一种HLA抗原的制备方法与流程

一种hla抗原的制备方法
技术领域
1.本发明涉及抗原制备技术领域，具体为一种hla抗原的制备方法。


背景技术：

2.人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，hla)，即人类主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)，是免疫系统的重要组成部分，其编码hla分子将抗原肽呈递给t细胞表面受体(tcellreceptor，tcr)，诱导免疫反应，与免疫应答及免疫调节密切相关，也是机体引起快速排斥反应的主要抗原(urosevicanddummer2008)，经典的ⅰ类hla基因包括3个基因位点：hla-a、b、c，编码蛋白以跨膜糖蛋白形式存在于所有有核细胞的表面，参与内源性抗原提呈，经典的hlaii基因包括3个基因位点：hla-dp、dq、dr，通常仅存在于专职抗原呈递细胞，参与外源性抗原的提呈和免疫调节，多数有核细胞被干扰素(ifn)-γ诱导表达；
3.移植受者hla抗体的产生来源于对供者器官(或其他来源，如输血、妊娠等)同种异体hla产生的免疫应答，抗体介导的排斥反应(amr)是影响移植器官长期存活的关键因素，供者特异性抗体(dsa)是amr的病因，而产生dsa的主要原因是供受者之间人类白细胞抗原(hla)的错配，因此hla分型和抗体的检测是目前肾移植临床关注的重点，近年来，实验室hla分型和hla抗体固相检测技术快速进步，为肾移植amr精准医疗创造了有利条件；
4.现有技术缺点(细胞或细胞分泌上清获得)：现有技术大部分都是利用淋巴母细胞系制备hla抗原，淋巴母细胞的特点易结团，影响细胞的繁殖；另外，现有技术的培养方式都是通过平皿获得细胞或者细胞分泌上清，需要用移液器将细胞吹起，转移到无菌离心管中进行离心收集，操作复杂，需要大量人力物力，且在操作过程中损失严重；
5.现有技术缺点(抗原制备)：相关文献报道在原核和真核蛋白表达系统中进行了克隆和表达hlaⅰ类分子的各种尝试，但是由于重组杂二聚体再折叠困难，纯化得率极低，不适用于生产。
6.提出了一种hla抗原的制备方法，以便于解决上述中提出的问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种hla抗原的制备方法，以解决现有技术的缺点。本发明提供hla抗原制备的方法，该制备方法操作简单、优于传统的生产方式，可获得细胞或者细胞分泌上清；本发明提供了135个表达单一型别hla细胞株；本发明提供了一种hla抗原的制备方法，将全长多核苷酸或截短的多核苷酸克隆到质粒载体上，再将质粒载体转染至表达细胞中培养，表达的目标蛋白在细胞膜上或分泌到细胞上清中，经过前处理和蛋白纯化，获得hla抗原；本发明提供了hla抗原在hla特异性抗体检测和免疫多肽检测方面的应用，一方面可用作hla抗体检测试剂盒的原材料，另一方面免疫多肽检测获得的抗原肽可作为肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗的理想靶点。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，一种hla抗原的制备方法，包括如下
方法：
9.hla抗原制备分成预处理、接种细胞、收获细胞上清、收获细胞四个部分，整个操作过程在超净工作台内进行，针对培养筒、储液瓶及瓶盖、pbs设备进行预处理并进行润洗，针对基础培养基、完全培养基处理之后进行接种，从储液瓶取样量测葡萄糖浓度并记录，在进行日常监测之后分别对细胞上清、细胞进行收获；细胞上清及细胞，经过前处理和蛋白纯化，获得hla抗原。
10.优选的，所述hla-a、b、c的抗原制备方法，该方法获得的蛋白结构包括抗原肽、α链和β链，具有结构完整性和抗体特异性，以中国人群hla位点常见位基因分布及频率为标准，选择hla
‑ⅰ
类基因型别135种进行重组蛋白的表达纯化；
11.优选的，所述包括细胞株全长或截短多核苷酸的重组载体或重组细胞，全长多核苷酸或截短的多核苷酸克隆到质粒载体上，将质粒载体转染至表达细胞中培养，表达的目标蛋白在细胞膜上或分泌到细胞上清中，经过前处理和蛋白纯化，获得hla抗原，细胞膜蛋白所用去垢剂包括ca-630。
12.优选的，纯化获得的hla抗原在hla特异性抗体检测和免疫多肽检测方面的应用。
13.优选的，hla抗原可用作hla抗体检测试剂盒的原材料；免疫多肽检测获得的抗原肽可作为肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗的理想靶点。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该一种hla抗原的制备方法，其具体内容如下：
15.1.利用中空纤维反应器进行淋巴细胞培养，在日常操作中淋巴母细胞不易结团，提高了抗原分子的表达量，细胞分泌上清中抗原量是皿中的50倍，且操作简便，单人即可操作；此外，中空纤维反应器不仅可以用于分泌蛋白的表达，也可用于细胞收集，中空纤维本身作为滤器，起到了富集细胞的功能；
16.2.纯化步骤简单，既可以用于膜蛋白的抗原纯化，也可用于分泌型抗原纯化的通用方法，获得抗原纯度高，且纯化获得抗原具有抗体特异性；此外，在进行细胞膜蛋白纯化过程中，通过对去垢剂的筛选，发现新的去垢剂ca-630可用于hla
‑ⅰ
类抗原的纯化，得率高于现有技术。
附图说明
17.图1为本发明中空纤维培养筒外包装图；
18.图2为本发明中空纤维培养筒基本构造图；
19.图3为本发明中空纤维储液瓶盖准备图；
20.图4为本发明中空纤维培养筒与储液瓶管路连接图；
21.图5为本发明中空纤维pbs润洗培养筒图；
22.图6为本发明中空纤维储液瓶更换为基础培养基图；
23.图7为本发明中空纤维基础培养基预处理图；
24.图8为本发明中空纤维接种操作1图；
25.图9为本发明中空纤维接种操作2图；
26.图10为本发明中空纤维接种操作3图；
27.图11为本发明中空纤维低糖收获图；
28.图12为本发明中空纤维高糖收获图；
29.图13为本发明膜蛋白纯化抗原纯化检测结果图；
30.图14为本发明可溶性抗原纯化检测结果图；
31.图15为本发明a0206、b1507与c0401抗原抗体检测结果图；
32.图16为本发明a0206、b1507与c0401抗原抗体检测结果图；
33.图17为本发明抗原偶联荧光编码微球流式检测结果图；
34.图18为本发明a0206总离子流色谱图；
35.图19为本发明b1507总离子流色谱图；
36.图20为本发明c0401总离子流色谱图；
37.图21为本发明中空纤维反应器结构示意图；
38.图22为本发明hla细胞株工业流程图；
39.图23为本发明细胞接种后密度与活率曲线图。
具体实施方式
40.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.本发明提供技术方案：一种hla抗原的制备方法，包括如下步骤，
42.hla-a、b、c的抗原制备方法，该方法获得的蛋白结构包括抗原肽、α链和β链，具有结构完整性和抗体特异性，以中国人群hla位点常见等位基因分布及频率为标准，选择hla
‑ⅰ
类基因型别135种进行重组蛋白的表达纯化；
43.α链氨基酸序列获取，hla基因序列信息来自ipd-imgt/hla(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)，本发明构建了135个表达单一型别hla细胞株。
44.本发明构建表达单一抗原细胞库hla型别表
45.[0046][0047]
表1
[0048]
表达的质粒制备
[0049]
基因合成公司交付的甘油菌按照1：1000接种于含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃180r/min振荡培养过夜，保存甘油菌液，以便后续测序使用，之后采用质粒提取试剂盒将菌液裂解后来提取重组质粒，乙醇沉淀dna，在生物安全柜中自然风干后，用无菌水溶解dna，用nanodrop测定dna浓度。
[0050]
将提取到的质粒取出一部分用ecori和bamhi限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定，在37℃条件下双酶切30min左右，酶切完成后，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，双酶切后的基因片段和plvx-mcmv-zsgreen1-puro双酶切后载体大小都匹配，初步鉴定为质粒重组成功，把双酶切鉴定成功的重组质粒的甘油菌邮寄给测序公司，测定基因是否成功构建到载体上，并且保证插入的基因序列无点突变或错配的现象，该重组质粒的鉴定完成。
[0051]
细胞复苏
[0052]
本发明中用到的细胞系有k562,daudi,raji，p815,hmy2-cir,t2、293t，以k562和293t为例，从液氮罐中取出细胞k562和293t，立即放入37℃水浴槽中快速解冻，待管内尚存有黄豆大小的冰块时转至生物安全柜中，立即加入1mlrpmi1640培养基或1mlrpmidmem培养基分别与冻存管内k562和293t细胞混合，将混合液分别移至含有5mlrpmi1640培养基和rpmidmem培养基的离心管中，1000r/min离心5min后弃上清，收集细胞沉淀，用12mlrpmi1640培养基或rpmidmem培养基重悬细胞沉淀并转移至事先准备好的培养皿中，镜检细胞后，于37℃、5％co2条件培养。
[0053]
细胞传代
[0054]
细胞生长至培养皿的80％时即(细胞密度2
×
10e6)需要传代，以扩大细胞数量及满足后续实验操作。
[0055]
k562细胞传代
[0056]
将培养皿中的k562细胞全部转移到离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用5mlpbs重悬，1000r/min离心5min，弃上清，用rpmi1640培养基重悬，平均分到两个培养皿中。
[0057]
293t细胞传代
[0058]
弃掉培养皿中培养液，用适量pbs清洗一遍，加入1ml胰酶消化，细胞分离后加入3倍胰酶体积的rpmidmem培养基终止胰酶的消化作用。用移液器轻轻吹打细胞，使其从培养
皿底部脱落下来，将细胞全部转移到离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用5mlpbs重悬，1000r/min离心5min，弃上清，用rpmidmem培养基重悬，平均分到两个培养皿中。
[0059]
慢病毒包装与感染
[0060]
细胞铺板：293t细胞接种于培养板中，密度70％，37℃5％co2培养箱过夜。
[0061]
质粒转染：使用opti-mem培养基稀释lipofectamine3000试剂，充分混匀，分装，每份125μl，此溶液为a液；使用opti-mem培养基稀释包装质粒(1125ngpspax2，375ngpmd2.g)，然后添加p3000，充分混匀，分装，每份125μl，此溶液为b液；向b液中加入1500ng目的质粒，混匀后加入a液中，再次混匀后室温静置10min，过夜培养的293t细胞更换500μl新鲜rpmidmem培养基，将静置后的混合溶液缓慢的滴加至细胞中，轻晃混匀，于37℃、5％co2条件培养48h后，观察荧光，当荧光70％以上则收集细胞上清，0.45μm滤膜过滤使用。
[0062]
慢病毒感染k562细胞、293t细胞：细胞接种于24孔板中，接种量为50000个/孔，用opti-mem培养基重悬；每孔中加入700μl慢病毒液，慢病毒颗粒浓度是1
×
10e8个/ml，并补加polybrene至终浓度10μg/ml，加入慢病毒液的细胞于37℃、5％co2条件培养16h后将细胞转移到6孔板中，并补加1ml的rpmi1640培养基，细胞感染后48—72h观察荧光。
[0063]
稳转株筛选与单克隆化
[0064]
细胞感染后72h，且细胞密度大于70％，小于90％时，根据载体抗性选择puromycin1μg/ml药筛48h，药筛结束后，流式细胞仪鉴定稳转株hla分子表达情况。
[0065]
中空纤维系统(fibercellsystems)准备；
[0066]
整个制备方法操作分成：1.预处理；2.接种细胞；3.收获细胞上清；4.收获细胞及上清四个部分，操作过程中必须注意消毒，不要污染培养系统，所有步骤，都在超净工作台内进行；
[0067]
中空纤维细胞培养所需物品
[0068]
[0069][0070]
表2
[0071]
培养筒准备；
[0072]
培养筒为双层袋无菌包装，外层包装袋用于包装运输，内层包装袋经过灭菌，因此内层包装袋一定要在超净工作台内拆开，使整套制备方法保持无菌状态，培养筒分成纤维内管路及纤维外空间，各有2个阀门，左内和右内连通纤维内管路，左外和右外连通纤维；
[0073]
储液瓶及瓶盖准备；
[0074]
储液瓶包含38mm瓶口的瓶身及38mm的两通瓶盖两部分，调整储液瓶盖不锈钢管的位置，确保不锈钢管管口在125ml刻度以下，但不要碰到培养瓶底，拆开培养筒外层袋，取出里面2个储液瓶连接管，将瓶盖连接管分别套上不锈钢管顶端开口，不锈钢管上下两端开口用锡箔纸封住，放入灭菌袋后，连同储液瓶一起灭菌，如使用一次性无菌储液瓶则可只灭瓶盖，待灭菌结束后替换掉一次性无菌储液瓶的瓶盖；
[0075]
pbs准备；
[0076]
准备一瓶250ml的pbs和一个50ml的无菌离心管，将40ml的pbs倒入50ml的离心管中，剩余210ml的pbs倒入储液瓶中；
[0077]
其他物品准备；
[0078]
无菌螺纹口针筒(20ml)2支，酒精棉球一瓶(消毒用)；
[0079]
预处理；
[0080]
将培养筒的两根硅胶软管接上瓶盖连接管：
[0081]
以酒精消毒各接口，稍微反扭管子再接上，避免接合后管线处于扭曲状态，并确保接合紧密，每次接口开关，都需要用酒精棉球擦拭，并稍待其挥发，以确保无菌，确认纤维内管路两阀门开启(纤维外空间阀门关闭)，手动按压单向阀，将pbs从储液瓶中打入纤维内管路，须看到气泡冒出，以确认管路通畅，关闭纤维内管路阀门；
[0082]
pbs润洗；
[0083]
以针筒吸取50ml离心管中的pbs，消毒并打开纤维外空间的两个阀门，将针筒旋上左外开口，慢慢打入pbs直到充满纤维外空间，小心pbs不要从右外开口溢出(打开2个开口是为了保持培养筒内气压平衡，液体才能顺利打入，或者也可在右外阀门旋上一支空针筒)，由于干纤维会吸水，所以需要打入20ml以上的pbs才能充满培养筒，关闭纤维外空间阀门，打开纤维内管路阀门(纤维内管路才能顺利循环)，将培养筒装到双头泵上，流速设定在20(80—90ml/min)，放入培养箱内循环24—48h，(泵在运作的状态时，更容易把培养筒装上去)，循环24—48h后更换为基础培养基；
[0084]
基础培养基预处理；
[0085]
准备200ml基础培养基，2支无菌螺纹口针筒，酒精棉球，20ml基础培养基吸入针筒(之后会打入纤维外空间)，余下的180ml倒入储液瓶，消毒瓶口，将pbs储液瓶置换成含培养基的储液瓶，手动按压单向阀，打入基础培养基，确保管路畅通关闭纤维内管路阀门，开启纤维外空间阀门，用空针筒从左外开口将pbs吸出，接着将针筒内20ml的基础培养基同样由左外开口打入培养筒，小心不要从右外开口溢出(或者也可在右外阀门旋上一支空针筒)，并避免气泡产生，关闭纤维外空间阀门，开启纤维内管路阀门，将培养筒装到双头泵上，流速设定在20，放入培养箱内循环24—48h后更换为完全培养基；
[0086]
完全培养基预处理：
[0087]
液体更换步骤和基础培养基预处理相同，用完全培养基循环24-48h后，将系统中的完全培养基换成新鲜的完全培养基，即可开始接种细胞；
[0088]
接种；
[0089]
接种标准；
[0090]
具体标准参数见附图；
[0091]
接种标准
[0092][0093]
表3
[0094]
接种准备；
[0095]
细胞浓缩液的针筒、1支空针筒、125ml完全培养基、酒精棉球(消毒用)，消毒瓶口，将旧的储液瓶置换成新的储液瓶；
[0096]
接种操作；
[0097]
首先，关闭纤维内管路阀门，消毒开启纤维外空间阀门，在右外开口旋上空针筒，左外开口旋上有细胞浓缩液的针筒，从左外开口打入细胞浓缩液，此时会有部分细胞浓缩液及培养基被液体压力冲入右外的空针筒，左右两端来回冲打，直到两端针筒内的液体浑浊度一致，代表细胞均匀混合；
[0098]
然后，两端针筒各留同量的液体后，先关闭右外阀门，打开右内阀门，并松开储液瓶口让管路内气压平衡，打入左外针筒的液体，此时培养基会从右内管路流向储液瓶，关闭左外阀门，打开右外阀门，同样打入液体使培养基从右内管路流向储液瓶；
[0099]
最后，从储液瓶取样量测葡萄糖浓度并记录，拧紧瓶盖，关闭右外阀门，开启左内阀门，将培养筒往下旋转180度，静置30min后；把培养筒转正，再静置30min(此步骤是为了让细胞均匀贴附在纤维表面)，培养筒放回泵上培养，流速设定在25(培养筒放到泵上之前，需确认外阀门关闭，内阀门开启)；
[0100]
日常监测；
[0101]
每日监测培养基中的葡萄糖消耗量有助于评估细胞在培养筒内的生长状态，直接从储液瓶取样操作，这个阶段细胞会开始增殖到1
×
10e9，甚至1
×
10e10，随着细胞量上升，糖消耗的速度会变快，因此要逐步加大培养基的体积；
[0102]
收获；
[0103]
收获细胞上清(也称低糖收获)；
[0104]
接种的细胞稳定下来之后(7—10天，糖消耗基本稳定，或糖耗达到1g/天)，在培养筒的细胞量未达满载时(即葡萄糖消耗量《1g/天)，可随时收获细胞上清，或者在培养筒的
细胞量为满载时(葡萄糖消耗量》1g/天)，先收获上清，再取出多余的细胞；
[0105]
低糖收获准备；
[0106]
准备1支空针筒、1支含有10—15ml新鲜培养基的针筒，确认关闭纤维内管路阀门，消毒开启纤维外空间阀门；
[0107]
低糖收获操作；
[0108]
在左外开口旋上空针筒，收获10—15ml的细胞上清，再从左外端打入与上一步骤收获同体积的培养基(补充培养基体积，以维持恒定体积)，关闭纤维外空间阀门，开启纤维内管路阀门，培养筒放回泵上培养(请务必确认外空间关闭，纤维内管路开启)；收获细胞上清，用夹心法elisa检测结果如下表：
[0109]
中空纤维细胞上清检测结果
[0110][0111][0112]
表4
[0113]
收获细胞(也称高糖收获)；
[0114]
在培养筒的细胞量达到满载时(即葡萄糖消耗量》1g/天)，需要取出过多的细胞，以腾出空间让细胞继续增殖生长，但操作的同时也会收获部分细胞产物，通过离心去掉细胞后收集；
[0115]
高糖收获准备；
[0116]
准备2支空针筒，旋在纤维外空间阀门上，关闭左内阀门，松开储液瓶口让管路内气压平衡；
[0117]
高糖收获操作；
[0118]
开启左外阀门，吸取5ml溶液，此时液体会从储液瓶通过右内阀门回到纤维外空间，所以液体会穿过纤维上的孔洞，将附着于纤维上的细胞顶离纤维，使更多细胞脱落，达到收获细胞的目的，关闭左外阀门，开启右外阀门，同样吸取5ml溶液，关闭右内阀门及储液瓶口，开启左外阀门，用2个针筒来回冲打3—5次，使更多的细胞从纤维上冲落，把收获溶液集中于左外的针筒后，取下针筒，关闭纤维外空间阀门，开启纤维内管路阀门，培养筒放回泵上培养；
[0119]
蛋白纯化
[0120]
蛋白纯化所需仪器
[0121]
设备名称厂家超速离心机(转子型号：p80at)日立高速冷冻离心机thermo蛋白纯化仪赛谱ph计三信恒温磁力搅拌器大龙电子天平上海精科
[0122]
表5
[0123]
细胞膜蛋白纯化过程：
[0124]
将细胞解冻并重悬于5倍体积/湿重的buffera(含20mmtris，150mmnacl，ph8.0，1
×
蛋白酶抑制剂，1mmdtt)，涡旋混匀。12000g4℃超速离心30min，收集沉淀，该步骤重复两次。将细胞沉淀重悬于同体积的lysisbuffe(buffera添加1-2％ca-630(v/v)、1mmdtt)，涡旋混匀，冰上孵育1-2h。将细胞裂解液150000g4℃超速离心1.5h，收集上清。bufferb(buffera添加0.1％ca-630(v/v)、1mmdtt)平衡nms-sepharose4b、w6/32-sepharose4b抗体亲和层析柱≥5个cv。将上清液依次经过nms-sepharose4b柱、w6/32-sepharose4b柱，上样流速为0.5—1ml/min。用bufferb清洗nms-sepharose4b、w6/32-sepharose4b抗体亲和层析柱≥5个cv，流速为1ml/min。将中和buffer(1mtris-hcl，ph8.0)提前加入收集管中，每管0.5ml，切换柱位阀，使洗脱buffer(0.05mol/l二乙胺，ph11.5)洗脱w6/32-sepharose4b柱上的hla抗原，流速为0.5—1ml/min，收集洗脱峰。在1
×
pbs中4℃过夜透析，透析样品浓缩至＜1ml后经过凝胶过滤层析纯化，流速1ml/min，收集洗脱峰，分别浓缩后取样进行检测sds-page和wb检测，根据检测结果确定目的蛋白的出峰位置，检测目的蛋白浓度，若长期保存，可加入0.05％(w/w)proclin300生物液体防腐剂，-20℃冻存。
[0125]
纯化结果分析：根据sds-page和wb检测目的蛋白，其中hla
‑ⅰ
类抗原重链44kd，轻链12kd，以a0206、b1507、c0401为例，检测结果见附图。
[0126]
可溶性蛋白纯化过程：
[0127]
将nms-sepharose4b、w6/32-sepharose4b抗体亲和层析柱依次连接在蛋白纯化仪上，调节柱位阀，用1xpbs(含1
×
蛋白酶抑制剂，1mmdtt)平衡抗体亲和层析柱≥5个cv。3l细胞上清用0.22μm的滤膜抽滤后上样，流速为0.5—1ml/min，收集流穿。用平衡buffer清洗体亲和层析柱≥5个cv，流速为1ml/min。将中和buffer(1mtris-hcl，ph8.0)提前加入收集管中，每管0.5ml，切换柱位阀，使洗脱buffer(0.05mol/l二乙胺，ph11.5)洗脱w6/32-sepharose4b柱上的hla抗原，流速为0.5—1ml/min，收集洗脱峰。在1
×
pbs中4℃过夜透析，透析样品浓缩至＜1ml后经过凝胶过滤层析纯化，流速1ml/min，收集洗脱峰，分别浓缩后取样进行检测sds-page和wb检测，根据检测结果确定目的蛋白的出峰位置，检测目的蛋白浓度，若长期保存，可加入0.05％(w/w)proclin300生物液体防腐剂，-20℃冻存。
[0128]
纯化结果分析：根据sds-page和wb检测目的蛋白，可溶性hla
‑ⅰ
类抗原重链35kd，轻链12kd，以a0206s为例，检测结果见附图。
[0129]
抗原应用
[0130]
hla特异性抗体检测：将纯化抗原包被在elisa板上或荧光编码微球上，与样本孵育后，通过hrp标记羊抗人igg抗体或pe标记羊抗人igg抗体进行hla特异性抗体检测。
[0131]
缓冲液配制
[0132]
1.包被液：1
×
pbs
[0133]
2.洗液(pbs-t)：pbs含0.2％tween-20。
[0134]
3.封闭液、样本稀释液：100％山羊血清。
[0135]
4.二抗稀释液：5％山羊血清(pbs-t稀释)。
[0136]
实验过程
[0137]
抗原包被：将纯化hla抗原稀释至2ng/ul，4℃包被过夜。
[0138]
封闭：用pbst缓冲液洗板3次，每孔加入200μl封闭液，贴上封板膜后，37℃孵育2h；去除封闭液，洗板3次，甩干待用。
[0139]
加样：将各个样品用样本稀释液稀释10倍，每孔100μl加入，25℃孵育1h，用pbst缓冲液洗板3次；
[0140]
加入抗体：加入100μlhrp标记羊抗人igg抗体(稀释比例1：100000)混匀，25℃孵育45min，用pbst缓冲液洗板5次。
[0141]
显色：取tmb底物，每孔加入100μl，37℃反应20min。
[0142]
终止：每孔加入100μl的终止液终止反应，通过酶标仪检测450处吸光值。
[0143]
结果：选取273例样本，用labscreen
tm
singleantigenclassi试剂盒(onelambda)进行检测，根据检测结果选取a0206型别阳性样本54例(mfi》1000)、a0206型别阴性样本46例(mfi《1000)，b1507型别阳性样本47例(mfi》1000)、b1507型别阴性样本34例(mfi《1000)，c0401型别阳性样本48例(mfi》1000)、c0401型别阴性样44例(mfi《1000)，用前文所述的elisa方法分别进行检测，检测结果见附图，elisa检测结果与labscreen
tm
singleantigenclassi试剂盒(onelambda)检测结果一致性较高，证明了纯化抗原结构完整、具有抗体识别特异性。
[0144]
缓冲液配制
[0145]
1.活化缓冲液配制：用0.1m的磷酸钠缓冲液+0.01％(w/v)20，ph 6.3。
[0146]
2.偶联缓冲液配制：50mm的mes，ph 5.0。
[0147]
3.洗涤缓冲液配制：50mmpbs+0.01％(w/v)20。
[0148]
4.封闭缓冲液配制：50mmpbs+2.5％(w/v)bsa+0.05％(w/v)300实验过程
[0149]
取100ul的微球储液(1mg/ml)，即1
×
10e6个微球，微球磁分离，弃上清，加入0.16mlmes缓冲液重悬。
[0150]
edc用mes缓冲液配制成50mg/ml溶液，sulfo-nhs用mes缓冲液配制成50mg/ml溶液。
[0151]
向微球悬液中依次加入0.02ml的50mg/mlsulfo-nhs溶液和0.02ml的50mg/mledc溶液，混匀，25℃避光混匀反应30min。
[0152]
微球磁分离弃上清，用200ulmes缓冲液清洗2次，微球磁分离，弃上清。
[0153]
加入2.5-5ug抗原，补充mes缓冲液至200ul，混匀，25℃避光混匀反应3h。
[0154]
微球磁分离，弃上清，加入400ul封闭液，25℃避光混匀封闭12-18小时。
[0155]
微球磁分离，弃上清，加入1ml保存液重悬，长期保存放在-80℃，禁止冻融。
[0156]
吸取100ul微球保存液，加入10ul的血清样本，避光震荡孵育30min。
[0157]
微球磁分离，弃上清，pbst缓冲液洗涤3次。
[0158]
加入200ulpe标记的羊抗人igg二抗，振荡混匀孵育30min。
[0159]
微球磁分离，弃上清，pbst缓冲液洗涤3次。
[0160]
用1mlpbs重悬微球，流式上机检测微球的pe荧光强度，检测结果见附图。
[0161]
抗原肽检测
[0162]
纯化抗原可用于免疫多肽检测，检测到的抗原肽可作为肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗的理想靶点，纯化后hla分子包括重链，轻链以及抗原肽，具有完整的构象，将纯化后hla分子与10％乙酸在75℃孵育15min解离hla分子，通过3kda超滤管截留重链与轻链，过滤液即为洗脱抗原肽。将抗原肽滤液冻干，用10％乙酸重新悬浮，即得到待上机样本。
[0163]
样品编号
[0164]
样本名称样本状态a0206溶液b1507溶液c0401溶液
[0165]
表6
[0166]
多肽分离
[0167]
超高效液相色谱条件
[0168]
1.柱温：50℃
[0169]
2.流动相a：2％acn/0.1％tfa；
[0170]
3.流动相b：80％acn/0.1％tfa；
[0171]
4.流速：600nl/min；
[0172]
5.每个组分分析时间：120min；
[0173]
6.液相梯度设置：
[0174]
timeflow(ml/min)b％run0.00.42.010.00.440.018.00.445.020.00.4100.030.00.42.040.00.42.0
[0175]
表7
[0176]
lc-ms/ms检测
[0177]
液相色谱条件
[0178]
1.分析柱：150μmi.d.
×
150mm,packedwithacclaimpepmaprplcc18,3μm,
[0179]
2.流动相a：0.1％甲酸水溶液；
[0180]
3.流动相b：80％acn/0.1％甲酸水溶液；
[0181]
4.流速：600nl/min；
[0182]
5.每个组分分析时间：120min；
[0183]
时间b相04％510％8522％11040％11595％12095％
[0184]
表8
[0185]
质谱条件
[0186]
1.一级质谱参数：resolution：60,000、agctarget：3e6、maximumit：50ms、scanrange：350to1600m/z。
[0187]
2.二级质谱参数：resolution：30,000、agctarget：1e5、maximumit：80ms、topn：20、nce/steppednce：30。
[0188]
数据库检索结果
[0189]
质谱采集的raw文件，经过软件peaksstudio数据库检索，得到鉴定结果如表格所示，下面仅展示样品ao2o6鉴定到得分较高的10条肽段。
[0190][0191][0192]
表9
[0193]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行换
等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种hla抗原的制备方法，其特征在于：hla抗原生产系统分成预处理、接种细胞、收获细胞上清、收获细胞四个部分，整个操作过程在超净工作台内进行，针对培养筒、储液瓶及瓶盖、pbs设备进行预处理并进行润洗，针对基础培养基、完全培养基处理之后进行接种，从储液瓶取样量测葡萄糖浓度并记录，在进行日常监测之后分别对细胞上清、细胞进行收获；细胞上清及细胞，经过前处理和蛋白纯化，获得hla抗原。2.根据权利要求1所述的一种hla抗原的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：s1：中空纤维系统准备；整个系统操作分成：1.预处理；2.接种细胞；3.收获细胞上清；4.收获细胞及上清四个部分，操作过程中必须注意消毒，不要污染培养系统，所有步骤，都在超净工作台内进行；s1.1：培养筒准备；培养筒为双层袋无菌包装，外层包装袋用于包装运输，内层包装袋经过灭菌，因此内层包装袋一定要在超净工作台内拆开，使整套系统保持无菌状态，培养筒分成纤维内管路及纤维外空间，各有2个阀门，左内和右内连通纤维内管路，左外和右外连通纤维；s1.2：储液瓶及瓶盖准备；储液瓶包含38mm瓶口的瓶身及38mm的两通瓶盖两部分，调整储液瓶盖不锈钢管的位置，确保不锈钢管管口在125ml刻度以下，但不要碰到培养瓶底，拆开培养筒外层袋，取出里面2个储液瓶连接管，将瓶盖连接管分别套上不锈钢管顶端开口，不锈钢管上下两端开口用锡箔纸封住，放入灭菌袋后，连同储液瓶一起灭菌，如使用一次性无菌储液瓶则可只灭瓶盖，待灭菌结束后替换掉一次性无菌储液瓶的瓶盖；s1.3：pbs准备；准备一瓶250ml的pbs和一个50ml的无菌离心管，将40ml的pbs倒入50ml的离心管中，剩余210ml的pbs倒入储液瓶中；s1.4：物品准备；无菌螺纹口针筒2支，酒精棉球一瓶；s2：预处理；s2.1：将培养筒的两根硅胶软管接上瓶盖连接管：以酒精消毒各接口，稍微反扭管子再接上，避免接合后管线处于扭曲状态，并确保接合紧密，每次接口开关，都需要用酒精棉球擦拭，并稍待其挥发，以确保无菌，确认纤维内管路两阀门开启，手动按压单向阀，将pbs从储液瓶中打入纤维内管路，须看到气泡冒出，以确认管路通畅，关闭纤维内管路阀门；s2.2：pbs润洗；以针筒吸取50ml离心管中的pbs，消毒并打开纤维外空间的两个阀门，将针筒旋上左外开口，慢慢打入pbs直到充满纤维外空间，小心pbs不要从右外开口溢出，由于干纤维会吸水，所以需要打入多余20ml的pbs才能充满培养筒，关闭纤维外空间阀门，打开纤维内管路阀门，将培养筒装到双头泵上，流速设定在20，放入培养箱内循环24—48h，循环24—48h后更换为基础培养基；s2.3：基础培养基预处理；准备200ml基础培养基，2支无菌螺纹口针筒，酒精棉球，20ml基础培养基吸入针筒，余下的180ml倒入储液瓶，消毒瓶口，将pbs储液瓶置换成含培养基的储液瓶，手动按压单向
阀，打入基础培养基，确保管路畅通关闭纤维内管路阀门，开启纤维外空间阀门，用空针筒从左外开口将pbs吸出，接着将针筒内20ml的基础培养基同样由左外开口打入培养筒，小心不要从右外开口溢出，并避免气泡产生，关闭纤维外空间阀门，开启纤维内管路阀门，将培养筒装到双头泵上，流速设定在20，放入培养箱内循环24—48h后更换为完全培养基；s2.4：完全培养基预处理：液体更换步骤和基础培养基预处理相同，用完全培养基循环24-48h后，将系统中的完全培养基换成新鲜的完全培养基，即可开始接种细胞；s3：接种；s3.1：接种标准；s3.2：接种准备；细胞浓缩液的针筒、1支空针筒、125ml完全培养基、酒精棉球，消毒瓶口，将旧的储液瓶置换成新的储液瓶；s3.3：接种操作；首先，关闭纤维内管路阀门，消毒开启纤维外空间阀门，在右外开口旋上空针筒，左外开口旋上有细胞浓缩液的针筒，从左外开口打入细胞浓缩液，此时会有部分细胞浓缩液及培养基被液体压力冲入右外的空针筒，左右两端来回冲打，直到两端针筒内的液体浑浊度一致，代表细胞均匀混合；然后，两端针筒各留同量的液体后，先关闭右外阀门，打开右内阀门，并松开储液瓶口让管路内气压平衡，打入左外针筒的液体，此时培养基会从右内管路流向储液瓶，关闭左外阀门，打开右外阀门，同样打入液体使培养基从右内管路流向储液瓶；最后，从储液瓶取样量测葡萄糖浓度并记录，拧紧瓶盖，关闭右外阀门，开启左内阀门，将培养筒往下旋转180度，静置30min后；把培养筒转正，再静置30min，培养筒放回泵上培养，流速设定在25；s3.4：日常监测；每日监测培养基中的葡萄糖消耗量有助于评估细胞在培养筒内的生长状态，直接从储液瓶取样操作，这个阶段细胞会开始增殖到1
×
10e9，甚至1
×
10e10，随着细胞量上升，糖消耗的速度会变快，因此要逐步加大培养基的体积；s4：收获；s4.1：收获细胞上清；接种的细胞稳定下来之后，在培养筒的细胞量未达满载时，可随时收获细胞上清，或者在培养筒的细胞量为满载时，先收获上清，再取出多余的细胞；s4.2：低糖收获准备；准备1支空针筒、1支含有10—15ml新鲜培养基的针筒，确认关闭纤维内管路阀门，消毒开启纤维外空间阀门；s4.3：低糖收获操作；在左外开口旋上空针筒，收获10—15ml的细胞上清，再从左外端打入与上一步骤收获同体积的培养基，关闭纤维外空间阀门，开启纤维内管路阀门，培养筒放回泵上培养；s4.4：收获细胞；在培养筒的细胞量达到满载时，需要取出过多的细胞，以腾出空间让细胞继续增殖生
长，但操作的同时也会收获部分细胞产物，离心去掉细胞后收集；s4.5：高糖收获准备；准备2支空针筒，旋在纤维外空间阀门上，关闭左内阀门，松开储液瓶口让管路内气压平衡；s4.6：高糖收获操作；开启左外阀门，吸取5ml溶液，此时液体会从储液瓶通过右内阀门回到纤维外空间，所以液体会穿过纤维上的孔洞，将附着于纤维上的细胞顶离纤维，使更多细胞脱落，达到收获细胞的目的，关闭左外阀门，开启右外阀门，同样吸取5ml溶液，关闭右内阀门及储液瓶口，开启左外阀门，用2个针筒来回冲打3—5次，使更多的细胞从纤维上冲落，把收获溶液集中于左外的针筒后，取下针筒，关闭纤维外空间阀门，开启纤维内管路阀门，培养筒放回泵上培养。3.根据权利要求2所述的一种hla抗原的制备方法，其特征在于：获得的蛋白结构包括抗原肽、α链和β链，具有结构完整性和抗体特异性；以中国人群hla位点常见位基因分布及频率为标准，选择hla
‑ⅰ
类基因型别135种进行重组蛋白的表达纯化。4.根据权利要求3所述的一种hla抗原的制备方法，其特征在于：全长或截短多核苷酸的重组载体或重组细胞，且全长或截短多核苷酸克隆到质粒载体上，将质粒载体转染至表达细胞中培养，表达的目标蛋白在细胞膜上或分泌到细胞上清中，经过前处理和蛋白纯化，获得hla抗原，细胞膜蛋白所用去垢剂包括5.根据权利要求4所述的一种hla抗原的制备方法，其特征在于：纯化获得的hla抗原在hla特异性抗体检测和免疫多肽检测方面的应用。6.根据权利要求5所述的一种hla抗原的制备方法，其特征在于：hla抗原可用作hla抗体检测试剂的原材料；免疫多肽检测获得的抗原肽可作为肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗的理想靶点。

技术总结
本发明公开了一种HLA抗原的制备方法，属于抗原制备领域，中空纤维系统操作过程在超净工作台内进行，针对培养筒、储液瓶及瓶盖、PBS等设备进行预处理并进行润洗，针对基础培养基、完全培养基处理之后进行接种，从储液瓶取样量测葡萄糖浓度并记录，在进行日常监测之后分别对细胞上清、细胞进行收获；将收获细胞上清及细胞经过前处理和蛋白纯化，获得HLA抗原。该HLA抗原的制备方法简单，既用于膜蛋白的抗原纯化，也可用于可溶性抗原纯化的通用方法，获得抗原纯度高，且纯化获得抗原具有抗体特异性；此外，在进行细胞膜蛋白纯化过程中，通过对去垢剂的筛选，发现一种新的去垢剂可用于HLA


技术研发人员：郑仲征 杜可明 丁真真 何海汛 袁志阳
受保护的技术使用者：深圳荻硕贝肯精准医学有限公司
技术研发日：2023.08.29
技术公布日：2023/10/19