一种鉴别区分大肠杆菌EPEC和EHEC的引物组、试剂盒及其应用

一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.大肠杆菌也称大肠埃希氏菌(escherichia coli，e.coli)，有致病性和非致病性之分。与人类疾病有关的大肠杆菌统称为致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic escherichia coli,dec)，是一种重要的食源性致病菌，极易造成人体感染，感染后可引发腹痛腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症等病症，威胁人类健康及生命财产安全。其中，肠致病性大肠杆菌(epec)和肠出血性大肠杆菌(ehec)都是常见的致泻大肠埃希氏菌：epec是婴儿腹泻的主要病原菌，具有高度传染性，严重者可致死；ehec主要血清型是o157:h7，引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。因此，为了更好解决因epec、ehec引发的食品安全和医疗卫生感染等问题，对其进行高效、快速、精准的检测十分重要。
3.目前已有的分子生物学检测方法主要包括聚合酶链反应(pcr)、实时荧光定量pcr(qpcr)、基因芯片技术以及pcr与编码磁性微粒、变性高效液相色谱结合等，但存在对于样品的要求比较高、花费较高、程序较为复杂等问题，不能满足高效、快速、简便的检测需求。


技术实现要素：

4.有鉴于此，为弥补上述不足，本发明提供了一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的引物组、试剂盒及其应用，该引物组和试剂盒可高灵敏度和特异性的鉴别出非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec，该应用方法操作简便、快速。
5.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的引物组，针对非epec或ehec型大肠杆菌，mdh-f41引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，mdh-r875引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；针对epec，eae-f626引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，eae-r1166引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；针对ehec，stx1a-f122引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，stx1a-r813引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，stx2a-f481引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，stx2a-r864引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。
7.本发明提供一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
8.优选的，所述试剂盒还包括pcr扩增试剂。
9.优选的，所述pcr扩增试剂包括：2
×
pcr es taqmastermix。
10.本发明提供一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的检测方法，包括以下步骤：s1.获得非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec培养液，或提取样品中非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec的dna；s2.以所述培养液或dna为模板，用所述的引物组进行多重pcr扩增反应，
获得pcr产物；s3.将所述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，于凝胶成像系统中观察结果。
11.优选的，电泳结果只出现835bp条带为非epec或ehec型大肠杆菌；出现835bp、541bp条带为epec；出现835bp和541bp条带，以及691bp、384bp其中之一或全部为ehec。
12.优选的，所述pcr扩增的反应体系如下：体系总体积20.0μl，2
×
pcr es taq mastermix 10.0μl，分别为10μm引物mdh-f41、mdh-r875、eae-f626、eae-r1166、stx1a-f122、stx1a-r813、stx2a-f481、stx2a-r864各0.8μl，模板1.0μl，超纯水2.6μl。
13.优选的，所述pcr扩增的反应程序如下：94℃预变性2min；94℃60s，55℃60s，72℃30s，35个循环；72℃2min。
14.本发明提供所述引物组、所述试剂盒或所述检测方法在以非疾病诊断目的的鉴别非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec中的应用。
15.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
16.本发明提供的引物组及试剂盒可高灵敏度和特异性的鉴别出非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec，最低检测限为50pg dna。
17.本发明检测方法操作简便，高效，快速，可鉴别出非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec，为食品、患者临床样品、养殖场、动物产品及饲料等样品中大肠杆菌的检测和实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
附图说明
18.图1本发明的引物组单重pcr扩增结果(泳道m为dnamarker；泳道1为mdh(835bp)；泳道2为eae(541bp)；泳道3为stx1a(691bp)；泳道4为stx2a(384bp)；泳道5为阴性对照)。
19.图2本发明的引物组对大肠杆菌k12、epec o55:h7和ehec o157:h7的多重pcr扩增结果(泳道m为dna marker；泳道1为大肠杆菌k12(835bp)；泳道2为epec o55:h7的双重pcr产物(835bp和541bp)；泳道3为ehec o157:h7的四重pcr产物(835bp、541bp、691bp和384bp)；泳道4为阴性对照)。
20.图3特异性试验检测结果(泳道m为dnamarker；泳道1-20分别为：大肠杆菌k12(mg1655)、epec o55:h7(tb182a)、ehec o157:h7(edl933)、伤寒沙门氏菌(cmcc50071-9)、副溶血弧菌(bcrc12867)、单核增生李斯特菌(cmcc54006)、阴沟肠杆菌(atcc13047)、柠檬酸杆菌(aus m132)、产气肠杆菌(cmcc45103)、施氏假单胞菌(as1.202)、粪肠球菌(as1.2135)、唾液链球菌(as1.2498)、溶血葡萄球菌(atcc969)、假白喉棒状杆菌(cmcc38203)、粪产碱杆菌(cmcc828)、普通变形杆菌(cmcc834)、流感嗜血杆菌(cmcc1080)、蜡样芽孢杆菌(as1.196)、金黄色葡萄球菌(cmcc26058)，泳道21为阴性对照)。
21.图4灵敏度试验结果(泳道m为dnamarker；泳道1-8，分别表示稀释浓度为50ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl的菌株dna，泳道9为阴性对照)。
22.图514株临床分离菌株epec和ehec的多重pcr检测结果(泳道m为dna marker；泳道1-14分别为：ehec o157:h7(93-111)、ehec o157:h7(ok-1)、epec o55:h7(tb182a)、epec o55:h7(dec5d)、ehec o26:h11(dec10c)、ehec o111:h8(cl-37)、ehec o111:h8(dec88)、ehec o111:h-(3007-85)、ehec o111:h-(dec8c)、ehec o111(c412)、ehec o26:h11(h19)、ehec o26:h11(dec10b)、epec o55:h7(3256-97)、ehec o157:h7(edl-933)，泳道15为阴性
对照)。
具体实施方式
23.本发明提供了一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的引物组，针对非epec或ehec型大肠杆菌，mdh-f41引物的核苷酸序列为aggcgcttgcactactgtta(seq id no.1)，mdh-r875引物的核苷酸序列为agcgcgttctgttcaaatg(seq id no.2)；针对epec，eae-f626引物的核苷酸序列为attatggaacggcagaggttaat(seq id no.3)，eae-r1166引物的核苷酸序列为atccccatcgtcaccagagg(seq id no.4)；针对ehec，stx1a-f122引物的核苷酸序列为cattcgctctgcaataggta(seq id no.5)，stx1a-r813引物的核苷酸序列为aactcgcgatgcatgatga(seq id no.6)，stx2a-f481引物的核苷酸序列为tatctggcgttaatggagtt(seq id no.7)，stx2a-r864引物的核苷酸序列为cctgtcgccagttatctgac(seq id no.8)。本发明所述非epec或ehec型大肠杆菌为大肠杆菌k12，所述epec为epec o55:h7，所述ehec为ehec o157:h7。
24.本发明提供一种鉴别区分大肠杆菌、epec和ehec的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。本发明所述试剂盒还包括pcr扩增试剂。本发明所述pcr扩增试剂包括：2
×
pcr es taqmastermix。
25.本发明提供一种鉴别区分大肠杆菌、epec和ehec的检测方法，包括以下步骤：s1.获得非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec培养液，或提取样品中非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec的dna；s2.以所述培养液或dna为模板，用所述的引物组进行多重pcr扩增反应，获得pcr产物；s3.将所述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，于凝胶成像系统中观察结果。本发明所述pcr产物的特异性条带片段为835bp，该片段为大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因(mdh)片段；所述pcr产物的特异性条带片段为541bp，该片段为特异黏附素基因(eae)片段；所述pcr产物的特异性条带片段为691bp，该片段为志贺氏毒素样细胞毒素相关编码基因(stx1a)片段；所述pcr产物的特异性条带片段为384bp，该片段为志贺氏毒素样细胞毒素相关编码基因(stx2a)片段。
26.在本发明中，所述非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec培养液的获得步骤包括：将非epec或ehec型大肠杆菌、epec o55:h7和ehec o157:h7接种至lb液体培养基，在温度为37℃的条件下培养过夜得到细菌培养液，即得到可以用做pcr模板的菌液。
27.在本发明中，电泳结果只出现835bp条带为非epec或ehec型大肠杆菌；出现835bp和541bp条带为epec；出现835bp和541bp条带，以及691bp、384bp其中之一或全部为ehec。
28.在本发明中，所述pcr扩增的反应体系如下：总反应体系为20μl，2
×
pcr es taq mastermix 10.0μl，分别为10μm引物mdh-f41、mdh-r875、eae-f626、eae-r1166、stx1a-f122、stx1a-r813、stx2a-f481、stx2a-r864各0.8μl，模板1.0μl，超纯水2.6μl；所述pcr扩增的反应程序如下：94℃预变性2min；94℃60s，55℃60s，72℃30s，35个循环；72℃2min。本发明所述引物的浓度分别为10μm，加入量分别为0.8μl。
29.本发明还提供所述引物组、所述试剂盒或所述检测方法在以鉴别非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec中的应用。
30.在本发明中，若无特殊说明，所用的组分或试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品。
31.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1特异性引物的制备
33.以非epec或ehec型大肠杆菌的苹果酸脱氢酶基因(mdh)、肠致病性大肠杆菌(epec)的特异黏附素基因(eae)和肠出血性大肠杆菌(ehec)的志贺氏毒素样细胞毒素相关编码基因(stx1a、stx2a)为靶标，设计合成特异性引物，见表1。
34.表1扩增引物
[0035][0036][0037]
上述特异性引物mdh-f41、mdh-r875、eae-f626、eae-r1166、stx1a-f122、stx1a-r813、stx2a-f481、stx2a-r864的使用浓度均为0.4μm；经其稀释至10μm的引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融。
[0038]
实施例2利用上述引物的单重pcr检测
[0039]
1、大肠杆菌模板的制备
[0040]
将大肠杆菌k12(mg1655)、epec o55:h7(cb9615)或ehec o157:h7(edl-933)分别接种至lb液体培养基，在温度为37℃的条件下培养过夜得到细菌培养液，即分别得到可以用做pcr模板的菌液。
[0041]
2、pcr反应体系的建立和扩增
[0042]
取4个pcr管，分别加入2
×
pcr es taq mastermix(购自康为世纪公司)的体积为10.0μl，引物10μm mdh-f411μl、10μm mdh-r8751μl(或引物10μm eae-f6261μl、10μm eae-r11661μl，或引物10μm stx1a-f1221μl、10μm stx1a-r8131μl，或引物10μm stx2a-f4811μl、10μm stx2a-r8641μl)，模板1.0μl，超纯水7μl，混匀；设定pcr反应参数：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃2min；获得pcr产物。
[0043]
3、pcr检测结果判定与表述
[0044]
取10μl上述pcr产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120v电压，电泳20min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现。
[0045]
结果如图1所示，泳道1为mdh(835bp)，泳道2为eae(541bp)，泳道3为stx1a(691bp)，道4为stx2a(384bp)，表明上述设计的引物可扩增出对应菌株的靶序列。
[0046]
实施例3大肠杆菌k12、epec o55:h7和ehec o157:h7的四重pcr检测
[0047]
1、大肠杆菌模板的制备
[0048]
将大肠杆菌k12(mg1655)、epec o55:h7(cb9615)和ehec o157:h7(edl-933)分别接种至lb液体培养基，在温度为37℃的条件下培养过夜得到细菌培养液，即分别得到可以用做pcr模板的菌液。
[0049]
2、pcr反应体系的建立和扩增
[0050]
取pcr管，分别加2
×
pcr es taqmastermix的体积为10.0μl，分别为10μm mdh-f410.8μl、10μm mdh-r8750.8μl、10μm eae-f6260.8μl、10μm eae-r11660.8μl、10μm stx1a-f1220.8μl、10μm stx1a-r8130.8μl、10μm stx2a-f4810.8μl、10μm stx2a-r8640.8μl、模板1.0μl、超纯水2.6μl，混匀；设定pcr反应参数：94℃预变性2min；94℃60s，55℃60s，72℃30s，35个循环；72℃2min；获得pcr产物。
[0051]
3、pcr检测结果判定与表述
[0052]
取10μl上述pcr产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120v电压，电泳20min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果只出现835bp条带为大肠杆菌；出现835bp、541bp条带为epec；出现835bp和541bp条带，以及691bp、384bp其中之一或全部为ehec。
[0053]
结果如图2所示，泳道1只出现835bp条带为大肠杆菌k12；泳道2出现835bp、541bp条带为epec o55:h7；泳道3出现835bp、541bp、691bp和384bp条带为ehec o157:h7。
[0054]
实施例4特异性试验
[0055]
将大肠杆菌k12(mg1655)、epec o55:h7(tb182a)、ehec o157:h7(edl933)、伤寒沙门氏菌(cmcc50071-9)、副溶血弧菌(bcrc12867)、单核增生李斯特菌(cmcc54006)、阴沟肠杆菌(atcc13047)、柠檬酸杆菌(aus m132)、产气肠杆菌(cmcc45103)、施氏假单胞菌(as1.202)、粪肠球菌(as1.2135)、唾液链球菌(as1.2498)、溶血葡萄球菌(atcc969)、假白喉棒状杆菌(cmcc38203)、粪产碱杆菌(cmcc828)、普通变形杆菌(cmcc834)、流感嗜血杆菌(cmcc1080)、蜡样芽孢杆菌(as1.196)、金黄色葡萄球菌(cmcc26058)接种到相应培养基，在适宜的条件下培养过夜得到细菌培养液，得到可以用做pcr模板的菌液。
[0056]
采用实施例3所述检测方法，检测结果如图3所示，泳道1-3分别为大肠杆菌k12、epec o55:h7、ehec o157:h7；泳道4-20所示菌株均未出现条带，表明本发明所述引物组、试剂盒、检测方法对大肠杆菌k12、epec o55:h7和ehec o157:h7有高度特异性。
[0057]
实施例5灵敏度试验
[0058]
使用tiangen细菌基因组dna提取试剂盒分别提取大肠杆菌k12(mg1655)、epec o55:h7(cb9615)和ehec o157:h7(edl-933)基因组dna，分别将大肠杆菌k12、epec和ehec基因组dna稀释为0ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl，对上述三个菌株稀释的dna进行pcr检测，检测方法同实施例3。
[0059]
检测结果如图4所示，稀释浓度为50ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、500pg/μl、50pg/μl的
三种菌株，均被有效检测出，表明三种菌的最低检测限为50pg。
[0060]
实施例6临床分离菌株epec和ehec的多重pcr检测
[0061]
选取stec保存中心(the stec center,national food safety and toxicology center,michigan state，http://shigatox.net/new/)的14株菌株，分别为食物分离菌株：edl-933；人体分离菌株：93-111、ok-1、tb182a、dec5d、3256-97、cl-37、dec88、3007-85、h19、dec10b、dec10c；牛分离菌株：dec8c、c412，对上述14株epec、ehec环境分离菌进行鉴定，检测方法同实施例3，已知泳道1-14分别为：ehec o157:h7(93-111)、ehec o157:h7(ok-1)、epec o55:h7(tb182a)、epec o55:h7(dec5d)、ehec o26:h11(dec10c)、ehec o111:h8(cl-37)、ehec o111:h8(dec88)、ehec o111:h-(3007-85)、ehec o111:h-(dec8c)、ehec o111(c412)、ehec o26:h11(h19)、ehec o26:h11(dec10b)、epec o55:h7(3256-97)、ehec o157:h7(edl-933)。结果如图5所示，泳道1、2、7、8、14所示分离菌出现835bp、541bp、691bp、384bp四条条带，为ehec；泳道3、4、13所示分离菌出现835bp、541bp两条条带，为epec；泳道5所示分离菌出现835bp、541bp、384bp三条条带，为ehec；泳道6、9、10、11、12所示分离菌出现835bp、541bp、691bp三条条带，为ehec，表明该检测方法可有效检测出对应菌株。
[0062]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的引物组，其特征在于，针对非epec或ehec型大肠杆菌，mdh-f41引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，mdh-r875引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；针对epec，eae-f626引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，eae-r1166引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；针对ehec，stx1a-f122引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，stx1a-r813引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，stx2a-f481引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，stx2a-r864引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。2.一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr扩增试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr扩增试剂包括：2
×
pcr es taq mastermix。5.一种鉴别区分大肠杆菌epec和ehec的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.获得非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec培养液，或提取样品中非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec的dna；s2.以所述培养液或dna为模板，用权利要求1所述的引物组进行多重pcr扩增反应，获得pcr产物；s3.将所述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，于凝胶成像系统中观察结果。6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，电泳结果只出现835bp条带为非epec或ehec型大肠杆菌；出现835bp和541bp条带为epec；出现835bp和541bp条带，以及691bp、384bp其中之一或全部为ehec。7.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系如下：体系总体积20.0μl，2
×
pcr es taq mastermix 10.0μl，分别为10μm引物mdh-f41、mdh-r875、eae-f626、eae-r1166、stx1a-f122、stx1a-r813、stx2a-f481、stx2a-r864各0.8μl，模板1.0μl，超纯水2.6μl。8.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序如下：94℃预变性2min；94℃60s，55℃60s，72℃30s，35个循环；72℃2min。9.权利要求1所述引物组、权利要求2～4任意一项所述试剂盒或权利要求5～8任意一项所述检测方法在以非疾病诊断目的的鉴别非epec或ehec型大肠杆菌、epec和ehec中的应用。

技术总结
本发明提供一种鉴别区分大肠杆菌EPEC和EHEC的引物组、试剂盒及其应用，属于分子诊断技术领域。本发明针对非EPEC和EHEC大肠杆菌、EPEC和EHEC分别设计出引物组，可高特异性和灵敏度的鉴别出非EPEC和EHEC大肠杆菌、EPEC或EHEC。本发明检测方法操作简便，可快速的鉴定出非EPEC和EHEC大肠杆菌、EPEC或EHEC。EPEC或EHEC。EPEC或EHEC。


技术研发人员：杨斌 闫俊 康晨博
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/19