一种调控苹果株高的功能基因MbIAA19及应用

一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19及应用
技术领域
1.本发明属于分子育种生物学技术领域，具体涉及一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19及应用。


背景技术：

2.苹果(malus domestica)是世界最重要的经济果树之一。我国作为世界苹果生产大国，年总产量占世界总产值的50％以上。传统的苹果乔砧栽培方式具有不易管理，浪费空间等缺点。随着中国苹果园从乔砧稀植到乔砧密植，再到矮砧密植栽培模式的转变，正在逐步实现向矮砧集约高效栽培的变革，矮化砧木的应用日趋广泛。矮砧果园具有易于栽培管理、早产、丰产等优点，随着应用需求的不断增长，矮化砧木的育种和实生选育工作也成为制约苹果栽培发展的重要因素，选育因地制宜、抗性强、丰产、早产的苹果矮化砧木种质将是长期课题。传统杂交育种存在周期长、选育难度大的缺点，而转基因育种不仅可以缩短育种周期，还能提高选种效率，甚至做到定向改良矮化种质。因此，明晰基因功能，选择适宜的功能基因对于转基因育种至关重要。
3.生长素参与植物生命活动的各个方面，对植株发育有不可取代的重要作用。生长素信号转导是响应植物体内生长素动态变化的感受器，aux/iaa是最重要的生长素原初响应基因家族。aux/iaa基因家族在高等植物中都具有多个成员，而该家族基因成员在木本果树中报道较少，针对株高调控的研究更是缺乏有效的验证手段。mbiaa19在苹果属矮化资源(dwf)中下调表达，但其功能尚不清楚，对苹果植株高度的影响还未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述不足，本发明目的是提供一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19及应用，为苹果矮化砧木转基因育种提供资源。
5.实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
6.一种调控苹果株高的功能基因，其特征在于，所述功能基因mbiaa19的核酸序列如seq id no.1所示；或者功能基因mbiaa19编码是由seq id no.2所示的氨基酸序列组成蛋白的编码基因。
7.一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19的载体，为含有所述功能基因mbiaa19的重组农杆菌。
8.进一步，构建功能基因mbiaa19的基因沉默载体rnai-mbiaa19。
9.进一步，利用重组质农杆菌侵染gl-3叶片，获得rnai-mbiaa19株系，使其在转基因再生株系中低表达。
10.一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19的应用，利用所述功能基因mbiaa19，在培育苹果矮化种质方面的应用。
11.进一步，将所述功能基因mbiaa19转入所需改良的苹果砧木种质中。
12.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
13.1、本发明在山定子中克隆到功能基因mbiaa19，该基因编码区(cds)共573bp。通过qpcr发现mbiaa19在山定子矮化突变体(dwf)根、茎、叶器官中的表达量均显著低于普通山定子(wt)，表明其表达与植株发育有关，并涉及多个器官的发育，将对苹果株形分子育种具有重要意义。
14.2、本发明构建了功能基因mbiaa19的基因沉默载体rnai-mbiaa19，通过农杆菌介导转化gl-3，成功获得mbiaa19基因沉默阳性株系，对阳性再生株系进行表型测定发现，株高和节间长度都显著低于对照组。因此，mbiaa19可用于苹果矮化砧木育种。
附图说明
15.图1为wt与dwf表型对比图；
16.图2为mbiaa19在wt和dwf根、茎、叶不同组织中的表达变化对比图；
17.图3为构建mbiaa19基因rnai载体pri101-an-rnai-mbiaa19的mcs区序列；
18.图4为mbiaa19在rnai-mbiaa19株系中的表达变化对比图；
19.图5为rnai-mbiaa19株系株高和节间变化示意图。
具体实施方式
20.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
21.本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。特别说明除外，本实例所用试剂均为市购。本发明中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
22.1、基因mbiaa19的表达分析
23.本实施例以普通山定子(wt)与其矮化突变体(dwf)为研究对象，如图1所示，dwf的株高、节间长度、叶型和茎细胞面积均与wt表现出显著差异，dwf表现出矮小表型。，采集顶端幼嫩叶片进行转录组学分析，鉴定到在dwf中的下调表达基因mbiaa19。根据引物设计原则，采用primer3在线工具设计实时荧光定量引物，上游引物f1 5
’‑
cagatcttgctctggcgttg-3’，下游引物r1 5
’‑
ttgtgctgcagtccaaatcc-3’，通过qpcr分析发现，mbiaa19在dwf根、茎、叶中的表达量均低于wt(图2)。
24.2、mbiaa19基因克隆
25.根据转录组拼接结果设计克隆引物，上游引物f1 5
’‑
atggccaaagaaggtttaggg-3’，下游引物r1 5
’‑
ttatggctcctcttccattgtt-3’，以wt和dwf的cdna为模版，采用takara primerstar高保真酶进行pcr扩增，参照试剂说明书，反应条件设定为98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，反应结束后，72℃彻底延伸5min。
26.通过琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下观察产物大小，并用手术刀切下目的条带。回收胶块使用dna凝胶回收试剂盒(quick gel extraction，全式金)进行产物纯
化。回收产物检测合格后，连接takara pmd19-t载体，连接条件为4℃过夜。连接产物采用热激法转化至大肠杆菌感受态dh5α(唯地生物)，阳性菌株送至生工生物进行测序。
27.测序结果显示，mbiaa19基因序列在wt和dwf中并没有差异，其核苷酸序列如seq id no.1所示；mbiaa19基因编码的蛋白，命名为mbiaa19蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
28.seq id no.1核酸序列如下：
29.atggccaaagaaggtttagggcttgaaattacagagctgaggttgggatta
30.tgtagtggtccaagtttagtggacaaaaacgagaagaaaagggcgttttc
31.aaagattgacggtggagatggcaggtatagtaccacatctggtgactaccc
32.gaaaaatggtcagacaaagaatgaggttgtggggtggcctccagtgtgtt
33.catacagaatgaagattaatagcttgaatgagacgacaaaaatgtatgtca
34.aagttagcatggatggagcaccttttcttcgtaaaattgacttgagcatgc
35.acaacgagtatgcagatcttgctctggcgttggagaagttatttggttgtta
36.tggcatcggcgaggtgttgaagaatgcagacaactgtgaatttgcacccat
37.ttatgaagacaaagatggagactggatgctagtgggagatgttccttggga
38.gatgtttgttgagtcatgcaagaggttgaggatcatgaagagatcggatgc
39.caagggatttggactgcagcacaaggagggcttccgtaaggcaacaatgg
40.aagaggagccataa
41.seq id no.2氨基酸序列如下：
42.makeglgleitelrlglcsgpslvdknekkrafskidggdgrysttsgdypkngqtknevvgwppvcsyrmkinslnettkmyvkvsmdgapflrkidlsmhneyadlalaleklfgcygigevlknadncefapiyedkdgdwmlvgdvpwemfvesckrlrimkrsdakgfglqhkegfrkatmeeep
43.3、rnai-mbiaa19载体构建
44.首先，以pkannbal载体质粒为模版，结合载体序列和mbiaa19基因序列，设计同源重组克隆引物，f1 5
’‑
gcgaggtgttgaagaatccaattggtaaggaaataattattttct-3’，下游引物r1 5
’‑
cggcgaggtgttgaagaatatcgatttcgaacccagcttc-3’，进行intron片段克隆，方法同上。
45.其次，选取mbiaa19基因序列中长度为380bp特异片段，分别克隆该片段的正向序列和反向互补序列，正向序列引物为f1 5
’‑
gagaacacgggggactctagagc caaagaaggtttagggcttg-3’，r1 5
’‑
tggattcttcaacacctcgccga-3’，反向互补序列引物分别为f1 5
’‑
tattcttcaacacctcgccga-3’，r1 5
’‑
cgatcggggaaattcgagctcgccaaagaaggtttagggcttg-3’，克隆和回收方法同上。
46.将pri101-an载体质粒用限制性内切酶xbai和saci进行双酶切(载体图谱见图3)，酶切条件为37℃，30min。根据说明书提供的方法，使用dna片段纯化试剂盒(minibest dna fragment purification kit，takara)对双酶切载体进行纯化回收。
47.采用同源重组试剂(ultra one step cloning kit，诺唯赞)，将回收产物以mbiaa19正向片段、intron、mbiaa19反向片段的顺序进行串联，与酶切后的pri101-an载体进行同源重组，连接反应条件为50℃，30min，片段与载体的摩尔比为1:1:1:1。
48.采用热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态dh5α(唯地生物)，选择阳性菌落并测序正确的菌株，使用lb液体培养基，180rpm，37℃培养过夜。按照说明书，将菌体收集，使用质粒小提试剂盒(plasmid miniprep kit，全式金)进行质粒提取。
49.4、农杆菌培养与转化
50.从-80℃冰箱中取出农杆菌eh105菌株感受态(唯地生物)冰上融化。将上述重组质粒与感受态混合，转化步骤为冰上孵育5min
→
液氮静置5min
→
37℃水浴5min
→
冰上静置5min。向转化混合物中加入不含抗生素的yep液体培养基，于200rpm、28℃条件下复苏3h。收集菌体，均匀涂布在含有50mg
·
l-1
rifampicin(rif)和50mg
·
l-1
kanamycin(kan)的yep固体培养基，于28℃条件下倒置培养72h。
51.通过菌落pcr手段鉴定阳性重组菌株，并将阳性菌株接种于含有50mg
·
l-1
rif和50mg
·
l-1
kan，在200rpm、28℃条件下过夜扩大培养。
52.将过夜培养的菌液以1:50的比例加入不含有抗生素的yep液体培养基中，200rpm、28℃条件下培养6－8h，直至od
600
＝0.4－0.6。菌液待用于侵染。
53.5、gl-3遗传转化
54.通过离心收集上述重组农杆菌的菌体，使用含有15g
·
l-1
蔗糖和5g
·
l-1
葡萄糖的ms液体培养基重悬置od
600
＝0.5，向重悬菌液中加入乙酰丁香酮(as,100μm)。
55.将gl-3组培苗幼嫩叶片切成边长约为3mm的方块。然后将切好的植物材料置于上述重悬菌液中，轻轻震荡侵染8min。
56.将侵染后的植物材料取出，用无菌滤纸轻轻吸干表面菌液。然后将植物材料叶背面朝下，平铺在ph＝5.2的固体共培养培养基(ms+2.0mg
·
l-1
tdz+0.5mg
·
l-1
naa+25g
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l-1
蔗糖+5g
·
l-1
葡萄糖+0.5g
·
l-1
水解酪蛋白+7g
·
l-1
琼脂)中，并在培养基表面铺一层湿润的无菌滤纸。将培养皿置于黑暗下培养3d。培养室温度为25℃。
57.将上述侵染后的植物材料取出，使用含250mg
·
l-1
cefixime(cef)和250mg
·
l-1
timentin(tim)的液体共培养培养基中(不加琼脂)，用力摇晃致菌落脱落。重复一次操作后，将植物材料置于ph＝5.4的固体推迟选择培养基(ms+2.0mg
·
l-1
tdz+0.5mg
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l-1
naa+30g
·
l-1
蔗糖+7g
·
l-1
琼脂)中，叶背面朝下。将培养皿置于暗室中培养2d。
58.将经过推迟选择培养的植物材料转移至ph＝5.4的增殖培养基(ms+2.0mg
·
l-1
tdz+0.5mg
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l-1
naa+30g
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l-1
蔗糖+7g
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l-1
琼脂+250mg
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l-1
cef+250mg
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l-1
tim+25mg
·
l-1
kan)中，叶背面朝上放置，将培养皿置于培养室培养(光周期，16:8/光：暗)，直至生成不定芽。
59.6、转基因株系分析
60.通过抗性筛选和pcr鉴定，获得五个独立的rnai-mbiaa19阳性株系，编号分别为rnai-mbiaa19-3#，-4#，-6#，-8#，-15#。通过定量分析，五个株系中mbiaa19的表达量均显著低于对照组，如图4所示。五个株系的株高均发生了显著下调，尤其是rnai-mbiaa19-8#和rnai-mbiaa19-15#，基因沉默效果越显著的同时，株高下降越多，与对照相比，株高分别降低了34％和49％，如图5所示。节间长度是评价苹果矮化程度的重要指标，与对照相比，mbiaa19-8#和rnai-mbiaa19-15#节间长度减小比例均约为43％，如图5所示。综合以上结果说明，mbiaa19参与苹果植株的株高调控，对选育优异的苹果矮化砧木具有重要意义。
61.另外，mbiaa19基因资源可以连接任何一种载体，可以使用任何可行的方法进行遗传转化，苹果或其他植物种类都可成为转化受体，在科研活动或生产活动中发挥助力。
mbiaa19在多器官中表达，可以对mbiaa19进行基因修饰，进一步改变其表达量或基因功能，以期获得更丰富的变异资源。
62.最后需要说明的是，上述较为具体实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不能限制上述实施例。应当指出的是，对于相关领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思框架的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19，其特征在于，其核酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述调控苹果株高的功能基因mbiaa19，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19的载体，其特征在于，为含有权利要求1或权利要求2所述功能基因mbiaa19的重组农杆菌。4.根据权利要求3所述调控苹果株高的功能基因mbiaa19的载体，其特征在于，构建功能基因mbiaa19的基因沉默载体rnai-mbiaa19。5.根据权利要求4所述调控苹果株高的功能基因mbiaa19的载体，其特征在于，利用重组质农杆菌侵染gl-3叶片，获得rnai-mbiaa19株系，使其在转基因再生株系中低表达。6.一种调控苹果株高的功能基因mbiaa19的应用，其特征在于，利用权利要求书1或权利要求2所述功能基因mbiaa19，在培育苹果矮化种质方面的应用。7.根据权利要求6所述调控苹果株高的功能基因mbiaa19的应用，其特征在于，将所述功能基因mbiaa19转入所需改良的苹果砧木种质中。

技术总结
本发明公开了一种调控苹果株高的功能基因MbIAA19及应用；其中，功能基因MbIAA19的核酸序列如SEQ ID No.1所示；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。利用MbIAA19对株高的影响，可以通过沉默MbIAA19功能基因的表达创造矮化植株。本发明中功能基因MbIAA19可用于苹果矮化砧木育种。于苹果矮化砧木育种。于苹果矮化砧木育种。


技术研发人员：王键 张枭 侯亚莉 董文轩
受保护的技术使用者：沈阳农业大学
技术研发日：2023.08.28
技术公布日：2023/10/19