶作为固定相，采用梯度洗脱的方法，极性由小到大进行减压柱层析。将得到的46管提取物点硅胶板分段，最终合并为8个组分。菌丝生长速率法测定各组分的抑菌活性，以0.5％dmso作为对照。
[0113]
将第3、5、6、7组分分别通过反相硅胶柱层析(30％～100％甲醇/水)、凝胶柱(二氯甲烷/甲醇，v/v，1/1)分离其中成分，并通过高效液相色谱仪(甲醇-水，0.1％三氟乙酸)分离并纯化化合物(黄瑞环，2020)。最终于第三组分中得到化合物31(7.8mg)、32(2mg)、33(21.5mg)；第五组分中得到化合物5221(8.4mg、5222(3.1mg)；第六组分中得到化合物613
(4.1mg)、624(21.1mg)；第七组分中得到化合物711(74.3mg)。此后通过1h和13c nmr和esi质谱鉴定该化合物结构。
[0114]
(2)化合物抑菌活性验证
[0115]
采用菌丝生长速率法测定各化合物在0.1mg/ml浓度条件下的抑菌活性，以0.5％dmso作为对照。
[0116]
(3)试验结果
[0117]
8个组分提取物对烟草疫霉的抑菌效果如表11所示。结果可知，第三组分抑菌效果最好，抑菌率达91.46％，显著高于其他组分。因此推测抑菌活性成分存在于第三组分中。
[0118]
表11不同组分提取物抑菌率
[0119]
组分抑菌率(％)16.10
±
0.70h228.46
±
0.81f391.46
±
0.70a460.98
±
0.00b552.85
±
0.81c643.09
±
0.81d730.89
±
0.81e819.51
±
0.00g
[0120]
通过核磁、质谱对纯化的化合物进行鉴定，确定化合物(e)-7,9-二烯-11-羰基十八酸甲酯(31)、(9z，11e)-13-氧代-9,11-卡特二烯酸(32)、(e)-7,9-二烯-1-羰基硬脂酸(33)、黄豆苷元(5221)、异樱黄素(5222)、3-(2，3-dihydroxypropyl)indole(613)、(2s)-3，3-bis(1h-indol-3-yl)propane-1，2-diol(624)、n-乙酰基色胺(711)，其中(e)-7,9-二烯-11-羰基十八酸甲酯(31)为新化合物，其余均为已知化合物。化合物构型如图4所示。
[0121]
各化合物(0.1mg/ml)对烟草疫霉的抑菌结果如表12所示。
[0122]
表12化合物抑菌率
[0123]
化合物编号抑菌率(％)3138.80
±
0.34a3315.50
±
1.38b71112.06
±
0.76c522112.06
±
0.76c52229.47
±
0.79c6139.45
±
2.22c62412.06
±
0.76c
[0124]
进一步测定(e)-7,9-二烯-11-羰基十八酸甲酯(31)抑菌活性发现，其浓度为0.3mg/ml时抑菌率达到72.93％。抑菌效果如图5所示。
[0125]
综上所述，本发明改善了棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养菌量较小的问题，共培养时枯草芽孢杆菌tpb55的菌量达到5.01
×
108cfu/ml，棘孢木霉hg1的菌量达到5.3
×
105cfu/ml，通过改变碳源刺激具有抑菌活性的次级代谢物的产生并提高对烟草疫霉的抑制作用，在盆栽防病试验中也取得显著的效果。
[0126]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种棘孢木霉(trichoderma asperellum)hg1与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tpb55共培养的培养基，其特征在于，包括以下质量百分含量的组分：酵母粉1.8～2.2％、玉米粉0.8～1.2％、碳源0.8～1.2％和余量的水；所述碳源包括：半乳糖和l-丙氨酸的混合物或糊精。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述半乳糖和l-丙氨酸的混合物中半乳糖和l-丙氨酸的质量比为1：1。3.一种生防制剂的制备方法，其特征在于，包括：将棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55在权利要求1或2所述的培养基中共培养，得到共培养液或无菌共培养液为所述生防制剂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述共培养的方法包括：先在所述培养基中接种棘孢木霉hg1孢子液，24h后接种所述枯草芽孢杆菌tpb55孢子液。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，棘孢木霉hg1孢子液与枯草芽孢杆菌tpb55孢子液的接种体积比为10：1；所述棘孢木霉hg1孢子液的孢子浓度为1
×
106cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌tpb55孢子液的孢子浓度为1
×
106cfu/ml。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述棘孢木霉hg1孢子液和所述培养基的体积比为1：100。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述共培养的温度为28℃，所述共培养的时间为14d。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述生防制剂为共培养液时，所述培养基中的碳源为糊精；当所述生防制剂为无菌共培养液时，所述培养基中的碳源为半乳糖和l-丙氨酸的混合物。9.根据权利要求3或8所述的制备方法，其特征在于，得到共培养液后，还包括：将所述共培养液过滤，得到发酵液；将所述发酵液用乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，得到菌液提取物为所述生防制剂。10.利用权利要求3～9任一项所述制备方法制备得到的生防制剂在防治烟草疫霉中的应用。

技术总结
本发明涉及菌种共培养技术领域，特别是涉及棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55共培养的培养基及其生防制剂。本发明通过筛选碳源，优化发酵条件，改善了棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55共培养菌量较小的问题，通过改变碳源刺激具有抑菌活性的次级代谢物的产生并提高对烟草疫霉的抑制作用，在盆栽防病试验中也取得显著的效果。得显著的效果。得显著的效果。


技术研发人员：赵栋霖 张成省 林伟 李清钰 李义强 徐康文 郑艳芬 刘建阳 吴平 叶超
受保护的技术使用者：福建省烟草公司南平市公司
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/19