TRPM1基因SNP分子标记在乌骨鸡分子辅助育种中的应用的制作方法

trpm1基因snp分子标记在乌骨鸡分子辅助育种中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体地，涉及trpm1基因snp分子标记在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用。


背景技术：

2.乌骨鸡体内富含黑色素而备受大众喜爱，黑色素具有抗衰老、抗氧化等多种保健功能。乌骨鸡具有乌皮、乌肉等特点，其中“乌皮”是其最显著的特点。黑色素沉积是造成乌色形成的主要原因，人们在消费中惯于以其乌色的深浅来评判品质的优劣。黑色素沉积受到多种基因和信号通路等因子调控。瞬时受体式基因１（transient receptor potential melastatin 1，trpm1）在完全分化黑色素细胞表型和分化增殖调控中具有重要作用。研究表明该基因在黑色绵羊皮肤中高度表达。我们前期通过对乌骨鸡和非乌骨鸡转录组测序发现，trpm1基因在乌骨鸡中高度表达，trpm1基因可能是影响乌色度的重要候选基因。
3.研究表明，皮肤亮度l*值反映皮肤肌肉表面的亮度，l*值越低，皮肤肌肉颜色越暗，乌色度越高，黑色素含量越高，确立了亮度l*值可作为乌色度性状选育的参考指标。目前在育种过程中通常以肉眼观察皮肤乌色度进行选育，世代遗传进展缓慢，因此，寻找皮肤乌色度显著相关的分子标记，对于提高皮肤乌色度世代选育进展具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对目前乌骨鸡皮肤乌色度选育进展缓慢的问题，本发明提供了一种trpm1基因snp分子标记在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用。所述trpm1基因snp分子标记相关信息如下：该snp分子标记引物的核苷酸序列如下：所述snp分子标记的筛选方法如下：采用基于飞行时间质谱分析技术的massarray平台对黑色素沉积相关基因的60个snp位点进行基因分型，剔除没有多态性的snp位点。使用spss 16.0软件的一般线性模型中的单变量方差分析进行多态性位点基因型与肤色亮度l*值关联分析。经过分析，筛选到trpm1基因的1个snp位点具有多态性，然后分析该snp标记与皮肤肤色亮度l*值性状的相关性，该snp位点gg基因型背部皮肤亮度l*值显著低于aa和ag基因型，说明gg基因型个体背部
皮肤乌色度较高；不同基因型个体间腿部皮肤和胸部皮肤亮度l*值差异不显著。
5.具体地，上述trpm1基因snp分子标记引物组合在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用方法包括如下步骤：（1）提取待测鸡基因组总dna；优选地，所述待测鸡的基因组dna由该鸡种的个体翅静脉采血得到。
6.（2）背部皮肤亮度l*值、大腿部皮肤亮度l*值和胸部皮肤亮度l*值测定方法：将活鸡背部、大腿部和翅根下面的胸部三个部位的羽毛拔掉1cm2左右的片区，用75%酒精棉球擦拭一下，再用tc.piig 型全自动测色色差计测定背部皮肤、大腿部皮肤、胸部皮肤的亮度l*值。所有肤色测定均由同一人测量，所测部位基本一致。
7.（3）根据snp位点设计引物，进行pcr扩增，并进行测序验证和基因分型；pcr产物送生物公司进行测序，将所得序列与鸡的参考基因组进行比对，找出多态性位点。snp位点pcr产物的核苷酸序列如下所示：trpm1-第8外显子，rs737038441（突变位点a/g），pcr产物长度为222 bp。
8.caggactcggacaaggtgttcctgtagttgggcttattgtggaaggtggtcccaatgttatctccattgttttggagtgtctacgagaagaacctcctctccctgtagtgatttgtgatggtagtggacgagck(a/g)tctgatattctgtcatttgcacacaagtattcagaagaaggagggtaagactgtgagactttcactaatgctgtgtcttgctcaagga注：以上序列中标注的k为突变位点，括号中为突变碱基，为等位基因突变。
9.（4）根据基因型结果，选留皮肤乌色度较高的优势基因型个体，淘汰乌色度较低的劣势基因型个体。
10.优势基因型个体的具体判断方法为：snp（rs737038441）位点具有3种基因型aa、ag、gg，gg基因型背部皮肤亮度l*值显著低于aa和ag基因型（p＜0.05），说明gg基因型个体背部皮肤乌色度较高，gg基因型为背部皮肤乌色度的优势基因型。不同基因型个体间大腿部皮肤和胸部皮肤亮度l*值差异不显著。
11.通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：采用trpm1基因snp分子标记在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中可以将gg优势等位基因型作为选育背部皮肤亮度l*值的重要分子标记，通过选留gg基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高背部皮肤乌色度的选育，加快背部皮肤乌色度世代选育进展。
附图说明
12.图1是本发明实施例中trpm1基因snp位点质谱分型图。
具体实施方式
13.本发明针对乌骨鸡皮肤乌色度常规选育进展慢和不准确的问题，提供了trpm1基因snp分子标记在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用，下面通过实施例具体说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
14.实施例1筛选乌骨鸡皮肤乌色度显著相关的分子标记
1、材料与方法随机选取丝羽乌骨鸡母鸡192只，记录脚号，并进行翅下静脉采血1 ml，acd抗凝，混匀后放入-20 ℃保存备用。采用常规苯酚-氯仿法提取dna。将192个个体的dna样品送到生物公司开展丝羽乌骨鸡黑色素相关trpm1基因开展基于飞行时间质谱massarray平台进行质谱检测，收集数据，并进行snp位点基因分型。
15.2、背部皮肤、大腿部皮肤和胸部皮肤亮度l*值测定将活鸡背部、大腿部和胸部三个部位的羽毛拔掉1cm2左右的片区，用75%酒精棉球擦拭一下，再用tc.piig 型全自动测色色差计测定大腿部皮肤、背部皮肤、胸部皮肤的亮度l*值。所有肤色测定均由同一人测量，所测部位基本一致。
16.3、基因分型及其与皮肤亮度l*值相关性分析3.1 snp位点基因分型采用基于飞行时间质谱分析技术的massarray平台对黑色素沉积相关基因的60个snp位点的192个个体进行基因分型，剔除45个没有多态性的snp位点。其中trpm1基因具有1个多态性snp位点，该snp位点信息见表1。该snp位点有3种基因型，质谱分析结果见图1。图1是snp（rs737038441 a》g）质谱分型图，no call (0)，a(126)，ag (58)，g(8)，aa=0.66，ag=0.30，gg=0.04。
17.表1trpm1基因多态性snp位点信息3.2trpm1snp位点的遗传多态性分析利用popgene（version 1.31）统计该snp位点基因型频率、基因频率、杂合度（he）和多态信息含量（pic）。利用卡方检验（2）检测snp位点是否处hardy-weinberg（h-w）平衡状态。分析结果见表2。
18.由表2可知，该 snp位点具有3种基因型。经h-w平衡检测，trpm1基因snp（第8外显子）处于h-w平衡状态（p》0.05）。该snp位点遗传多样性较高，he=0.30，pic=0.27，为中度多态（0.25＜pic＜0.5）。
19.表2trpm1基因snp位点遗传多态性与哈代-温伯格平衡检验3.3 snp标记与皮肤肤色亮度l*值性状的相关性分析使用spss 16.0软件的一般线性模型中的单变量方差分析进行多态性位点基因型与肤色亮度l*值关联分析。固定因子：snp标记的不同基因型，因变量：毛肤色亮度l*值，采用lsd法多重比较不同标记基因型之间的肤色亮度l*值的差异显著性，p＜0.05表示差异显著。
20.snp标记与皮肤肤色亮度l*值性状的相关性分析，发现trpm1基因的snp位点与背部皮肤亮度l*值显著相关，结果见表3。该snp位点不同基因型间腿部皮肤和胸部皮肤亮度l*值均差异不显著。该snp（rs737038441）位点gg基因型的背部皮肤亮度l*值显著低于aa和ag基因型（p＜0.05）。gg基因型为背部皮肤乌色度的优势基因型；aa和ag基因型的个体背部皮肤乌色度较低，为劣势基因型。在育种中可以将gg优势等位基因型作为选育背部皮肤亮度l*值的重要分子标记，通过选留gg基因型个体，淘汰aa和ag基因型个体的方法来辅助提高背部乌色度的选育，加快背部皮肤乌色度世代选育进展。
21.表3 基因位点与皮肤肤色亮度l*值性状的关联分析（平均值
±
标准差）注：同一测定部位同列不同小写字母表示不同基因型肤色亮度l*值差异显著(p＜0.05)实施例2 乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种通过丝羽乌骨鸡皮肤乌色度相关基因的分子标记辅助育种，对乌骨鸡配套系的乌骨鸡品系a皮肤亮度l*值进行选择，进而提高种雏鸡皮肤乌色度。
22.4周龄时，对乌骨鸡品系a群体内的鸡进行基因分型，保留皮肤乌色度较高的优势基因型个体。具体方案如下：（1）4周龄时，利用一次性注射器翅静脉采血对800只丝羽乌骨鸡品系a（公母各半）翅静脉采血，酚氯仿法提取dna，提取待测鸡基因组总dna；设计并合成相关基因trpm1（rs737038441）的引物，引物序列相关见表4。
23.表4 引物序列相关信息（2）pcr扩增、电泳与测序基因分型：pcr扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并测序进行基因分型。对丝羽乌骨鸡公、母鸡进行基因分型，保留背部皮肤乌色度较高的优势基因型个体。
24.pcr总反应体系50μl：dna模板4μl，dntp（2 mmol/l）2μl，mg
2+
（3 mmol
·
l-1
）0.6μl，1×
pcr反应缓冲液5μl，上、下游引物（10 μmol
·
l-1
）各1μl，taq聚合酶（1u
·
μl-1
）2.5μl，补超纯水至50μl。
25.pcr反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5 min。pcr扩增目的片段用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
26.pcr产物送生物公司进行测序，将所得序列与鸡的参考基因组进行比对，找出多态性位点。snp位点pcr产物的核苷酸序列如下所示：snp：trpm1-第8外显子，rs737038441（突变位点a / g），pcr产物长度为222bp。
27.caggactcggacaaggtgttcctgtagttgggcttattgtggaaggtggtcccaatgttatctccattgttttggagtgtctacgagaagaacctcctctccctgtagtgatttgtgatggtagtggacgagck(a/g)tctgatattctgtcatttgcacacaagtattcagaagaaggagggtaagactgtgagactttcactaatgctgtgtcttgctcaagga。
28.注：序列中标注的k为突变位点，括号中为突变碱基，为等位基因突变。
29.（3）10周龄时皮肤亮度l*值测定方法：将活鸡背部、大腿部、和翅根下的胸部羽毛拔掉1cm2左右的片区，用75%酒精棉球擦拭一下，再用tc.piig 型全自动测色色差计测定胸部皮肤亮度l*值。所有肤色测定均由同一人测量，所测部位基本一致。
30.（4）乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助选育trpm1基因snp位点的gg基因型为背部皮肤乌色度的优势基因型，通过选留gg基因型个体，淘汰aa和ag基因型个体的方法来辅助提高背部皮乌色度的选育。
31.对乌骨鸡品系a第5世代和第6世代背部皮肤乌色度采用分子标记辅助育种，操作简便，能更快的提高背部皮肤乌色度，如表5所示，经过2个世代的选育，公、母背部皮肤亮度l*值分别比4世代降低了8.3、7.6，平均每个世代l*值降低4左右，比2~4世代l*值平均每个世代进展2左右，l*值显著降低，背部皮肤乌色度显著提高，变异系数也显著降低，乌色度均一性显著提高，加快了选育进展。经过2个世代的分子标记辅助育种，腿部皮肤和胸部皮肤亮度l*值也显著降低，乌色度显著提高。
32.表5 乌骨鸡品系a不同世代皮肤亮度l*值测定结果测定日龄：70天以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种
简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
33.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
34.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.trpm1基因snp分子标记在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，所述snp分子标记位于nc_006097.4染色体10上第6141871位，为a或g多态。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于， 所述snp分子标记的引物的核苷酸序列为：f：5’caggactcggacaaggtgtt 3’r：5’tccttgagcaagacacagca 3’。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述snp分子标记的筛选方法为：采用基于飞行时间质谱分析技术的massarray平台对黑色素沉积相关基因的60个snp位点在丝羽乌骨鸡母鸡192个个体中进行基因分型，剔除没有多态性的snp位点；使用spss 16.0软件的一般线性模型中的单变量方差分析进行多态性位点基因型与肤色亮度l*值关联分析；筛选到trpm1基因的1个snp位点具有多态性，分析该snp标记与皮肤肤色亮度l*值性状的相关性，该snp位点gg基因型背部皮肤亮度l*值显著低于aa和ag基因型，说明gg基因型个体背部皮肤乌色度较高；不同基因型个体间腿部皮肤和胸部皮肤亮度l*值差异不显著；gg为背部皮肤乌色度的优势基因型，通过选留具有gg基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高背部皮肤乌色度的选育。4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种方法包括如下步骤：（1）提取待测鸡基因组总dna；（2）根据snp分子标记，利用引物对通过pcr方法扩增目标序列，所述snp分子标记位于nc_006097.4染色体10上第6141871位，所述引物对的核苷酸序列为：f：5’caggactcggacaaggtgtt 3’r：5’tccttgagcaagacacagca 3’；（3）将pcr扩增产物测序后，判断基因型；（4）根据基因型结果，选留背部皮肤乌色度较高的优势基因型个体。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，pcr扩增产物的核苷酸序列如seq no.1或seq no.2所示，pcr产物长度为222bp。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，snp位点基因型对应的背部皮肤乌色度较高的优势基因型为gg。

技术总结
本发明公开了一种TRPM1基因SNP分子标记在乌骨鸡皮肤乌色度分子辅助育种中的应用，TRPM1基因SNP分子标记位于NC_006097.4染色体10上第6141871位，为A或G多态，该位点在乌骨鸡中存在AA、AG和GG三种基因型，其中GG基因型背部皮肤亮度L*值显著低于AA和AG基因型。在育种中可以将GG优势等位基因型作为选育背部皮肤亮度L*值的重要分子标记，通过选留具有GG基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高背部皮肤乌色度的选育，加快背部皮乌色度世代选育进展。选育进展。选育进展。


技术研发人员：屠云洁 束婧婷 章明 单艳菊 刘一帆 肖芹 巨晓军 姬改革 盛中伟 张海涛 许盛海 唐燕飞 蒋华连 韦涛 张进 李非 苏立燧 韦宗海
受保护的技术使用者：江苏立华牧业股份有限公司 广西富凤农牧集团有限公司
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/19